神经生长因子及其受体在大鼠雪旺细胞中的表达及对先天性巨结肠的影响

先天性巨结肠(HD)是一种起源于神经嵴的组织发育障碍所致的疾病,其病因学研究很多,有基因缺陷和胚胎发育异常等[1-2].雪旺氏细胞(SCs)起源于胚胎时期的神经峭,神经嵴细胞在明显表达各自的表型之前就广泛地迁移并精确地在胚胎各处定位,这一事实曾引起人们极大的兴趣并提出许多假想.SCs可作为神经营养因子基因的遗传工程细胞用于神经系统损伤性和退行性疾病的基因治疗,但利用SCs临床治疗HD尚无报道.有学者在实验中发现SCs能分泌数种神经营养因子,如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等具有维持神经元存活并促进神经突起生长的作用[3].     

嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗一直是医学界的难题,现今临床上仍无确实有效的治疗方法。目前,SCI修复的研究策略主要有以下几方面:药物治疗、细胞移植治疗、组织移植治疗、基因治疗以及联合治疗等。近年来细胞移植治疗被广泛研究,包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)、嗅鞘     

周细胞在脊髓损伤中的作用

脊髓损伤(SCI)会导致患者自主神经功能、运动和感觉功能丧失,对患者的生活质量产生极大影响[1].SCI的病理变化包括损伤部位缺血、缺氧、神经元受损、瘢痕组织形成和炎性反应等[2].近年来, SCI的病理变化机制研究日趋深入,周细胞作为脊髓微环境的重要组成部位,在SCI的病理过程中发挥着重要作用.SCI发生后神经元轴突遭到破坏,这一过程伴随着血-脊髓屏障的破坏,神经胶质细胞和神经元细胞活化,并分泌多种副产物(包括基质金属蛋白酶、游离氧自由基、趋化因子和细胞因子)[3].各种免疫细胞渗入损伤部位[4],受损区域周围还会产生星形胶质细胞,小胶质细胞同样会被激活[5-6].     

人脐血单个核细胞联合雪旺细胞修复脊髓损伤的实验研究

目的 探讨人脐血单个核细胞(haman cord blood mononuclear cells,HCMNCs)与大鼠雪旺细胞(Schwann cells,SCs)联合移植应用于大鼠脊髓损伤的疗效.方法 健康成年8周龄Wistar雌性大鼠40只,体重(200±30)g.利用Impactor Model Ⅱ型打击器制成T10脊髓损伤模型.40只大鼠随机分成4组,每组10只,即DMEM实验对照组、HCMNCs移植组、SCs移植组、HCMNCs+SCs联合移植组.用HE染色、顺行示踪染色及电镜观察脊髓损伤处轴突再生情况,对各组实验动物脊髓损伤后肢体功能的恢复情况进行行为学评分(BBB评分)及脚印分析实验,综合评估脊髓功能恢复程度.结果 HCMNCs+SCs联合移植治疗能够明显促进神经再生,改善功能,减少空洞形成.BBB评分和脚印分析实验显示各组疗效比较,差异有统计学意义.组织学和电镜观察神经轴突再生情况与功能学检查的结果 相吻合.结论 以分泌各种神经营养因子为特点的SCs为平台,联合移植后诱导HCMNCs向神经元及神经胶质细胞分化,可促进脊髓损伤的恢复.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺氏细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的　从转基因角度探讨治疗周围神经损伤的有效方法。方法　成年Wister大鼠 4 8只 ,平均分为 3组。切断大鼠坐骨神经并形成 10mm长缺损 ,用硅胶管桥接两侧断端 ,管腔内植入胶质细胞源性神经营养因子 (glialcell linederivedneurotrophicfactor,GDNF)修饰的雪旺氏细胞 (schwanncells,SCs) ,正常SCs修复组和单纯硅胶管修复组作为对照 ,分别于术后 4、8、12和 16周对各组动物进行大体观察 ,肌电图测量 ,组织学切片观察 ,再生神经的神经电生理检测 ,GDNF免疫组化检测 ,组织学切片 ,观察和图像分析。结果　GDNF SCs组动物的神经传导速度、有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度均显著优于SCs组和硅胶管组。结论　将GDNF基因修饰的雪旺氏细胞移植修复周围神经缺损 ,使局部释放的GDNF维持神经元存活 ,加快轴突再生速度以促进周围神经再生 ,此方法为将来治疗周围神经损伤提供了线索。     

