DNA甲基化与肿瘤

摘要 DNA甲基化是肿瘤发生发展过程中较常见的表观遗传学改变,它与肿瘤的关系己成为肿瘤发病机制研究中的热点。DNA启动子区域甲基化被认为是除突变和缺失以外的抑癌基因功能失活的关键机制。抑癌基因启动子区域发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的,导致恶性肿瘤表型的表达,因而检测体液中相关基因的甲基化状态可用于肿瘤的早期诊断和预后分析。由于DNA甲基化是可逆的,如5-氮杂胞苷（5'-azacytidine）, 5-氮-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine）, zebularine等胞苷类似物正被用来治疗各种肿瘤,已展现出可喜的前景。本文对DNA甲基化概念、意义及应用的问题进行了综述。     

DNA甲基化与大肠癌相关性的研究

DNA甲基化属于表观遗传学范畴,它能在DNA序列不发生改变的情况下参与基因的调控与表达。在大肠癌的发病过程中,伴随着DNA的异常甲基化。抑癌基因和原癌基因的异常甲基化均影响肿瘤的发生发展。现对目前与大肠癌相关的基因甲基化的情况,以及在治疗和预防中的作用进行总结与展望。     

DNA甲基化与糖尿病肾病的研究进展

糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症之一,其具体的发病机制目前并不完全清楚。近年来有研究表明,表观遗传学修饰可能在糖尿病肾病的发生、发展中起着十分重要的作用。表观遗传学修饰包括了DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、基因组记忆、基因沉默等,其中研究较多的则是DNA甲基化。本文就DNA甲基化与糖尿病肾病之间的最新研究进展做一综述,以期为糖尿病肾病的临床诊治提供新的理论依据。     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA进行亚硫酸氢盐修饰.通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果 改良法对于低至15、625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。     

DNA甲基化与动脉粥样硬化的研究进展

<正>动脉粥样硬化是发生在大,中动脉,以粥样硬化斑块形成为病理特征的血管改变。以动脉粥样硬化为病理基础的多种疾病,如冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性脑病、肾动脉狭窄、外周血管闭塞性病变等多种疾病,严重威胁人体健康。但动脉粥样硬化的发病机制尚未完全阐明。表观遗传学是指在DNA核酸序列不发生的改变的情况下,从染色质水平研究生物体如何对基因的表达实现调控[1-2]。其内容包括DNA甲基化,组蛋白修饰,RNA     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,通过MGMT基凶甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

DNA甲基化与卵巢癌的关系研究进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,其死亡率居妇科恶性肿瘤首位,因此,寻找有效的肿瘤标志物对于诊断和治疗早期卵巢癌具有重要意义。近年来,表观遗传学在卵巢癌中的作用受到广泛的关注,其中DNA甲基化对于卵巢癌的早期诊断、靶向治疗以及评估预后具有重大的临床应用前景。     

DNA甲基化与结直肠癌

DNA甲基化是肿瘤常见的表观遗传学改变,是一种在原核和真核生物基因组中常见的复制后修饰,参与体内多种重要的生理过程,同时在肿瘤的发生和发展中也起着重要的作用。近年来,DNA甲基化成为表观遗传学研究的热点,一些甲基化事件可望成为早期诊断结直肠癌的重要分子靶标,因此对结直肠癌DNA甲基化进行深入研究,对于结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预防都具有重要的指导意义。现就结直肠癌中的DNA甲基化研究进展作简要综述。     

DNA甲基化与白血病

<正>虽然同卵双胞胎之间或克隆动物之间拥有同样的DNA序列,但他们的表型和疾病的易感度却不尽相同,这给经典的遗传学出了不小的难题,于是科学家引入了一个新概念—表观遗传学。表观遗传学被定义为在DNA序列保持不变的前提下,基因表达状态的可遗传性的改变,其中DNA甲基     

人骨髓基质干细胞体外三维立体培养的实验研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)在部分脱钙骨三维支架上立体培养的可行性。方法：将自人骨髓中分离出的骨髓基质干细胞进行培养、扩增,接种于多孔的部分脱钙骨支架上,通过荧光活性染料DiI标记和扫描电镜观察骨髓基质干细胞在部分脱钙骨上的生长和粘附情况,并测量hBMSCs在部分脱钙骨上的粘附率。结果：hBMSCs在部分脱钙骨上的粘附率为(99.1±1)%;DiI标记的细胞于接种后第2、4、7天激光共聚焦检测,见支架空隙中细胞逐渐增多;电镜观察,接种7天后,电镜下见细胞覆盖了部分脱钙骨表面;自部分脱钙骨中份切开,横断面电镜观察见断面中充满细胞。结论：hBMSCs在部分脱钙骨支架的三维立体环境中生长良好,是一种较好的体外培养方法。     

骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白质组学比较

目的: 采用蛋白质组学方法研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和成纤维细胞中的蛋白表达差异.方法: 对hBMSCs和成纤维细胞的蛋白样本进行双向凝胶电泳分离,通过比较两种细胞的蛋白组学图谱,确定差异表达的蛋白点;而后对差异点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析和蛋白数据库信息检索;最后选取其中的5种蛋白进行Western Blot实验验证蛋白质组学的研究结果.结果: 在hBMSCs和成纤维细胞中鉴定出29种差异表达蛋白,其中有17种蛋白在两种细胞中有显著差别地表达,另外12种蛋白在两种细胞中有相同丰度地表达.Western Blot的实验结果进一步验证了蛋白质组学分析的结果.结论: hBMSCs与成纤维细胞中蛋白的差异表达体现了两种细胞在细胞形态、结构和功能上的异同性,这对于研究hBMSCs向成纤维细胞分化以及应用hBMSCs构建组织工程瓣膜具有重要意义.     

