体外瞬时转染TIMP-1基因促进成纤维细胞增殖

目的：探讨体外瞬时转染组织型金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）质粒对小鼠成纤维细胞细胞周期和增殖的影响。方法：构建表达小鼠TIMP-1的质粒，体外转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,以转染空质粒的NIH3T3细胞作对照，采用RT—PCR和westem印迹分析检测TIMP—1在基因和蛋白质水平的表达；采用BrdU法和MTT法检测细胞增殖能力和活力；流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：转染TIMP-1质粒的NIH3T3细胞在24h即有明显的TIMP-1mRNA表达和蛋白质表达上调；与转染空质粒的NIH3T3细胞相比，转染TIMP-1质粒的NI心L细胞48h的BrdU摄取率显著升高（P〈0．01），72h的m摄取率显著升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示与转染空质粒的细胞相比，72h时TIMP-1质粒转染组G0／G1期细胞显著减少（P〈0．01），s期细胞比例显著升高（P〈0．01）。结论：体外瞬时转染TIMP-1质粒可以有效地使TIMP-1的基因和蛋白质水平在NIH3T3细胞高表达，TIMP-1高表达显著提高细胞BrdU和MTT摄取率，减少G0／（31期细胞比例，提高s期细胞比例，提示TIMP—1高表达能够促进戍纤维细胞增殖，从而加速间质纤维化的进程。     

人TIMP-2重组腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建含人TI MP-2(hTI MP-2)基因的重组腺病毒载体并在大鼠主动脉平滑肌细胞中表达,为血管疾病基因治疗提供实验基础。方法:利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pTrack-CMV-hTI MP-2共转化BJ5183受体菌,并在其中发生同源重组,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子;重组腺病毒质粒AdhTI MP-2经过293细胞的包装,扩增和纯化后,测定病毒滴度。腺病毒体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测hTI MP-2的mRNA。并收集细胞上清,进行Western blot检测TI MP-2蛋白。结果:得到了携带hTI MP-2基因的重组腺病毒,纯化后滴度为4×1011efu/ml,在感染VSMC后24h即检测到hTI MP-2的表达。结论:成功地构建了携带hTI MP-2的重组腺病毒载体并体外转染VSMC,为下一步应用于血管疾病基因治疗提供了基础。     

转化生长因子-β1基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）的表达能力。方法 取6周龄新西兰白兔BMSCs,传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine):1μg pcD-NA3J-TGF-β1的比例转染,通过免疫组织化学染色及图像分析对3组15份样本检测TGF-β1表达水平;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1生物活性,分析转染的量效关系和时效关系。结果 瞬时表达组转染后48h免疫组织化学染色部分细胞呈强阳性,稳定表达组全部细胞呈强阳性表达持续4周以上。图像分析显示转染细胞TGF-β1表达显著增强,与对照组比较差异有非常显著性（P＜0．01）。量效关系显示,在转染体系中pcDNA3-TGF--β1(μg）：阳离子脂质体（μl）为1：3时,TGF-β1表达效率最高;时效关系显示,稳定表达组TGF-β1表达活性较瞬时表达组更强。结论 TGF-β1基因转染可使BMSCs有效地表达活性TGF-β1而产生生物效应。     

大鼠胰岛细胞转染Wee1Hu基因延长异种胰岛细胞移植后存活时间

目的 探讨大鼠胰岛细胞转染Wee1Hu基因对异种胰岛细胞移植后存活时间的影响。方法 以Wistar大鼠为供者，Balb／c糖尿病小鼠为受者，进行异种胰岛细胞移植。实验分为2组，每组20只。实验组：将转染Wee1Hu基因的1×10^6个供者胰岛细胞悬于0．5ml无菌生理盐水中，注射至受者的腹腔；空白对照组：将1×10^6个空载体胰岛细胞用与实验组相同的方法注射至受者腹腔。实验组和空白对照组的部分受者在移植前1周腹腔注射降植烷0．5ml，并于胰岛细胞移植后开始口服环孢素A30mg／kg，直至实验结束。监测2组胰岛细胞移植后的胰岛素释放功能及存活时间。结果 胰岛细胞移植后，空白对照组的受者均维持高血糖，且体重持续下降，平均生存时间为（18±2．5）d；实验组的受者血糖在2d内均降至正常，且体重增加，生存时间延长（38±3．5）d；两组相比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。空白对照组维持正常血糖时间为（8±2．3）d，而实验组为（10±2．5）d。实验组中采用免疫抑制剂治疗的受者，长期维持正常血糖，平均维持时间超过30d，与空白对照组中采用免疫抑制剂治疗的受者比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 大鼠胰岛细胞转染Wee1Hu基因可延长异种胰岛细胞移植后的存活时间，与免疫抑制剂协同作用时效果更佳。     

