IL-12和IL-15对外周血CIK细胞增殖和对SMMC-7721肝癌细胞杀瘤效果研究

目的观察常规培养条件下添加白细胞介素(IL)-12、IL-15对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞增殖的影响,观察不同细胞因子组合培养的CIK细胞的杀瘤作用,为高效率、高质量体外制备肿瘤患者自体CIK细胞制剂提供新思路。方法首先筛选出IL-2、IL-12、IL-15最佳添加水平;然后采集健康献血员外周血,分离出单个核细胞后,根据添加的细胞因子种类和组合类型进行分组:A组(IL-2常规培养组)、B组(IL-2~+IL-12组)、C组(IL-2~+IL-15组)、D组(IL-2~+IL-12~+IL-15组)、E组(细胞因子空白对照组);各组单个核细胞分别在培养第0、5、10、15、20天,采用全自动血球计数仪进行CIK细胞计数,锥虫蓝染法检测细胞活性,流式细胞技术检测细胞膜CD3、CD8、CD56阳性率,MTS法测定CIK细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀瘤效果。结果B、C、D组培养第10、15、20天后CIK细胞增殖倍数均明显高于A组(P0.05);D组培养第10、15、20天CIK细胞增殖倍数均分别明显高于C组(P0.05)。B、C、D组培养第15、20天CIK细胞膜CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+百分比均分别明显高于A组(P0.05);D组培养第15、20天CIK细胞膜CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+百分比均分别明显高于B组(P0.05)。在效靶比5∶1时,各组培养第10、15、20天的CIK细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率均明显高于A组(P0.05);D、C组培养第10、15、20天CIK细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率分别明显高于B组(P0.05)。结论 IL-12、IL-15均可促进CIK细胞增殖,IL-15在促进CIK细胞增殖的同时还能增强CIK细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞的活性。     

Immune Cell SR对冻存PBMNC诱导培养CIK的效果研究

目的:探讨Immune Cell SR(血清替代物)在冻存复苏后PBMNC诱导CIK细胞培养过程中的效果,为免疫细胞的工业化生产提供一个新的策略。方法:提取健康志愿者外周血单个核细胞,经短期冻存后复苏并诱导培养CIK细胞,采用台盼蓝拒染法检测细胞活率,流式细胞术分析免疫细胞亚群,并用Calcein-AM/PI双染法检测其杀伤活性;结果:冻存后PBMNC中在对照组未能正常扩增,与新鲜组相比,2%SR组细胞扩增倍数较低,且差异显著(P0.05),5%SR组、10%AP组与新鲜组比较,差异均无统计学意义(P0.05);冻存前后CD3~+、CD3~+CD8~+、CD3~+ CD56~+细胞亚群比较均无明显差异(P0.05);细胞培养后,各组间CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8+、CD3~+CD56~+、CD3~-CD56~+亚群及体外杀伤活性比较均无明显差异(P0.05);结论:采用5%SR替代自体血浆可以很好地诱导冻存的PBMNC培养CIK细胞,且无外源性蛋白,安全可靠,为免疫细胞冻存技术在细胞治疗中的应用提供条件。     

胎盘血细胞因子诱导的杀伤细胞培养方法及其对肿瘤细胞杀伤效应研究

目的建立胎盘血来源的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)的培养方法,探讨其对肿瘤细胞的杀伤效应。方法分别采集10例健康足月产胎儿的胎盘脐静脉血(胎盘脐静脉血组)和10例健康成人的外周血(成人外周血组),以Ficoll离心法分离单个核细胞,通过定时定量加入干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-1、CD3单克隆抗体等细胞因子,将胎盘血来源单个核细胞及外周血单个核细胞诱导培养成为CIK细胞。采用流式细胞仪检测细胞的免疫表型;用CCK-8法检测CIK细胞对人肺腺癌A549细胞、宫颈癌HeLa细胞以及肝癌HepG_2细胞的杀伤效果。结果胎盘脐静脉血组CIK细胞在培养的第6天开始呈对数增殖,第15天达增殖高峰,增殖倍数(207.91±20.08)高于成人外周血组的CIK细胞增殖倍数(169.08±23.86)(P0.05);胎盘脐静脉血组CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+表达[(72.40±2.29)%、(36.63±2.53)%]均高于成人外周血组[(67.83±3.07)%、(30.96±2.89)%](P0.05);2种来源的CIK细胞对A549、HeLa和HepG2细胞均有杀伤作用,且呈浓度依赖效应;相同效靶比下,胎盘脐静脉血组CIK细胞对肿瘤细胞杀伤作用强于成人外周血组CIK细胞。结论细胞因子可成功诱导出CIK细胞,第15天达增殖高峰;CIK细胞对肿瘤细胞有明显杀伤作用,且胎盘脐静脉血来源的CIK细胞作用更强。     

