大鼠脊髓压迫性损伤解压后pEGFR的表达变化

目的　探讨大鼠脊髓压迫性损伤（compressed spinal cord injury,CSCI）解压后表皮生长因子受体（phosphorylated epidermal growth factor receptor,pEGFR）、pAkt1的表达变化及其与神经功能、有髓神经纤维数量变化的相关性,为CSCI解压后治疗策略的制定和药物的研发提供实验基础。 方法　采用自行设计的方法制作SD大鼠CSCI模型,造模成功后解压。运用BBB（Basso Beattie Bresnahan）评分观察动物解压后神经功能的恢复情况;通过Luxol fast blue（LFB）染色检测解压后1、7、14、21 d有髓神经纤维数量变化;运用免疫荧光双标（Double-labeling immunoflurescence）、免疫印迹（western blotting,WB）检测pEGFR、 pAkt1的表达变化。 结果　CSCI解压后,BBB评分和有髓神经纤维数量随时间延长而逐渐增加;与此同时,pEGFR、pAkt1表达亦上调且与BBB评分、有髓神经纤维数量增加趋势一致。 结论　CSCI解压后,神经功能有一定改善、有髓神经纤维数量有一定增加,这些变化与pEGFR表达上调有关,提示EGFR的活化参与了CSCI解压后的内源性修复。     

减压对大鼠脊髓压迫性损伤后脱髓鞘病变和BDNF表达的影响

目的观察脑源性神经生长因子(BDNF)对脊髓压迫性损伤(CSCI)后有髓神经纤维脱髓鞘病变的影响,为阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变修复提供实验基础。方法将大鼠均分成4组:正常组、假手术组、压迫组和减压组。用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。压迫组作脊髓压迫12 h,减压组作脊髓压迫1 h,假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。用锇酸染色观察CSCI后1、3和7 d有髓神经纤维变化情况;Western blot和免疫荧光双标检测BDNF和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果压迫组和减压组都出现脱髓鞘病变,并随着时间的延长,髓鞘逐渐水肿、变性、MBP崩解。BDNF表达量在CSCI后随时间延长也逐渐降低(P0.05),但与压迫组相比较,减压组脱髓鞘病变较轻且MBP和BDNF降低幅度小而缓慢(P0.05)。结论 CSCI后尽早减压可减轻脱髓鞘的发生,且可能与BDNF的表达有关。     

抗LINGO-1干预促髓鞘重塑在认知损伤中的应用可能

LINGO-1选择性表达于中枢神经系统(central nervous system,CNS)的少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和神经元,在髓鞘损伤性疾病和动物模型中表达升高,通过活化RhoA和抑制Akt磷酸化负性调节少突胶质细胞分化和髓鞘化、神经元存活和轴突再生。抑制LINGO-1功能可有效改善脱髓鞘损伤,维持神经元成活。髓鞘与认知功能关系密切,大量证据表明其损伤可能引起认知功能异常,本综述拟总结抗LINGO-1促髓鞘重塑研究进展并探讨其在认知损伤中应用的可能。     

小鼠胸段脊髓背横切后Lingo-1的表达变化

目的 观察Lingo-1在小鼠脊髓背侧切割伤后不同时间窗的动态表达变化.方法 采用LISA脊髓损伤仪制作小鼠第9胸髓背侧切割伤模型(深度1.1 mm),运用Real time RT-PCR和Western blot观察Lingo-l mRNA和蛋白在术后1、3、7、14、28 d的表达变化.结果 Lingo-1 mRNA和蛋白的表达在小鼠脊髓背侧切割伤后1d即显著上调,7d时达高峰,并持续上调表达至术后2～4周.结论 Lingo-1在脊髓切割伤后表达上调,揭示其与脊髓损伤后轴突变性有关;对于治疗脊髓损伤促进轴突再生,Lingo-1拮抗剂应在损伤早期即开始并持续使用.     

