1型糖尿病患儿CD4~+T细胞亚群变化初探

目的 探讨CD4~+细胞亚群[Th1、Th2、CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞(Tr)及Th17细胞]在1型糖尿病(TIDM)患儿免疫发病机制中的作用.方法 新诊断TIDM患儿20例,同年龄对照组(Ctrl组)20例.用流式细胞术检测外周血Th1、Th2、Tr及Th17细胞比例.荧光定量PCR(real-time PCR)检测Th1、Th2、Tr、Th17细胞转录因子T-bet、GATA-3、Foxp3、ROR-γt、IFN-、IL-4、IL-10、IL-17A、CTLA-4、GITR等细胞因子和负性调节因子mRNA表达;应用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-6血浆水平.结果 (1)与正常对照组相比,TIDM患儿Th1细胞比例明显增高(P<0.01),Th2细胞比例明显降低(P<0.01),Tr和Th17细胞比例与正常对照组相比无明显差别(P>0.05).(2)Th1细胞转录因子及细胞因子T-bet、IFN-γ较正常对照组明显升高(P<0.01);Th2细胞转录因子及细胞因子GATA-3、IL-4明显降低(P<0.01);Tr细胞转录因子Foxp3表达与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),Tr细胞相关细胞因子及负性调节因子IL-10、CTLA-4及GITR基因表达明显低于对照组(P<0.01);Th17细胞转录因子ROR-γt及细胞因子IL-17A基因表达与对照组相比无明显差异(P>0.05);(3)TIDM患儿外周血IFN-γ浓度明显增高,IL-4明显降低,TGF-β、IL-6浓度无明显改变(P>0.05).结论 TIDM患儿Th1/Th2失衡,加上Tr细胞抑制功能缺陷,可能导致TIDM严重细胞免疫功能紊乱.     

血浆sIL-2R对急性期川崎病调节性T 细胞的影响

目的探讨sIL-2R血浓度对急性期川崎病（ KD）患儿调节性T细胞（ Treg）的影响。方法急性期KD患儿33例,正常同龄对照儿童14例。流式细胞术检测外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞的比例和CD4＋CD25＋T细胞磷酸化STAT5（pSTAT5）蛋白平均荧光强度（MFI）;流式微球阵列术（CBA）检测血浆sIL-2R、IL-2、IL-7、IL-15的浓度;荧光定量PCR（real-time PCR）检测CD4＋CD25＋T细胞Foxp3、GITR、CTLA-4、IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ和CD 4＋CD25-T 细胞 IL-17A、RoR-γt 等基因mRNA表达。结果（1）急性期KD患儿CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞比例及相关分子Foxp3、GITR、CTLA-4 mRNA表达明显低于同龄对照组（P＜0．05）,Th17细胞相关因子IL-17A、ROR-γt mRNA表达明显增高（P＜0．05）,IVIG治疗后呈不同程度的恢复（P＜0．05）。（2）急性期KD患儿CD4＋CD25＋T细胞pSTAT5蛋白水平显著下调（P＜0．05）,IVIG治疗后明显上调（P＜0．05）。（3）急性期KD患儿血浆sIL-2R浓度显著增高（P＜0．05）,IVIG治疗后下降（P＜0．05）;其中KD合并冠脉损伤组（KD-CAL＋）明显高于无冠脉损伤组（KD-CAL-）（P＜0．05）;IL-2、IL-7、IL1-5浓度无明显改变（P＞0．05）。（4）急性期KD患儿CD4＋CD25＋T细胞IL-2Rα、IL-2Rβ基因mRNA表达明显低于同龄对照组（P＜0．05）,IVIG治疗后呈不同程度的升高（ P＜0．05）;IL-2Rγ基因mRNA表达无明显改变;sIL-2R血浓度与IL-2RβmRNA、pSTAT5及Foxp3 mRNA表达呈负相关（ P＜0．05）;pSTAT5与Foxp3 mRNA表达呈正相关（ P＜0．05）。结论血浆sIL-2R明显增高可致IL-2/STAT5信号途径传导异常,这可能是导致急性期KD Treg细胞下调的因素之一。     