高纯度CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。     

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3~+CD56~+CIK细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24+Vβ11+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4+和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8+T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3+CD56+CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3+CD56+CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3+CD56+CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24+NKT细胞和CD3+CD56+CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。     

PHA 诱导的 CIK 细胞的生物学特性及其对 K562 细胞杀伤活性影响的研究简

本研究探讨植物血凝素（PHA）诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）与传统方法制备的CIK细胞的体外增殖能力、效应细胞含量和对K562细胞杀伤活性影响并分析其差异.分离健康人外周血单个核细胞（PBMNC）,分甲、乙两组,其中甲组用传统培养方法从PBMNC制备的传统CIK细胞,乙组采用PHA诱导单个核细胞制备获得的新型CIK细胞.在培养过程中,每3d统计各组细胞培养体系中细胞活率和细胞绝对值,并在培养至第15天时,用流式细胞仪分别检测两组细胞免疫表型,统计CD3＋ CD56＋、CD3＋ CD8＋和CD3＋ CD4＋细胞占各培养体系总细胞数的比例;同时用CCK-8试剂盒分别检测两组细胞在不同效靶比时对K562细胞的杀伤活性.结果表明：采用PHA诱导制备新型CIK细胞的方法比传统方法更能促进细胞增殖（P＜0.05）,且细胞活率都保持在90％以上.两组CD3＋ CD8＋、CD3＋ CD56＋细胞比例都显著升高.与传统方法比,新方法的CD3＋ CD8＋细胞升高比例存在显著差异（P＜0.05）,CD3＋ CD56＋细胞提升比例不存在差异,同时CD3＋ CD4＋下降的比例也不存在差异.效靶比为5：1、10：1、20：1、40：1时,PHA诱导制备的新型CIK细胞比传统方法制备的CIK细胞对K562细胞的杀伤活性更强（P＜0.05）,且随着效靶比的升高两种效应细胞对K562细胞的杀伤活力的差异明显性也增加.结论：与传统方法相比,PHA可明显提高CIK细胞的增殖能力,调高CD3＋ CD8＋细胞的比例,增强CIK细胞对K562细胞的杀伤活性,这为白血病及其他肿瘤的细胞免疫治疗提供一种新来源的CIK细胞和可靠依据.     

CD—CIK细胞对急性白血病细胞体外杀伤作用的研究

目的 探讨树突状细胞(DC) 对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK) 增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响.方法 健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照.用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素γ(IFN-γ) 、白细胞介素12(IL-12) 的水平.结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC,CIK细胞共培养后,CD3+CD8+,CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12,INF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1～40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关.结论 DC-CIK细胞增殖能力和抗白血病活性显著高于CIK细胞,DC-CIK细胞可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.     

细胞因子诱导的杀伤细胞基本特性及抗肿瘤效应研究

目的建立培养细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞方法,并评价其基本特点、体内外抗肿瘤活性及安全性。方法使用抗CD3单克隆抗体、rhIL-2及rhIFN-γ刺激PBMC细胞,使其在体外大量扩增,利用流式细胞术、体外杀伤实验及荷人卵巢癌小鼠模型检测CIK细胞的特点及抗肿瘤活性;并检测CIK细胞中外源性因子污染情况及其急性毒性作用。结果体外培养21 d后,CIK细胞总数可达1010以上,其主要成分为CD3+CD8+T细胞及CD3+CD56+NKT细胞,CIK细胞在体外对Ho8910、A549、K562及HepG2细胞均有较高的杀伤活性,并对荷瘤小鼠具有治疗作用。同时在CIK细胞中未检测到外源性病原体污染。结论 CIK细胞在体内外均具有较高的抗肿瘤活性且无毒性作用。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响。方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DCCIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性。结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DCCIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%。CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DCCIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DCCIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞。     