肢体缺血后处理对大鼠慢性脑缺血后脑内LINGO-1的表达及神经功能的变化

目的:观察大鼠肢体缺血后处理后脑内LINGO-1表达的变化,研究肢体缺血后处理改善慢性脑缺血后神经损伤的分子机制。方法:采用50%三氯化铁处理双侧颈总动脉的方法建立慢性脑缺血模型,随机将大鼠分为假手术组、模型组和肢体缺血后处理组。大鼠肢体缺血后处理3周后采用三等分Y型电迷宫方法观察各组大鼠的学习记忆能力,RT-qPCR检测LINGO-1的mRNA,Western blot法测定LINGO-1的蛋白水平。结果:与模型组相比,肢体缺血后处理组大鼠学习记忆能力显著增加(P0.05)。假手术组大鼠LINGO-1的mRNA及蛋白水平有少量阳性表达。肢体缺血后处理组大鼠LINGO-1的mRNA及蛋白水平均显著下降(P0.05)。结论:慢性脑缺血大鼠脑内LINGO-1水平明显上调,肢体缺血后处理可明显降低LINGO-1的表达水平,并提高学习记忆能力,这可能是肢体缺血后处理改善慢性脑缺血神经功能的分子机制之一。     

BDNF在大鼠脊髓压迫性损伤脱髓鞘病变中的作用

目的　观察脊髓压迫性损伤后脑源性神经生长因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的表达变化与有髓神经纤维脱髓鞘病变之间的关系,以阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变的作用。 方法　SD雄性大鼠60只,将其均分成3 组：模型组、假手术组和正常组,用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。模型组作脊髓压迫24 h, 假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。锇酸和LFB(luxol fast blue) 染色观察有髓神经纤维变化情况; Western blot检测髓鞘碱性蛋白( myelin basic protein,MBP)和BDNF的表达。 结果　24 h后,与假手术组比较,模型组压迫前段(T11)有髓神经纤维无明显肿胀和数量变化,MBP表达未见变化（P>0.05）,但BDNF的表达量升高(P<0.05);而压迫段（T12）和压迫后段（L1）有髓神经纤维肿胀并伴有数量降低(P<0.05), BDNF和MBP的表达量也随之下降(P<0.05),且压迫段（T12）脱髓鞘病变更为严重,BDNF降低也更为明显(P<0.01)。 结论　大鼠脊髓压迫性损伤BDNF表达减少可导致脊髓脱髓鞘病变的发生,而BDNF表达量升高可能对脊髓脱髓鞘病变具有保护作用。     

PD1基因敲除加重小鼠脊髓损伤后继发性损伤的研究

目的:探索程序性死亡分子1(PD1)敲除对小鼠脊髓损伤后巨噬/小胶质细胞极化、血管生成、神经元存活、空洞形成及运动功能恢复的效应,阐明PD1在脊髓继发性损伤中的作用,为进一步研发干预措施奠定基础。方法:采用PD1基因敲除小鼠,制备脊髓挫伤模型;免疫荧光化学染色研究巨噬/小胶质细胞极化、血管生成、神经元存活及空洞形成;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time RT-PCR)和免疫印迹实验(Western Blot)研究炎症因子、血管生长因子的表达变化; Basso小鼠运动功能评分(BMS)评估小鼠的运动功能。结果:与野生型(WT)小鼠相比,PD1敲除小鼠脊髓损伤区M1型巨噬小胶质细胞相关分子诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、白细胞分化抗原86(CD86)、白介素-1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TFN-α)的表达水平显著上调,M2型相关分子精氨酸酶1(Arg1)、白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)和转化生长因子-β(TGF-β)显著下调;损伤中心两侧1 mm内血管密度显著下降,血管内皮生长因子(VEGF)表达水平显著下调,空洞面积显著增加,空洞周围存活神经元数量显著减少。BMS评分显示PD1敲除小鼠的自发运动功能恢复显著差于WT小鼠。结论:PD1敲除加重小鼠脊髓挫伤后的继发性损伤,增强PD1信号可能有助于促进脊髓损伤后的运动功能恢复。     