PcDNA3-hBMP3基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性基因ｈＢＭＰ３在软骨细胞获得稳定表达的可能性。方法 将和ＢＭＰ３的ｃＤＮＡ构建于真核表达载体ＰｃＤＮＡ３,形成重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３,转染培养状态下兔关节软骨细胞。利用重组ＤＮＡ和基因克隆技术构建重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３;利用细胞２和细胞基因转染技术体外转染ｈＢＭＰ３基因至关节软骨细胞;     

MMP-3和TIMP-3在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的 研究基质金属蛋白酶3(MMP-3)及其抑制物组织基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP-3)在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义.方法 通过免疫组化Elivision法检测48例膀胱移行细胞癌组织及20例正常膀胱组织中的MMP-3和TIMP-3的表达.结果 MMP-3和TIMP-3在正常膀胱组织中不表达,随着肿瘤分级和分期的增高,MMP-3表达增高,但差异无统计学意义(P＞0.05).TIMP-3表达降低,但在肿瘤分级中差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MMP-3的高表达,TIMP-3的低表达与膀胱移行细胞癌的恶性程度有关,在膀胱移行细胞癌的发生发展中起重要作用,可作为临床判断膀胱移行细胞癌的恶性程度及预后的重要参考指标.     

大鼠弹力蛋白原基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的构建携载大鼠弹力蛋白原（tropoelastin）基因的重组腺病毒载体，并在体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）中表达。方法利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pShuttleTropoelastin-GFP进行同源重组，筛选出重组黏粒pAdTropoelas-tin-GFP，经过包装、扩增、纯化后获得重组腺病毒AdTropoelasfin-GFP，测定病毒滴度。腺病毒体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞，一步法提取细胞总RNA，逆转录后，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）检测tropoelastin的mRNA。结果得到了携载tropoelastin基因的重组腺病毒，纯化后滴度为5×10^11pfu／ml，腺病毒转染VSMC后1、3dtropoelastinmRNA表达较空病毒明显增高（P〈0．01），并超出空病毒转染组2倍以上。结论成功构建了携带tropoelastin的重组腺病毒载体，体外转染的VSMC有效表达目的基因。     

正义Tankyrase转染大鼠海绵体平滑肌细胞的作用研究

目的构建正义Tankyrase真核表达载体,探讨其转染大鼠海绵体平滑肌细胞的作用。方法(1)构建及鉴定正义Tankyrase真核表达载体；(2)正义Tankyrase重组质粒(pcDNA-TNKS)转染大鼠海绵体平滑肌细胞,进行DNA水平、RNA水平鉴定；(3)端粒酶活性的定量检测(TRAP-ELISA法)、端粒长度的检测(Southern blot法)及生长曲线(MTT法)的检测。结果(1)成功构建正义Tankyrase真核表达载体；(2)正义Tankyrase重组质粒成功转染大鼠海绵体平滑肌细胞：(3)TNKS转染细胞(SMC-TANKS)、空载转染细胞(SMC-Zeo)及未转染细胞(SMC)的端粒酶活性无显著性差异(P＞0．05)；(4)SMC-TANKS的端粒长度较SMC-Zeo及SMC长(P＜0．01)(5)SMC-TANKS的光密度(OD)值显著高于SMC-Zeo及SMC(P＜0．01)。结论正义Tanks重组质粒转染有助于改变海绵体平滑肌细胞的端粒长度而延长细胞寿命。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染人表皮细胞及其表达