K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀瘤活性

目的 探讨经K562细胞-树突细胞(DC)融合瘤苗刺激的脐血源性细胞因子诱导的杀伤(CIK)/自然杀伤(NK)细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀伤效能及其安全性.方法 通过不同细胞因子的组合分别诱导脐血单个核细胞(MNC)成为DC和CIK/NK细胞,通过聚乙二醇(PEG)将灭活K562细胞与DC融合形成K562-DC融合瘤苗.以10:1比例在CIK/NK细胞培养体系中加入K562-DC融合瘤苗,制备K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞.小鼠均经尾静脉接种K562细胞1×106诱导荷瘤鼠;于接种肿瘤细胞后24 h按不同分组分别经尾静脉输注K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞1×107、CIK/NK细胞1×107,同时设相应的非荷瘤鼠对照.比较各组小鼠的生存率、存活时间;用流式细胞术检测小鼠外周血、肝、肺组织中人CD13+细胞和外周血人CD56+细胞.结果 在接种1×106K562细胞后未经处理的小鼠39 d内全部死亡,8只鼠中肉眼可见瘤块的小鼠5只,其中位于肝脏的4只、脾脏的1只.接种K562细胞后接受K562-DC瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的8只小鼠第65天时死亡1只,抗瘤有效率为87.5%;接受CIK/NK细胞治疗小鼠死亡2只,时间分别为接种K562细胞后第56天及第62天,抗瘤有效率为75.0%,均未发现肉眼可见瘤块.该两组小鼠存活时间分别为(69.4±1.8)d、(67.2±5.3)d,两组间差异无统计学意义(P＞0.05),均高于未予治疗的荷瘤对照组[(30.4±4.6)d](P＜0.01),荷瘤后接受K562-DC瘤苗刺激的和未经瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的两组其余小鼠存活均超过70 d.经CIK/NK细胞治疗的两组存活小鼠外周血,肝、肺组织中人CD13+细胞率差异无统计学意义,均显著低于荷瘤未治疗组(P＜0.01),而治疗的两组存活小鼠外周血人CD56+细胞率与输注不同CIK/NK细胞的非荷瘤对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经过灭活肿瘤细胞预孵育的脐血源性CIK/NK细胞接种在动物体内具有抗瘤活性,无致瘤性.     

树突状细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞增殖和抗白血病作用影响的研究

目的探讨树突状细胞(DC)对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖能力、免疫表型、分泌细胞因子水平以及抗白血病细胞作用的影响。方法健康人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3 CD8 、CD3 CD56 双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3d,DC-CIK细胞上清液中IL-12I、NF-γ分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1~40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对白血病细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。结论DC增加CIK细胞的增殖能力和抗白血病活性。可作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。     

肿瘤细胞培养上清对CIK细胞活性影响的研究

目的 探讨两种血液肿瘤细胞K562和HL－60培养上清液对脐带血CIK细胞的影响作用。方法 在细胞因子诱导的脐带杀伤细胞（CIKs）形成的过程中，加入肿瘤细胞培养上清，观察CIK细胞为主的异质性细胞群体。随培养时间延长，CD3^＋CD56^＋细胞比例明显升高。K562和HL－60培养上清液能明显抑制CIK的增殖率和杀伤活性，免疫表型亦有显著的变化(P＜0．05）。结论 K562和HL－60培养上清液能抑制脐带血CIK细胞的活性，这可能是肿瘤细胞免疫逃避和耐受的原因。     

人外周血Vα24 NKT细胞和CD3+CD56+CIK 细胞生物学特性的比较研究

目的进一步认识Vα24 NKT细胞和CIK细胞在生物学特性的差异。方法从人外周血单个核细胞扩增NKT细胞和CIK细胞;经免疫磁珠纯化获得高纯度的TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞。运用流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的表型、细胞因子和细胞坏死相关因子的表达情况,并用DIOC18染色及流式细胞术测定纯化后的NKT细胞和CIK细胞的细胞杀伤活性。结果经纯化TCRVα24 Vβ11 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞的纯度均达到>90%;纯化后的Vα24 NKT细胞多数为CD4 和DN NKT细胞,高表达TCRVα24、Vβ11、CD3、CD161,低表达CD56;而纯化后的CIK细胞则以CD8 T细胞为主,高表达CD3、CD56,低表达CD161,几乎不表达TCRVα24和Vβ11。在抗原刺激下,CD3 CD56 CIK细胞的IFN-γ、TNF-α、Perforin、FasL、TRAIL表达水平均高于NKT细胞,但CD3 CD56 CIK细胞几乎不分泌IL-4,而NKT细胞则分泌高水平的IL-4;CD3 CD56 CIK细胞对肿瘤细胞株K562、U937、Jurkat的杀伤率均远远高于NKT细胞。结论TCRVα24 NKT细胞和CD3 CD56 CIK细胞是两类完全不同的细胞群,在抗肿瘤免疫和免疫调节中可能起着不同的作用。     