急性期川崎病Foxp3基因甲基化改变及意义初探

目的 探讨急性期川崎病(KD)Foxp3基因甲基化状态及其在KD免疫发病机制中的作用.方法 急性期KD患儿30例,正常同年龄对照组18例,KD患儿分别于静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗前后直接取血备检.甲基化特异性定量PCR(MSQP)检测CD4+T细胞Foxp3基因启动子、调节性T细胞(Tr)特异性甲基化区(TSDR)CpG岛甲基化状态;流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Tr的比例;荧光定量PCR检测CD4+T细胞Foxp3、CTLA4、GITR、LAG3、CCR8、UBD、LGALS3等基因mRNA表达.结果 (1)急性期KD患儿CD4+T细胞Foxp3基因启动子CpG岛非甲基化水平明显低于同年龄对照组(P＜0.01),经IVIG治疗后明显升高(P＜0.01);TSDR区CpG岛非甲基化水平各组间差异无统计学意义(P＞0.05);(2)急性期KD患儿CD4+CD25+Foxp3+Tr细胞比例及CD4+T细胞Foxp3 mRNA表达水平明显低于正常对照组(P＜0.01),且与Foxp3基因启动子CpG岛非甲基化水平呈正相关(CD4+CD25+Foxp3+Tr:r=0.76,P＜0.01;Foxp3:r=0.89,P＜0.01),IVIG治疗后显著上升(P＜0.01);(3)急性期KD患儿CD4+CD25+Foxp3+Tr细胞相关因子CTLA4、GITR、LAG3和CCR8等基因mRNA水平显著降低(P＜0.01),IVIG治疗后均有不同程度的恢复(P＜0.01);Foxp3依赖性分子UBD和LGALS3表达水平亦低于正常对照组(P＜0.01),IVIG治疗后基本恢复至正常水平(P＜0.01).结论 急性期KD患儿Foxp3基因启动子非甲基化水平低下可能与KD免疫调节功能紊乱有关.     

CD4+CD25+调节性T细胞在川崎病免疫发病机制中的作用

目的探讨CD4 CD25 调节性T细胞在川崎病(KD)免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿25例,正常同年龄对照组25例,KD患儿分别于静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗前后直接取血备检,未加任何体外丝裂原刺激培养。采用流式细胞术分别检测外周血CD4 CD25 调节性T细胞比例及CD14 细胞表面共刺激分子的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR检测外周血CD4 T细胞中Foxp3、CTLA-4和GITR基因mRNA的表达。结果急性期KD患儿外周血CD4 CD25 调节性T细胞比例明显低于同年龄对照组(P<0.01),IVIG治疗后显著上升(P<0.01);急性期KD患儿外周血CD4 T细胞中Foxp3、CTLA-4和GITR基因mRNA表达水平均明显低于正常对照组(P<0.01),IVIG治疗后均有不同程度的恢复(P<0.01);急性期KD患儿CD14 细胞明显过度表达CD80及CD86等共刺激分子(P<0.01),IVIG治疗后CD80及CD86表达均显著下降。结论急性期KD患儿CD4 CD25 调节性T细胞数量减少可能与KD免疫调节功能紊乱有关。     

不同类型HBV感染者外周血Treg/Th17细胞的变化及意义

目的:探讨不同类型HBV感染者外周血中CD4+ Foxp3+ Treg/Th17细胞的变化及意义.方法:选取15例急性乙型肝炎(Acute Hepatitis B,AHB)患者、40例慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者、40例无症状携带者(Asymptomatic HBV carriers,AsC)及30例健康对照者,分别采用流式细胞术、RT-PCR和ELISA检测外周血CD4+ Foxp3+ Treg/Th17细胞百分率、核转录因子foxhead winged-helix box protein 3 (Foxp3)/retinoid-related orphan receptor gamma-t (RORγt) mRNA的表达以及血浆转化生长因子-β1(Transforming growth factor-31,TGF-β1)/IL-17的水平.结果:AHB组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mRNA及TGF-β1水平与正常对照组相比无明显差异(P＞0.05);而CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγtmRNA及IL-17水平与正常对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).CHB组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mRNA、TGF-31水平及CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγt mRNA、IL-17水平与正常对照组相比均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常对照组相比,AsC组患者CD4+ Foxp3+ Treg/CD4+T细胞百分率、Foxp3 mR-NA、TGF-β1水平及CD4+ IL-17 +/CD4+T细胞百分率、RORγt mRNA、IL-17水平无明显差异(P＞0.05).结论:在不同类型HBV感染者外周血中Treg/Th17细胞失衡,Treg/Th17细胞可能与HBV感染的状态有关.     