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体(pEGFP-C3-bFGF)能否转染体外培养的人表皮细胞并表达.方法 采用脂质体(LipofectamineTM 2000)转染法,将pEGFP-C3-bFGF转染至人表皮细胞系(HEKa细胞)中,在荧光显微镜下观察其瞬时表达及细胞形态.以同期培养的表皮细胞作为阴性对照,免疫细胞化学染色和免疫荧光标记法检测实验组及对照组中β1整合素、CKl9、CK14及CK10在表皮细胞中表达的差异.结果 荧光显微镜下观察基因转染率为31.6%,转染的细胞体积小,呈圆形或圆梭形,核质比大.免疫细胞化学染色结果显示,实验组细胞中CK19、CK14表达增强,CK10表达减弱.免疫荧光染色结果显示,转染阳性细胞β1整合素弱表达分布在胞膜上,CK19、CK14在胞膜和胞质中表达,CK10表达为阴性.结论 pEGFP-C3-bFGF能够转染至人表皮细胞并表达,为探讨bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验参考.     

凋亡抑制基因存活素在浅表膀胱移行细胞癌中的表达

作者采用存活素单抗对 1993年至1997年 88例浅表膀胱移行细胞癌的电切标本进行免疫组化染色 ,分析其表达与临床病理特点及预后的关系。结果显示 ,膀胱肿瘤组织中可见存活素染色表达 ,而膀胱非肿瘤组织未见染色表达。采用半定量评分标准观察存活素的免疫组化染色 ,其中高表达 5 1例(5 8.0 % ) ,低表达 37例 (42 .0 % )。统计分析显示存活素表达与肿瘤细胞的分级及病理分期之间均无统计学意义 ;患者性别 ,年龄 ,肿瘤数目、大小及形态与其表达程度无关。存活素高表达患者无瘤生存率低于低表达患者 (log等级检验 ,P =0 .0 0 0 4 )。多变量Cox比…     

腺病毒介导TIMP-2基因转染抑制大鼠腹主动脉细胞外基质降解的实验研究

目的利用大鼠腹主动脉瘤模型，在腹主动脉局部灌注携载基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因的腺病毒溶液，应用形态学及组织病理学手段评价其对血管壁基质降解的影响。方法建立大鼠腹主动脉瘤弹力蛋白酶灌注模型，将通过基因重组技术构建成功的腺病毒质粒AdTIMP-2灌注至主动脉局部。2周后处死大鼠，取动脉标本行多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋，对标本进行大体观察、组织病理学常规及特殊染色观察。结果灌注后14d AdCMV组和PBS组腹主动脉直径分别为（3．52±0．11）mm和（3．43±0．09）mm，明显大于AdTIMP-2组的（2．33±0．06）mm，P〈0．05；腹主动脉直径增加百分比AdTIMP-2组为（48±4）％，明显低于AdCMV组的（120±6）％和PBS组的（118±5）％，P〈0．05；AdTIMP-2组的8只大鼠均未见腹主动脉瘤形成，而AdCMV组和PBS组8只大鼠均见主动脉形成瘤样扩张；AdTIMP-2组中层弹力纤维及胶原纤维保存较完整，破坏较轻，在动脉外膜可见炎症细胞浸润。结论腺病毒介导的TIMP-2基因转染可以恢复由蛋白溶解酶引起的细胞外基质降解，阻止动脉瘤的形成，为治疗腹主动脉瘤提供了新的策略。     

α—平滑肌肌动蛋白在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的诱导作用。方法 以5例增生性瘢痕为实验组,3例正常瘢痕为对照组,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察在不同TGF-β1浓度作用下,来源于实验组和对照组的成纤维细胞表达α-SMA的情况。结果 实验组的成纤维细胞,三维培养体系中α-SMA含量明显低于二维培养体系,不同浓度TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ng/ml的TGF-β1作用最有效;与对照组的成纤维细胞相比,实验组的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感。结论 在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;实验组与对照组中的成纤维细胞在细胞性状方面存在差异,对TGF-β1敏感性不同;细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少。     