大鼠脊髓半切损伤后细胞周期蛋白激酶1的表达增强北大核心CSCD

细胞周期是受到严格调控,有大量的细胞分子事件参与才能保证细胞完成DNA复制和细胞分裂。     

急性脊髓挫伤后内皮素-1 mRNA表达变化

目的：观察脊髓损伤（SCI）后内皮素-1（ET-1）mRNA表达的解剖和空间以及含量变化规律。方法：改良Allen's法（50 g-cm）制备急性大鼠脊髓挫伤模型。原位杂交检测SCI前后脊髓组织中ET-1 mRNA。图像分析半定量测定伤区邻近段ET-1 mRNA含量。结果：SCI后损伤邻近段脊髓组织中ET-1 mRNA阳性表达的神经元、胶质细胞与血管内皮细胞数量多于及信号强于对照组，以神经元表达改变为主。除48 h组，伤后各时点脊髓灰质ET-1 mRNA阳性染色的阳性单位与对照组比较差异显著（P<0.05）。伤区脊髓中ET-1 mRNA阳性染色神经元随时间逐渐减少，而胶质细胞阳性表达增加。结论：SCI后脊髓组织中ET-1 mRNA表达上调，提示ET-1参与SCI后病理生理改变。神经元是SCI后脊髓组织中ET-1升高的主要来源。     

Shh/Gli1信号参与小鼠脊髓损伤后血-脊髓屏障渗透性改变及运动功能恢复

目的:探讨sonic hedgehog/Gli1(Shh/Gli1)信号在小鼠脊髓损伤后病理变化及运动功能恢复中的作用。方法:成年雄性C57野生型、Gli1lz和Gli1lz/lz小鼠行T8节段脊髓夹伤及假手术。Gli1lz小鼠脊髓损伤及假手术后3 d行X-gal染色;7 d行Shh/PDGFr-α、Shh/GFAP、LacZ/GFAP染色,观察Shh/Gli1信号在小鼠脊髓损伤后的激活。C57野生型和Gli1lz/lz小鼠脊髓夹伤后7 d行GFAP染色和实时定量RT-PCR,观察星形胶质细胞反应;术后14 d尾静脉注射伊文氏兰观察血-脊髓屏障改变;术后1、3、5 d和7 d行BMS评分评价小鼠后肢运动功能。结果:脊髓损伤7 d后,损伤区Shh表达升高;Shh/Gli1信号报告基因LacZ表达升高,主要表达于反应性星形胶质细胞;免疫组织化学及实时定量RT-PCR结果显示Gli1基因敲除不影响脊髓损伤后GFAP表达;伊文氏兰染色及其定量分析显示Gli1lz/lz小鼠脊髓损伤后脊髓组织伊文氏兰外渗增加。BMS评分显示Gli1lz/lz小鼠运动功能恢复显著差于野生型小鼠。结论:Shh/Gli1信号在小鼠脊髓损伤后激活,可能参与脊髓损伤后血-脊髓屏障渗透性的改变,并影响脊髓损伤后的运动功能恢复。     

Neurogenin1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化

目的:研究neurogenin 1 (Ngn1)转录因子在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内的表达变化,探讨其在ALS转基因鼠发病中的作用.方法:选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各18只,分别于95、108 d和122 d取材,部分鼠经4％多聚甲醛心灌注固定,分离脊髓、制备冷冻切片;部分鼠分离脊髓、提取蛋白和RNA,分别应用免疫荧光显色、免疫印迹和RT-PCR检测Ngnl蛋白及mRNA在ALS转基因鼠发病中的变化.结果:与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Ngnl mRNA和蛋白表达在95、108 d和122 d均降低.免疫荧光实验结果显示,Ngnl阳性细胞主要分布在脊髓灰质前角,与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Ngnl阳性细胞光密度值明显减小.结论:在ALS转基因鼠发病脊髓中Ngnl阳性细胞光密度值明显减少,mRNA和蛋白表达降低,表明Ngnl与ALS的发生密切相关.     

Neuropsin promotes oligodendrocyte death, demyelination and axonal degeneration after spinal cord injury

Previous studies indicated that the expression of neuropsin, a serine protease, is induced in mature oligodendrocytes after injury to the CNS. The pathophysiology of spinal cord injury (SCI) involves primary and secondary mechanisms, the latter contributing further to permanent losses of function. To explore the role of neuropsin after SCI, histochemical and behavioral analyses were performed in wild-type (WT) and neuropsin-deficient (neuropsin(-/-)) mice using a crush injury model, a well-characterized and consistently reproducible model of SCI. In situ hybridization revealed that neuropsin mRNA expression was induced in the spinal cord white matter from WT mice after crush SCI, peaking at day 4. Neuropsin(-/-) mice showed attenuated demyelination, oligodendrocyte death, and axonal damage after SCI. Although axonal degeneration in the corticospinal tract was obvious caudal to the lesion site in both strains of mice after SCI, the number of surviving nerve fibers caudal to the lesion was significantly larger in neuropsin(-/-) mice than WT mice. Behavioral analysis revealed that the recovery at days 10-42 was significantly improved in neuropsin(-/-) mice compared with WT mice in spite of the severe initial hindlimb impairments due to SCI in both strains. These observations suggest that neuropsin is involved in the secondary phase of the pathogenesis of SCI mediated by demyelination, oligodendrocyte death, and axonal degeneration.     