壳聚糖-胶原生物膜介导雪旺细胞联合神经干细胞桥接周围神经缺损

目的 观察以壳聚糖一胶原偶联的生物膜为载体,联合移植雪旺细胞(SCs)与神经干细胞(NSCs)在坐骨神经损伤修复过程中所起的作用,评价该方法的疗效.方法 分离纯化SCs和NSCs,传代4代后共培养于壳聚糖一胶原生物膜上.32只Wistar成鼠(体重350～400 g)建立坐骨神经缺损动物模型,随机分为4组:空白组;SCs移植组;NSCs移植组;NSCs联合SCs移植组.14周后观察Cy3荧光素染色、MBP免疫酶染色及苏木素-伊红(HE)染色的结果.结果 BDA示踪显示术后联合移植组和SCs组有较多的神经纤维穿过缺损部位,大鼠右后肢感觉和运动功能恢复较其他组明显,修复神经段神经传导速度比值也大于其他组(P<0.05).SCs组和联合移植组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 NSCs和SCs与壳聚糖一胶原生物膜相容性良好,壳聚糖一胶原生物膜介导的SCs联合NSCs桥接周围神经缺损可使部分神经再生.     

雪旺细胞对共培养不同发育阶段纹状体生长的影响

目的 观察雪旺细胞（SCs）在体外对纹状体生长的影响。方法将SCs分别与胎鼠、新生鼠及成年鼠的纹状体在体外进行共培养，分别在3d，1、2、3、4周进行观察纹状体周围神经突起的生长及细胞的迁移情况。结果 共培养组中，胎鼠纹状体周围在第3天就出现了神经突起的生长，第3周达到高峰；新生鼠纹状体周围在第1周出现了神经突起；成年鼠纹状体在第2周出现神经突起的生长。共培养组中，胎鼠纹状体周围第l周出现细胞的迁移，随后逐步增多；新生鼠纹状体周围第2周出现细胞的迁移；成年鼠纹状体在第3周出现少量的细胞迁移，但与对照组比较差异亦有统计学意义（P＜0．05）。结论 SCs在体外能促进共培养不同发育阶段纹状体神经突起的生长及细胞的迁移，可用于神经退行性疾病的移植治疗。     

组织工程支架修复脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal Cord Injury，SCI)是骨科领域致残率、死亡率最高的创伤之一，人们不断努力探索神经元轴突再生机制，试图找到有效的治疗方法。目前，治疗SCI的主要策略有：挽救受损神经元，减少其发生迟发性损伤和凋亡；应用刺激神经生长的因子和／或阻断抑制轴突生长和延伸物质的作用，促进受损轴突的再生；组织或细胞(外周神经、胚胎脊髓、神经干细胞、神经胶质细胞等)移植诱导轴突再生和细胞分化。他们对修复SCI起到了很大作用，但尚无根本突破。近年来，运用组织工程支架修复SCI的新思路已日益受到人们重视。     

富血小板血浆对大鼠许旺细胞生物学行为的影响

目的 观察不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的许旺细胞(SCs)增殖、分泌功能及迁移的影响,探讨其促进周围神经再生的可能作用机制. 方法 从SD大鼠心脏穿刺取血,利用二次离心法制备PRP,对全血和PRP中血小板计数和血小板源性生长因子BB (PDGF-BB)和转化生长因子(TGF-β1)浓度测定;取3～5d龄的大鼠坐骨神经培养纯化SCs,将P1细胞分为实验组与对照组分别进行处理,实验组以含40.0％、20.0％、10.0％、5.0％和2.5％ PRP的条件培养液干预,并设立空白对照组.于干预不同时间点采用CCK-8法测定SCs增殖活性情况,用实时荧光定量PCR方法检测细胞神经生长因子(NGF)和胶质细胞源神经营养因子(GDNF) mRNA表达的变化,ELISA检测SCs分泌NGF和GDNF的水平,Transwell小室检测各组SCs的迁移能力. 结果 PRP血小板回收率达65％,PDGF-BB和TGF-β1浓度明显高于血清(P＜0.01);与空白对照组相比,低于20 0％浓度的PRP呈浓度依赖性促进SCs增殖和迁移,而40.0％浓度组细胞增殖和迁移受到抑制;SCs分泌的NGF和GDNF和其mRNA表达均较对照组明显增加,同样在低于20.0％浓度的范围内呈现量效关系,40.0％浓度组则显示抑制作用.结论 PRP在适当浓度范围可以促进SCs的分裂增殖,合成分泌NGF和GDNF以及迁移的能力,具有潜在的促周围神经再生的作用.     