急性冠脉综合征患者Th17和Treg细胞的检测及意义

目的:探讨急性冠脉综合征患者Th17细胞和Treg细胞的变化及意义。方法:选取51例急性冠脉综合征患者,25例稳定性心绞痛(SA)患者,27例同期住院的健康对照者,分别采用流式细胞术、实时定量PCR和ELISA法检测外周血Th17细胞和Treg细胞百分率、关键核转录因子RORγt、STAT3和Foxp3 mRNA的表达以及血浆IL-17A和TGF-β1的浓度。结果:①ACS患者外周血中Th17细胞百分率、RORγt和STAT3 mRNA显著高于SA患者和对照组(P<0.01);②与SA组和对照组相比,ACS患者CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+Foxp3+Treg细胞百分率,Foxp3 mRNA的表达以及血浆TGF-β1的浓度显著降低(P<0.01)。结论:ACS患者外周血中Th17/Treg失衡,Th17/Treg失衡可能与斑块的不稳定密切相关。     

CD4~+CD25~+调节性T细胞/Th17细胞失衡与婴幼儿脓毒症

目的 观察不同免疫状态下婴幼儿脓毒症CD4~+CD25~+Foxp3~(high)岫调节性T细胞(Tr)/Th17细胞的变化,探讨婴幼儿脓毒症适应性免疫紊乱可能的机制.方法 婴幼儿脓毒症48例,健康同龄儿童对照组26例.用流式细胞术榆测CD14~+单核细胞HLA-DR表达率,CD4~+CD25~+Foxp3~(high)Tr 比例及Th17细胞比例;用ELISA法检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β及IL-17A等浓度,计算IL-10/TNF-α比值;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测CD4~+T细胞Foxp3、ROR-γt mRNA表达及IL-17A mRNA表达.以CD14~+单核细胞HLA-DR表达＞或＜30%为阈值,将患儿分为免疫激活组(DR-H组)和免疫抑制组(DR-L组).结果 DR-L组IL-10/TNF-α比值明显高于DR-H组(P＜0.05)及对照组(P＜0.05).CD4~+CD25~+Foxp3~(high) Tr细胞比例及转录因子Foxp3基因表达DR-L组明显高于对照组及DR-H组(P＜O.05).Th17细胞比例、IL-17A血浓度、Th17细胞IL-17A基因表达及转录因子ROR-γt基因表达DR-H组及DR-L组均明显高于对照组(P＜0.05),两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).DR-H组和DR-L组Th17细胞主要分化调控因子IL-6、IL-1β血清浓度明显高于正常对照组(P＜0.05),两组问IL-6、IL-1β浓度差异无统计学意义(P＞0.05),DB-L组CD4~+CD25~+Foxp3~(high) Tr细胞主要调节因子TGF-β血浓度明显高于DR-H组及对照组(P＜0.05).结论 Th17持续过度活化可能是导致脓毒症前炎症细胞因子/趋化因子持续增高的原因之一;CD4~+CD25~+Foxp3~(high) Tr细胞/Th17细胞失衡可能参与脓毒症混合性拮抗反应综合征(MARS)的发生发展,婴幼儿脓毒症细胞因子微环境变化可能是导致CD4~+CD25~+Foxp3~(high) Tr细胞/Thl7细胞失衡的原因之一.     

川崎病急性期患者Th17细胞检测及意义

目的:探讨川崎病患者急性期Th17细胞的水平及意义。方法:急性期川崎病(KD)患儿43例,正常同年龄对照41例,采用流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th17细胞占CD4+细胞的比例。荧光定量PCR(Real-time-PCR)检测RORγt和IL-23p19mRNA的表达。双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6水平。结果:急性期KD患儿外周血Th17细胞比例及其特异性转录因子RORγt的mRNA表达分别为:(1.285±0.625)%、(M:5.62,Q:7.16),显著高于同龄对照组(0.584±0.407)%、(M:1.79,Q:2.55),(P0.01)。KD患儿血清IL-6水平显著增高[病人:(M:36.42,Q:129.77)、对照:(M:2.39,Q:1.15)](P0.01),且与Th17细胞比例成正相关(r=0.88,P0.01)。IL-23p19的mRNA表达与正常对照比较无显著差异[病人:(M:2.12,Q:3.05)、对照:(M:1.73,Q:2.79)](P0.05)。结论:急性期川崎病患者Th17细胞数量、血清IL-6水平升高;Th17可能作为急性炎症的启动因素,参与川崎病免疫发病过程。     