RhoA和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中的表达

目的:通过研究Rho A和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓内的表达变化以阐明Rho/ROCK信号通路在肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中的作用。方法:饲养SOD1-G93A转基因小鼠和同窝野生型小鼠至发病早期、中期和晚期,部分小鼠冰上剥离新鲜脊髓组织,利用RT-PCR方法检测Rho A和ROCK2 mRNA的表达,利用Western Blot方法检测Rho A和ROCK2蛋白的表达;部分小鼠行心脏灌注并剥离其脊髓组织制成冰冻切片,利用免疫组织化学染色方法检测Rho A和ROCK2蛋白的表达。结果:在SOD1-G93A鼠发病的早期、中期和晚期,转基因小鼠脊髓中Rho A和ROCK2的mRNA及蛋白表达均上调。免疫组织化学染色实验结果显示,野生型小鼠脊髓中Rho A和ROCK2弥散分布于胞质和突起中,阳性染色浅,SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中Rho A和ROCK2阳性染色深,大量聚集在细胞膜及细胞质。结论:Rho A和ROCK2在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓中异常高水平表达与ALS脊髓区病变密切相关,可能参与ALS疾病进程。     

脊髓压迫性损伤大鼠海马和脊髓内BDNF的表达变化

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)在脊髓压迫性损伤后的表达变化及作用。方法用自行设计的方法制作脊髓压迫模型,免疫荧光检测BDNF在星形胶质细胞、神经元和上下行轴突的表达;WB检测BDNF在大鼠海马及脊髓的表达。结果随着时间延长,受损部位的BDNF+-GFAP荧光强度逐渐增强;BDNF+-Tuj1荧光强度逐渐减弱;受损部位相邻上下段的BDNF+-NF200比受损部位的明显增强。海马和脊髓受损中心相邻的上、下段的BDNF蛋白表达在损伤后1d达到峰值,然后逐渐下降(P0.05);而脊髓受损中心的BDNF蛋白表达逐渐下降(P0.05)。结论脊髓损伤后,BDNF的表达下调,随伤后时间呈一定规律变化,是引起受损部位神经元表达下降的原因之一。     

Characterization of nestin expression in the spinal cord of GFP transgenic mice after peripheral nerve injury

Many studies have shown that activation and increase in the number of astrocytes and microglia in the spinal cord participate in the initiation and maintenance of neuropathic pain, but little attention has been paid to the responses of neural progenitor cells to peripheral nerve injury. Nestin, a class VI intermediate filament protein, is expressed both in neuronal and glial progenitors as well as in their common precursors; and nestin-positive cells appear in the brain and spinal cord following various forms of damage to these regions. To clarify the responses of neural progenitor cells to nerve injury, we applied L5 spinal nerve transection (L5-SNT) to nestin-promoter GFP (pNestin-GFP) transgenic mice to narrow the target to them. While pNestin-GFP expression was strongly retained in the ependyma lining the central canal of the transgenic spinal cord even in adulthood, it was markedly reduced in the dorsal horn during postnatal development by day 7. Increases in pNestin-GFP expression and labeling by the proliferation marker 5-bromodeoxyuridine were broadly found in the dorsal horn of adult mice on day 3 after L5-SNT. On the other hand, the activation and increase in number of microglia and astrocytes are restricted to the superficial layer of the dorsal horn, the central terminal of injured primary afferent fibers. Purinergic P2X agonist α, β-MeATP increased [Ca²⁺]i in nestin-positive cells in the superficial layer ipsilateral to nerve injury and P2 receptor antagonists suramin and pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2,4-disulphonic acid (PPADS) blocked the expression and elongation of pNestin-GFP fibers in the slice culture of the spinal cord. These results with pNestin-GFP transgenic mice demonstrate that nestin-positive cells proliferate in the dorsal horn in response to peripheral nerve injury and suggest that ATP may contribute to the expression of nestin and activation of neural progenitor cells after nerve injury.