大鼠雪旺细胞对脊髓源性神经干细胞生长及分化的影响

目的 观察雪旺细胞(SCs)在体外对脊髓来源的神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响.方法 分别从胎鼠脊髓和出生24 h内的SD大鼠坐骨神经分离培养NSCs及SCs并鉴定.实验分成对照组:NSCs单独培养组;A组:脑源性神经营养因子(黼)与NSCs共培养组;B组:SCs与NSCs共培养组;C组:BDNF+SCs与NSC共培养组.观察NSCs的形态学变化,计数并测量细胞团的数量及直径.利用免疫细胞化学方法检测神经元样细胞的表达并计算其百分率及阳性细胞突起的平均长度.结果 来源于新生大鼠脊髓组织的NSCs能够表达NSCs的标志物神经巢蛋白(Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞;72 h,A、B、C组细胞团的数量及细胞团的平均直径,均大于对照组(P＜0.05);传代培养3 d、7 d、14 d的NAP-2染色阳性神经元样细胞所占的百分率及阳性细胞突起平均长度均大于对照组(P＜0.05).结论 大鼠SCs在体外能够促进脊髓来源的NSCs生长并诱导其定向分化.     

星形胶质细胞在脊髓损伤中作用的研究进展

正近年来SCI的发生率在我国乃至全世界呈明显上升趋势~([1])。但SCI的修复是尚未解决的医学难题,而神经轴突的再生是SCI后功能重建的重要基础。小胶质细胞的激活、星形胶质细胞(astrocyte,AS)的增殖活化和胶质瘢痕的形成是阻碍轴突再生的关键因素。AS的增殖活化并分泌多种细胞外基质共同形成神经胶质瘢痕是抑制SCI修复     

用去细胞同种异体神经构建猕猴组织工程化神经的实验研究

目的评价用自体源骨髓间充质干细胞(MSCs)或许旺细胞(SCs)作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴尺神经4cm缺损的实验效果,为临床研究提供资料。方法分别用4种移植物桥接猕猴4cm尺神经缺损。A组:种植自体MSCs的去细胞同种异体神经;B组:种植自体SCs的去细胞同种异体神经;C组:去细胞同种异体神经;D组:自体神经移植。通过功能学、神经电生理学及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果A、B组术后6个月能引起小鱼际肌群产生复合动作电位的潜伏期、复合动作电位的最大振幅、神经传导速度和再生的神经纤维数目与自体神经移植组相比无统计学意义(P>0.05);但A、B、C、D组分别与C组相比,差异有统计学意义(P>0.05)。结论用自体源SCs或MSCs作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴4cm尺神经缺损,均能取得与自体神经移植相近的效果。     

羧甲基壳聚糖通过抑制线粒体途径保护氧化损伤诱导雪旺细胞凋亡

[目的]探讨线粒体途径在羧甲基壳聚糖(carboxymethylated chitosan,CMCS)保护过氧化氢(H_2O_2)诱导雪旺细胞(Schwann cells,SCs)凋亡中的作用及机制。[方法]体外培养SCs,S-100免疫荧光染色鉴定。将SCs分为空白对照组、H_2O_2诱导组、H_2O_2加CMCS处理组。流式细胞仪检测细胞凋亡比率,罗丹明(Rhodamine123)荧光染色检测细胞线粒体膜电位水平,Western blot检测SCs内细胞色素C(Cytochrome C)表达水平。[结果]本实验培养细胞经S-100荧光染色鉴定阳性率达95%以上,H_2O_2诱导SCs凋亡,降低线粒体膜电位,增加细胞色素C释放;而在加入CMCS后SCs凋亡比例降低,线粒体膜电位增加,细胞色素C释放减少。[结论]CMCS通过抑制线粒体细胞凋亡途径保护H_2O_2诱导SCs凋亡。     