大鼠供肾转染Fas配体基因延长移植肾存活时间

目的观察大鼠供肾转染Fas配体(FasL)基因是否能延长肾移植后受者和移植肾的存活时间,研究其对移植肾的保护作用。方法供者为SD大鼠,受者为Wistar大鼠,随机配对分为实验组和对照组。实验组供肾移植前用1ml含重组腺病毒AdV-FasL的HC-A肾脏冷保存液(0~4℃)经肾动脉灌注;对照组用1mlHC-A肾脏冷保存液(0~4℃)灌注。建立同种肾移植模型。应用逆转录聚合酶链法(RT-PCR)及免疫组织化学方法检测外源FasL基因的表达;透射电镜观察移植肾超微结构的变化;并对肾移植后大鼠的存活率及血肌酐水平进行观察。结果实验组移植肾转基因后FasLmRNA及蛋白均呈阳性表达,FasL蛋白的表达主要分布于小动脉、肾小球及近曲小管。实验组移植肾免疫排斥反应及超微结构变化均较对照组减轻。实验组及对照组肾移植后大鼠的存活时间中位数分别为32.2d和12.1d;术后第7d,实验组血肌酐水平为(315.2±19.2)μmol/L,对照组为(416.2±48.6)μmol/L;两组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论腺病毒载体可成功介导FasL基因对大鼠肾脏的转移,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间。     

大鼠葡萄糖转运体3真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）的真核表达载体，为进一步研究葡萄糖转运体3对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定基础。方法以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从大鼠脑组织中获取GLUT3全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3，随后用Lipofectamine^TM2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR的方法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组织化学的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果克隆的大鼠GLUT3全长cDNA大小约1．5kb且无碱基突变，以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体3的表达。结论成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体3的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Glut3，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因。     

MMP-1、TIMP-1及PDGF在病理性瘢痕中的表达

目的研究基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、血小板源性生长因子(PDGF)在病理性瘢痕中的表达及意义。方法对58例病理性瘢痕手术切除标本采用免疫组化方法。结果MMP-1、TIMP-1、PDGF在病理性瘢痕中呈阳性表达(62.07%,63.71%,55.17%),在正常皮肤与普通瘢痕中几乎无阳性表达,病理性瘢痕组与两对照组差异均有显著意义(P<0.05)。病理性瘢痕中TIMP-1与PDGF呈正相关(r=0.331,P<0.05)。结论TIMP-1、PDGF促进病理性瘢痕形成;在病理性瘢痕形成过程中PDGF可促进TIMP-1的表达;病理性瘢痕的形成与MMP-1、TIMP-1、PDGF相互作用失衡有关。     

MMP-1、TIMP-1及PDGF在病理性瘢痕中的表达

目的研究基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）、血小板源性生长因子（PDGF）在病理性瘢痕中的表达及意义。方法对58例病理性瘢痕手术切除标本采用免疫组化方法。结果MMP-1、TIMP-1、PDGF在病理性瘢痕中呈阳性表达（62．07％，63．71％，55．17％），在正常皮肤与普通瘢痕中几乎无阳性表达，病理性瘢痕组与两对照组差异均有显著意义（P〈0．05）。病理性瘢痕中TIMP-1与PDGF呈正相关（r=0．331，P〈0．05）。结论TIMP-1、PDGF促进病理性瘢痕形成；在病理性瘢痕形成过程中PDGF可促进TIMP-1的表达；病理性瘢痕的形成与MMP-1、TIMP-1、PDGF相互作用失衡有关。     

人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒在原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及其作用