Th17细胞在Graves’病中的变化及意义

目的:探讨Th17细胞在中国人Graves’病(GD)中的变化及意义。方法:应用电化学发光法测定30例初发GD患者及30例健康体检者血清中促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺激素(FT4)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)和甲状腺过氧化酶抗体(TPOAb)的水平;采用流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+IL-17+T(Th17)细胞的数量;用ELISA法测定初发GD患者和健康对照者PBMC产生IL-17的水平;应用实时定量PCR(qRT-PCR)检测PBMC中ROR-γt、IFN-γ、IL-4 mRNA的表达量;采用免疫组化染色检测甲状腺组织中IL-17+细胞的分布和数量。结果:初发GD组外周血中Th17细胞占CD4+T细胞的比例[(20.59±4.63)%]、PBMC分泌的IL-17水平[(83.22±34.28)pg/ml]以及PBMC中ROR-γt mRNA表达(1.67±0.98)均明显高于正常对照组Th17[(11.77±4.18)%](P<0.01)、IL-17[(19.74±5.99)pg/ml](P<0.01)和ROR-γt mRNA(0.92±0.18)(P<0.05)的水平。与正常对照组比较,GD患者PBMC中IFN-γmRNA的表达(0.31±0.07)、IL-4 mRNA的表达(2.53±0.70)均明显降低(P<0.01)。初发GD组患者PBMC中Th17细胞百分率与ROR-γt mRNA表达呈正相关(r=0.5047,P=0.01);与IFN-γmRNA表达量呈负相关(r=-0.5085,P<0.01);与IL-4 mRNA表达量呈负相关(r=-0.5372,P<0.01)。正常对照组甲状腺组织中未发现IL-17+细胞,GD组甲状腺组织滤泡间质内可见散在的IL-17+细胞。结论:初发GD患者PBMC中Th17细胞数量、PBMC分泌IL-17的水平和ROR-γt mRNA表达明显增高。GD患者甲状腺组织中有IL-17+细胞浸润,提示Th17细胞可能参与了中国人GD的发生。     

Inhibition of IL-12 synthesis of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with a bacterial superantigen by pooled human immunoglobulin: implications for its effect on Kawasaki disease (KD)

The aim of this study was to further assess the role of pooled human immunoglobulin (PHIG) on cytokine production from PBMC stimulated with a bacterial superantigen. Human PBMC were cultured with Streptococcus pyrogenic exotoxin A (SPE-A) with or without PHIG and several proinflammatory cytokine levels of culture supernatants were measured. Serum cytokine levels of KD patients before and after PHIG therapy were also examined. PHIG greatly reduced the production of IL-12, interferon-gamma (IFN-γ) and other cytokines from SPE-A-stimulated PBMC, while exogenous IL-12, but neither IL-1 nor tumour necrosis factor-alpha (TNF-α), restored IFN-γ production inhibited by PHIG. Although PHIG partially adsorbed SPE-A, its inhibitory effect on cytokine production was not played by anti-SPE-A antibody. Although purified CD4⁺ T cells cultured with human HLA-DR-transfected mouse L cells and SPE-A could not effectively produce IFN-γ, they produced large amounts of IFN-γ if exogenous IL-12 was introduced. KD patients in the acute phase had higher levels of serum IFN-γ than did controls and patients with bacterial infection. Although IL-12 levels of children with or without KD were not significantly different, IL-12 levels of children were much higher than those of adults. However, serum levels of IL-12 of KD patients were transiently but significantly decreased by PHIG therapy and IFN-γ amounts subsequently reverted to basal levels thereafter. These findings indicate that PHIG inhibits IL-12 production of SPE-A-activated monocytes and thereby decreases IFN-γ synthesis by T cells and suggest that inhibition of IL-12 and IFN-γ production is an important part of the mechanisms underlying PHIG therapy on KD.     