Netrin-1对周围神经损伤后有序轴突再生及神经功能恢复的实验研究

目的探讨轴突导向分子Netrin-1对周围神经损伤后有序轴突再生及神经功能恢复的影响。方法通过划痕实验及Transwell小室迁移实验检测Netrin-1对雪旺细胞(Schwann cells, SCs)迁移能力的影响。取21只健康雄性SD大鼠, 随机分为3组, 每组7只, 即假手术组、周围神经损伤(peripheral nerve injury, PNI)组及Netrin-1治疗组。假手术组坐骨神经游离后不进行处理;PNI组及Netrin-1治疗组坐骨神经挤压后分别行神经内注射PBS及Netrin-1。术后7、14及28 d进行步态分析和坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index, SFI)检测。术后28 d处死各组大鼠取右侧坐骨神经, 采用HE及Masson染色评估坐骨神经组织病理学变化及轴突排列情况, 通过免疫荧光染色分析SCs增殖及轴突再生情况。结果 Netrin-1治疗组SCs划痕愈合率及细胞迁移数均高于空白对照, 差异有统计学意义(P<0.05)。术后28 d, Netrin-1治疗组轴突排列较PNI组紧密且有序, 损伤所致轴突崩解和空...     

脂肪干细胞来源外泌体对周围神经损伤后再生作用的实验研究

目的探讨脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)来源外泌体对周围神经损伤后再生的影响,为周围神经损伤寻找新的治疗方法。方法将36只成年SD大鼠(雌雄不限,体质量220～240 g)随机分成3组,每组12只。A组为正常对照组,B组为坐骨神经挤压损伤组,C组为ADSCs来源外泌体治疗坐骨神经挤压损伤组。A组仅暴露坐骨神经后直接缝合切口,B、C组制备坐骨神经挤压损伤模型;术后次日开始,A、B组于大鼠尾静脉注射PBS液200μL,C组注射含100μg ADSCs来源外泌体的PBS液200μL,每周注射1次,连续12周。注射结束1周后处死大鼠,取损伤处坐骨神经,分别行大体观察、HE染色观察神经束情况、TUNEL检测坐骨神经雪旺细胞(Schwann cells,SCs)凋亡情况,透射电镜观察坐骨神经超微结构和SCs自噬情况。结果大体观察示A组患肢无明显异常,B、C组患肢瘫痪、肌肉萎缩,但C组瘫痪及肌肉萎缩程度轻于B组。HE染色示,A组神经束膜形态规则;B组神经束形态破坏、束膜不规则,有较多无细胞结构和组织碎片;C组神经束膜较完整,明显优于B组。TUNEL检测示,B、C组SCs凋亡细胞数显著多于A组,B组显著多于C组,差异均有统计学意义(P0.01)。透射电镜观察示,B、C组SCs自噬体较A组明显增加,但C组少于B组。结论 ADSCs来源外泌体对周围神经损伤后再生有一定促进作用,其机制可能与减少SCs凋亡、抑制其自噬、减轻神经瓦勒变性有关。     

复合雪旺细胞的猪小肠粘膜下层对大鼠海绵体神经损伤勃起功能恢复的实验研究

目的:研究雪旺细胞(SCs)与猪小肠粘膜下层(SIS)构成的人工神经移植替代损伤的大鼠双侧海绵体神经(CN)恢复大鼠的勃起功能。方法:体外培养SCs并复合于SIS,成功制备成SIS与SCs的复合体,选取健康SD大鼠33只,随机分为3组:假手术组(n=11)、CN切断组(n=11)、SCs+SIS组(n=11)。各组大鼠于术后3个月进行阿朴吗啡试验;然后取阴茎海绵体中后部海绵体组织,进行nNOS免疫组织化学染色。结果:①联合使用机械剥离、混合酶消化、差速贴壁法、Ara-C短期使用等方法可获得较高纯度的SCs,满足神经组织工程的需要;②经过机械刮除、化学方法消毒制备的SIS作为一种天然支架材料,与SCs具有良好的细胞生物相容性,适合SCs在其表面粘附、生长、增殖和分化;③术后3个月行阿朴吗啡试验:无论是勃起率还是勃起次数,SCs+SIS组均显著高于CN切断组(P<0.01),但低于假手术组(P<0.01);④nNOS神经纤维数目:SCs+SIS组与CN切断组差异有统计学意义(P<0.01),但二者均低于假手术组(P<0.01)。结论:SCs+SIS作为神经移植物可以修复缺损的CN,并在一定程度上恢复阴茎勃起功能。     