目的:观察腺相关病毒载体介导的人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的表达及其作用,探讨其应用于勃起功能障碍(ED)基因治疗的可行性。方法:原代培养的SD大鼠CCSM细胞随机分为4组:实验组、空病毒组、示踪剂组和对照组,分别以可分泌表达hCGRP重组腺相关病毒VssH-GCMV-hCGRP、空病毒VssHGCMV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组腺相关病毒VssCMV-GFP进行体外转染或不予任何处理。采用斑点印迹试验检测培养液中的hCGRP和放射免疫法检测转染细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)水平,观察hCGRP和示踪剂GFP的表达及其对CCSM细胞的影响。结果:重组腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入大鼠CCSM细胞并稳定表达,与空病毒组和对照组相比,该病毒明显刺激大鼠CCSM细胞中cAMP水平升高[(48.7±1.1)nmol/L对(12.3±1.2)nmol/L和(7.8±1.4)nmol/L,P均<0.01],培养液中可检测到免疫反应性hCGRP。结论:可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在CCSM细胞过表达,并影响该细胞的cAMP水平,可被应用于ED的基因治疗。     

miR-181b及其关键靶基因PTEN和TIMP-3在肝细胞肝癌中的表达和意义

目的:研究miR-181b对PTEN和TIMP3基因表达的影响,探讨其在肝细胞肝癌(HCC)发生、发展中的作用及意义。方法:应用免疫组化和实时荧光定量PCR检测30例HCC及相应癌旁组织,10例正常肝脏组织中miR-181b、PTEN、TIMP-3表达情况,分析miR-181b、PTEN和TIMP-3的表达水平与HCC临床病理特征之间的关系。探讨miR-181b水平与PTEN、TIMP3表达的相关性。结果:在HCC组织中PTEN和TIMP-3的m RNA和蛋白的表达水平均明显低于癌旁组织及正常肝组织(P0.01),调控二者表达的miR-181b在HCC组织中的的表达明显增高。miR-181b、PTEN和TIMP-3的表达水平与HCC细胞的分化程度、血清中AFP表达水平、HBV感染明显有关,与患者年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。结论:miR-181b在HCC中的表达量显著高于癌旁和正常肝组织,其表达水平与肿瘤组织细胞的分化程度、血清AFP水平及是否合并HBV感染明显相关;在HCC组织中,miR-181b的表达水平与PTEN、TIMP3的水平呈负相关。miR-181b可能通过靶向调控PTEN和TIMP3的表达来发挥其促进HCC侵袭转移的生物学作用。     

MMP-3和TIMP-2在UUO大鼠肾间质的表达

目的:研究基质金属蛋白酶-3(MMP-3)/金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)在单侧输尿管梗阻幼年大鼠肾脏组织的分布、表达及变化。方法:72只Wistar雌性幼年大鼠单侧输尿管结扎制成UUO模型,并随机分为对照组及UUO模型组,于模型成功后第1、2、3、4周末为实验时间点,检测各组大鼠24h尿蛋白、血BUN、Scr,用免疫组化法研究MMP-3及TIMP-2在肾组织的分布、表达及变化。结果:光镜下MMP-3在对照组肾小管上皮细胞胞浆、肾小球的脏层上皮细胞有少量表达。在UUO组1周MMP-3表达增强,主要位于各级肾小管上皮细胞胞浆区及肾间质,2周后表达有所减弱,4周表达最弱。TIMP-2在对照组肾小管上皮细胞胞浆有少量表达,在肾小球无表达。在UUO组TIMP-2随疾病进展而表达逐渐增强(P<0.05),主要位于肾小管上皮细胞、肾间质细胞。结论:MMP-3与TIMP-2蛋白在UUO模型大鼠肾脏组织的表达失衡可能参与了肾组织纤维化的发生发展过程。     

血管内皮生长因子基因在原代培养大鼠肝细胞的转染表达

目的　研究血管内皮生长因子基因 (VEGF12 1)在原代培养大鼠肝细胞中转染表达。方法　构建 pIRES EYFP /VEGF12 1质粒 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、WesternBlot和荧光显微镜观察VEGF基因在原代培养大鼠肝细胞中的转染表达。结果　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建并转染原代培养大鼠肝细胞 ,RT PCR观察到 2 5 8bp的VEGF特异性条带 ,WesternBlot检测到相对分子质量 42× 10 3 的特异性条带 ,荧光显微镜观察到转染阳性肝细胞发出黄绿色荧光。结论　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒在原代培养大鼠肝细胞转染并表达 ,为VEGF基因修饰肝细胞移植和基因治疗奠定基础。