IL-17作为分子佐剂增强HIV DNA疫苗细胞免疫应答的研究

目的 为了进一步增强HIV DNA疫苗的免疫反应,本研究将IL-17作为HIV DNA疫苗的分子佐剂免疫小鼠,旨在探讨IL-17对HIVDNA疫苗诱导体液和细胞免疫应答的影响.方法 将小鼠IL-17构建到真核表达载体,与HW-1膜蛋白DNA疫苗pGX-Env联合免疫BALB/c小鼠;分别在第0、2周进行免疫,在第4周检测T淋巴细胞增殖指数、抗-Env IgG、细胞因子表达水平和体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL)等免疫学指标.结果 IL-17能够增强HIV DNA疫苗的特定免疫反应.与单注射疫苗组相比,IL-17作为佐剂组的T细胞增殖、抗体水平和CD4~+T细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-17的表达均无明显增强,但对CD8~+T细胞分泌IFN-γ的表达和体内CTL的效果影响明显(P<0.05).结论 IL-17作为分子佐剂不足以影响Th细胞分化,然而却能够增强特异性CD8~+T细胞中IFN-γ的表达,尤其是增强体内CTL反应.此结果为增强艾滋病DNA疫苗CD8~+T细胞活性和用于艾滋病的治疗提供了一个新的思路.     

KD 患儿Th17 / Treg 细胞失衡和单核细胞趋化蛋白1 的关系研究

目的:探讨川崎病(KD)患儿外周血CD4+ CD25+调节T 细胞(Treg) / 辅助性T 细胞17(Th17)与单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的关系及其在KD 发病中的作用机制。方法:2014 年6 月至2015 年6 月选取本院收治的48 例KD 患儿(恢复期28 例,急性期20 例)为研究对象,另选取40 例健康体检儿童为对照组,采用ELISA 法测定两组血清中白细胞介素-15,17,23(IL-15,17,23)及MCP-1 水平,采用流式细胞术测定两组外周血Treg/ Th17 细胞比例。结果:KD 组患儿血清IL-15、IL-17、IL-23 及MCP-1 水平显著高于对照组(P<0.05),且急性期KD 患儿血清IL-15、IL-17、IL-23 及MCP-1 水平高于稳定期组。KD 组患儿Treg 细胞、Treg/ Th17、Th17 显著高于对照组(P<0.05),急性期KD 患儿Treg 细胞、Treg/ Th17 水平、Th17 高于稳定期(P<0.05)。经Pearson 单因素分析,IL-15、IL-17、IL-23 及MCP-1 与Treg/ Th17 呈负相关(P<0.05)。结论:Treg 与Th17 细胞间的失衡及MCP-1 水平在KD 患儿体内持续升高可能与KD 病情发病及进展有密切的关系,通过测定KD 患儿Treg/ Th17 细胞比例及MCP-1 对评估患儿病情及预后具有一定的指导意义。     

Intracellular cytokine expression in T cells from patients with chronic lymphocytic leukemia

Functional disorders of T lymphocytes play an essential role in abnormal immune response in patients with chronic lymphocytic leukemia. The aim of this study was to assess the profile of cytokines expressed by T cells derived from patients with CLL. We have demonstrated that the intracellular levels of IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF, IL-6 and IL-10 were significantly higher in T cells of CLL patients than in healthy donors. Moreover, the percentages of CD4+/CD3+/TNF+, CD4+/CD3+/IFN-γ+, and CD4+/CD3+/IL-2+ cells were significantly higher in ZAP-70-positive patients compared with ZAP-70-negative ones. Likewise, significantly higher percentages of CD4+/CD3+/TNF+, CD4+/CD3+/IFN-γ+ cells were observed in CD38-positive than in CD38-negative cases. What is more, there was a significant difference in median percentage of CD3+/CD4+ cells expressing TNF, IL-4, IFN-γ, IL-2 or IL-6 between patients carrying the 11q22.3 deletion and/or the 17p13.1 deletion and patients without these genetic aberrations. Our results confirm the functional disorders of T cells in CLL and their influence on the clinical course of the disease.