骨髓基质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性及促轴突生长的体外功能实验

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)向雪旺细胞(SCs)分化的可行性,以及分化成类SCs的表型、分子及功能特征.方法 原代培养F344乳鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29、CD44、CD45的表达;诱导干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化,评价干细胞的生物学特性;采用碱性成纤维细胞生长因子和forskolin等诱导BMSCs向SCs分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定SCs特异性标记物S100和p75的表达;RT-PCR分析诱导前、后SCs相关基因的表达;培养大鼠背根神经节神经元,分别与诱导前后的BMSCs共培养,评价其促轴突生长的功能特性.结果 分离培养的鼠BMSCs CD29、CD44表达呈阳性,CD45表达呈阴性:干细胞诱导的成骨细胞茜素红染色阳性,脂肪细胞油红O染色阳性;BMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与SCs相似;免疫荧光染色S100和p75阳性;RT-PCR结果S100、CD104均表达增强;与背根神经节神经元共培养,诱导后的BMSCs促进轴突生长的距离为(285.3±36.7)μm,与未诱导组BMSCs的[(113.5±11.5)μm]相比,差异有统计学意义(t=8.966,P=0.001).结论 BMSCs可诱导分化成SCs,其表型、分子及功能特征与SCs相似,诱导分化的BMSCs是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

脐血间充质干细胞诱导分化为类雪旺细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

目的评价将人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,h UCBMSCs)来源的类雪旺细胞(Schwann cells,SCs)作为种子细胞,修复大鼠坐骨神经15 mm缺损的效果,为h UCBMSCs应用于临床治疗周围神经缺损提供实验依据。方法 SPF级3月龄雄性SD大鼠45只,体重200~250 g。取新生儿脐带血,淋巴细胞分离液复合高分子量羟乙基淀粉分离培养h UCBMSCs并鉴定;取第3代h UCBMSCs,采用改良化学诱导法联合细胞因子方法诱导分化培养类SCs并鉴定。取15只SD大鼠坐骨神经,采用液氮反复冻融振荡洗涤法制备去细胞神经基膜管作为支架材料;将密度1×107个/m L的类SCs细胞悬液多点注射至该支架内复合培养7 d构建组织工程神经。取SD大鼠30只制备长约15 mm坐骨神经缺损动物模型,根据缺损神经修复方法不同,实验分为A、B、C 3组(n=10),A组采用组织工程神经缝合,B组采用未复合类SCs的去细胞神经基膜管缝合,C组采用自体坐骨神经原位缝合。术后行大体观察、坐骨神经功能指数(sciatic function index,SFI)测定、神经电生理功能检测、腓肠肌湿重测定、Masson染色评价神经修复情况。结果分离培养的h UCBMSCs高表达MSCs表面标志;诱导培养后类SCs经免疫细胞化学染色检测示神经胶质细胞标志物S100b、胶质纤维酸性蛋白、P75表达呈阳性。术后8周,大体观察示A组组织工程神经管壁无坏死及液化,周围轻度粘连,吻合处连续性较好;B组支架外观与A组相似;C组自体神经周围粘连较A、B组轻,吻合口光滑,无明显膨大,颜色与正常神经相似。各组大鼠术后SFI随时间延长呈逐渐降低趋势,C组SFI恢复优于A、B组,A组优于B组(P0.05)。术后各组大鼠远端吻合口处均可检测到神经复合动作电位,波幅及传导速度C组均优于A、B组,A组优于B组(P0.05)。术后各组大鼠实验侧小腿腓肠肌与健侧相比,均发生不同程度萎缩;腓肠肌湿重恢复率C组优于A、B组,A组优于B组(P0.05)。Masson染色示A组可见大量再生神经纤维,有髓神经纤维排列较为整齐、致密,纤维直径相似;C组有髓神经纤维密度、直径及髓鞘厚度和轴突直径均明显多于A、B组,A组多于B组(P0.05)。结论 h UCBMSCs来源的类SCs能够促进大鼠15 mm坐骨神经损伤修复可作为组织工程神经种子细胞来源。     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。     

环磷腺苷在脊髓损伤神经再生中的作用

脊髓损伤(SCI)治疗的关键在于神经传导束的恢复,郎轴突的再生.而成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)在损伤后难以自发再生,主要原因包括中枢神经元很弱的再生能力和神经细胞周围抑制性内环境的存在.