细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较

目的比较用多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与癌性胸水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒活性,为临床应用提供依据。方法用不同的细胞因子分别诱导培养CIK和癌性胸水TIL,按常规法计数细胞增殖量,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其细胞毒活性。结果诱导培养14d后,CIK细胞毒活性为(76.65±16.78)%,增殖倍数为520±102;TIL细胞毒活性为(55.31±11.02)%,增殖倍数为182±78。结论CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14d时达峰值,而TIL细胞在21d时才达峰值,且CIK细胞毒活性明显高于TIL细胞,增殖细胞数量也比TIL细胞高。CIK可替代TIL细胞进行胸腔注射治疗癌性胸水。     

CIK与DC-CIK培养特性及体外存活时间的比较

目的比较细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)及树突状细胞-CIK(DC-CIK)在体外培养特性及收获后室温放置不同时间的存活情况。方法选择中晚期恶性肿瘤住院患者50例,分为CIK组和DC-CIK组,采血前检测患者的血常规,采血后记录分选淋巴细胞的数量和收获淋巴细胞总数,在培养的第15天进行流式细胞术检测CIK及DCCIK细胞的表面标志CD3、CD4、CD8、CD56的表达,收获后胎盘蓝染色法检测细胞在室温下放置不同时间存活率的变化。结果两组初始淋巴细胞数、收获淋巴细胞总数相比差异无显著性,扩增倍数DC-CIK组显著高于CIK组;CD3+、CD8+、CD3+CD8+和CD3+CD56+T细胞比例DC-CIK组显著高于CIK组,两组细胞活率随时间延长而降低,2 h细胞活率与初始有显著性差异,4 h细胞活率低于95%。相同时间两组间细胞活率比较差异无显著性。结论 DC-CIK细胞比CIK细胞增殖更快,效应细胞比例更高,因而具有更高的生物活性。收获后细胞在室温下放置,随时间延长活率逐渐下降,所以细胞收获后应尽快回输给患者。     

细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较

目的比较用多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与癌性胸水中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒活性,为临床应用提供依据.方法用不同的细胞因子分别诱导培养CIK和癌性胸水TIL,按常规法计数细胞增殖量,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测其细胞毒活性.结果诱导培养14 d后,CIK细胞毒活性为(76.65±16.78)%,增殖倍数为520±102;TIL细胞毒活性为(55.31±11.02)%,增殖倍数为182±78.结论CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14 d时达峰值,而TIL细胞在2l d时才达峰值,且CIK细胞毒活性明显高于TIL细胞,增殖细胞数量也比TIL细胞高.CIK可替代TIL细胞进行胸腔注射治疗癌性胸水.     

树突状细胞介导CIK细胞抗恶性肿瘤效应的实验研究

目的 研究人脐血来源树突状细胞（DC）和同源细胞因子激活的杀伤细胞（CIK）,共孵育后,获得的DC CIK细胞对恶性肿瘤细胞的杀伤效应.方法 获取脐血单个核细胞,用不同细胞因子分别诱导DC及CIK细胞.按1：5比例将DC和CIK细胞一起培养.且以单独培养的脐血CIK细胞为对照.采用流式细胞技术分析检测细胞免疫表型,细胞扩增倍数用台酚蓝染色方法计算,杀伤率测定采用MTT法,细胞因子IL 12,IFN γ,TNF-α用ELISA方法检测.结果 来源于脐血CIK细胞扩增倍数低于同源DC CIK细胞（P＜0.05）;混合培养物DC CIK细胞中,CD3 CD8,CD3＋ CD56＋双阳性免疫细胞数量较单纯CIK细胞明显增高（P＜0.05）;脐血DC,CIK细胞共培养3天,其上清液中细胞因子（IL 12,IFN γ及TNF-d）含量比CIK细胞上清液中高（P＜0.01,＜0.05,＜0.05）;当效靶比为2.5∶1-20∶1时,DC-CIK细胞对HL60,K562白血病细胞、U266多发性骨髓瘤细胞株及SMMC 7721肝癌细胞杀伤率均高于CIK细胞（均P＜0.05）.结论 脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗肿瘤效应.该研究为脐血DC CIK细胞的免疫治疗提供了实验和理论依据.     