骨髓间充质干细胞移植增强大鼠子宫切口再生修复

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植在大鼠子宫创伤后再生修复中的作用.方法：建立大鼠瘢痕子宫模型.取Ad-GFP标记的大鼠MSCs,于子宫切口内注射进行原位移植,2周后取瘢痕处子宫肌组织,行HE常规染色,血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）免疫组织化学染色,α-SMA荧光标记,检测MSCs在切口局部的定向分化情况,并定量检测切口局部肌层的生物力学.结果：瘢痕子宫模型成功建立.MSCs移植后子宫切口的破裂阈值增强（P＜0.05）,切口局部VEGF表达上调,TGF-β1表达下调（均P＜0.01）,α-SMA荧光标记提示MSCs在子宫肌层局部出现平滑肌定向分化.结论：MSCs移植增强了子宫切口的再生愈合,提高了切口局部的机械张力,有望减少再次妊娠时子宫破裂的风险.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究

目的:探讨体外诱导犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮样细胞分化的可行性和基本条件.方法:抽取成年健康杂种犬的骨髓,用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化BMSCs,培养扩增后,取第2代BMSCs在以下不同培养液中诱导培养:K-SFM EGF BPE、DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS,观察细胞形态的变化,绘制细胞的生长曲线,诱导培养后第7、14天,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)的表达.结果:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞形态变为圆形或椭圆形,有突起,第14天圆形或椭圆形细胞明显增多;诱导培养过程中DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞形态无明显变化.CK免疫细胞化学染色结果提示:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞呈阳性表达,第14天,阳性细胞明显增多;DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均呈阴性表达.流式细胞仪检测发现K-SFM EGF BPE组诱导培养第14天,部分细胞CK和EMA呈阳性表达(>7%),DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均为阴性.结论:本实验提示K-SFM EGF BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化.     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(MSC)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法 抽取健康成年志愿者骨髓,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中采用全骨髓培养法,培养传代后改用含地塞米松(1×10^-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和维生素C(50 mg/L)的条件培养基培养,在相差显微镜和电镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶(AP)染色、von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内AP(碱性磷酸酶)含量变化,并进行统计学分析。结果 原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2~3周后,透射电镜下观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体和线粒体,细胞核较为幼稚。Ⅰ型胶原染色、AP及钙结节染色等均为强阳性;AP活性明显增强(P<0.05)。结论 MSC取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源,本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法之一。     

兔骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)移植对兔心肌梗死(myoeardial infarction,MI)的治疗作用。方法:大耳白兔38只,2只用于提供MSCs,余36只随机分为对照组、MI组和MSCs移植组。采用结扎左冠状动脉前降支方法制作MI模型,在MI后1小时将DAPI标记的MSCs移植至梗死区,对照组注射等量PBS。术前、术后2周、4周分别做超声心动图检查其心功能变化。术后4周处死兔.取心梗区组织进行组织学观察。结果:心梗4周后,MSCs组心肌组织冷冻切片中可以观察到DAPI标记细胞存在。MSCs组心功能和毛细血管密度与MI组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:经5-aza诱导的MSCs同种异体移植入兔MI模型的受损心肌后能存活并改善宿主的心功能。     

人纤维环细胞与骨髓间充质干细胞Transwell共培养研究

目的探讨人的纤维环（AF）细胞与骨髓间充质干细胞（BMSCs）在Transwell共培养后,对AF细胞的细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及BMSCs是否具有向AF细胞分化的能力。方法分别对5例年龄在40岁以下脊柱手术患者的纤维环组织和骨髓标本进行分离、培养AF细胞和BMSCS,分别吸取第三代的AF细胞和BMSCs,按1 1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入BMSCs,上室植入AF细胞。并且建立3个细胞培养组,即BMSCs与AF细胞共培养组（实验组）,BMSCs单独培养组和AF细胞单独培养组作为对照组。培养3周后,运用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;分别用HE染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和流式细胞仪对两种细胞鉴定;运用荧光定量PCR法检测各细胞培养组蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达变化。结果两种细胞在分离培养后经过鉴定确定为AF细胞和BMSCs。在倒置相差显微镜观察下,共培养组中AF细胞和BMSCs在细胞增殖数量和速度上均高于各自的单独培养组;共培养组中AF细胞和BMSCs的蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达均较各自的单独培养组高（P〈0.05）。结论通过BMSCs与AF细胞Transwell共培养,BMSCs可以促进AF细胞增值和细胞外基质的合成;同时通过共培养,BMSCs具有向AF细胞分化的可能。