抗体介导的高效CIK(AMHE-CIK)细胞体外诱导的数种优化方案的比较研究

目的:比较几种体外诱导和扩增抗体介导的高效CIK(AMHE-CIK)细胞的方案,寻找短期内获取大量具有肿瘤杀伤效应细胞的培养方法。方法:用健康人外周血单个核细胞(PBMNC),经CD3抗体激活后,分别添加不同的细胞因子(IL-2,IL-4,G-CSF,GM-CSF,IFN-γ,TNF-α)于体外培养14 d,观察细胞的形态学变化;依据流式细胞术所测得的各组细胞的表型结果,分别筛选出诱导DC的协同刺激因子和诱导CIK细胞的协同刺激因子;再依据添加不同细胞因子将细胞分成对照组IL-2组、1组(试剂A:IL-2、IL-4、GM-CSF;试剂B:IL-2、G-CSF、IFN-γ和TNF-α)和2组(试剂A:IL-2、IL4、GM-CSF;试剂B:IL-2、G-CSF、IFN-γ、TNF-α和IL4),体外培养7d,记录细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测细胞表型为CD3~+CD56~+和CD3~+CD8~+细胞比例。结果:经过7d体外诱导培养对照组和另3组细胞增殖倍数分别为1.57±0.01,4.17±0.16,5±0.47和7.17±0.24倍差异具有统计学显著性(P0.05);各组CD3~+CD8~+双阳性细胞分别为13.96±0.23%、26.33±0.55%、36.83±0.34%和35.88±0.16%,后3组均明显高于对照组(P0.05),1组和2组均明显高于IL-2组(P0.05)。各组CD3~+CD56~+双阳性细胞分别为11.03±0.28%、29.31±0.60%、39.96±0.38%、和29.33±0.54%,后3组均明显高于对照组(P0.05),1组明显高于IL-2和2组(P0.05)。结论:本研究优化得到的1组细胞培养方案可显著诱导抗体介导的高效CIK细胞数量的增殖和有效杀瘤细胞(CD3~+CD56~+和CD3~+CD8~+)的增殖。     

以肝素和抗CD16抗体为基础的扩增人脐血NK细胞无血清培养体系的建立

目的:建立一种新方法以用于体外培养扩增人脐血来源的NK细胞,从而为NK细胞的治疗奠定基础。方法:收集人脐血单个核细胞,将细胞按1.5×10~6/ml悬浮于含5%自体血浆、重组人IL-15(50 ng/ml)和氢化考的松琥珀酸钠(5×10~(-8)mol/L)组成的无血清培养液中,接种于含肝素钠或/和重组抗人CD16单克隆抗体铺板(预先铺板)的培养瓶中,其剂量分别为100 U/cm~2和1μg/cm~2底面积。培养2周后收集细胞,计细胞总数,应用流式细胞术检测细胞中CD3~-/CD56~+比例。以K562细胞为靶细胞,应用MTT实验观察不同效靶比条件下的NK的细胞毒作用。结果:与未铺板培养体系比较,抗CD16抗体及肝素钠铺板体系培养的细胞,在培养1周内易见贴壁的集落。培养2周后,预先铺板组细胞扩增倍数明显高于未铺板组,且CD3~-/CD56~+比例显著升高,尤以抗体和肝素混合铺板组为显著(P0.01)。MTT实验显示,预先铺板培养组所获得细胞对K562细胞的杀伤活性更强。结论:利用肝素和抗CD16抗体铺板,在培养体系中加入IL-15和氢化考的松,可使NK细胞优势扩增,从而获得纯度较高、细胞毒活性较强的NK细胞。     

细胞因子诱导杀伤细胞抗淋巴瘤细胞作用的研究

目的:探讨体外细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞对淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:采集健康人外周血单个核细胞(PBMC),经IL-2、CD3Mc-Ab、IL-1、IFN-γ诱导,制备CIK细胞,同时以淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)作为对照,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,LDH释放法检测其对淋巴瘤细胞株的杀伤活性.结果:CIK细胞与LAK细胞增殖在前期无明显差异,CIK细胞在培养14d后大量增殖,21d后扩增能力显著高于LAK细胞(P＜0.05);表型分析表明CIK细胞主要由CD3+和CD56+双阳性细胞构成;同一效靶比时,CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤活性明显高于LAK细胞(P＜0.05).结论:CIK细胞对淋巴瘤细胞株的杀伤作用强于LAK细胞,具有较强的抗淋巴瘤细胞活性,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞.