新生鼠缺氧缺血性脑损伤后不同途径人神经干细胞移植的实验研究

缺血缺氧性脑病（hypoxic—ischemic encephalopathy，HIE）是儿科最常见导致中枢神经系统后遗症的原因，目前无特效治疗。近年来神经干细胞（neural stem cells，NSCs）移植治疗缺血缺氧性脑损伤的实验研究已见报道，其中成年动物神经干细胞移植的研究已有较长时间，相比之下，儿科相关研究很少，有限的新生动物神经干细胞移植研究结果表明，新生动物移植内环境明显优于成年动物，能取得较成年动物好的移植效果，     

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞巢蛋白表达的变化

目的 了解神经干细胞巢蛋白(nestin)在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后表达的动态变化.方法 56只新生7日龄SD大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血组.制备大鼠HIBD模型后分别于即刻、3、12、24 h,3、7、14 d将动物处死.采用SABC免疫组化方法检测nestin蛋白表达的动态变化.结果 假手术组nestin蛋白在海马、室管膜下区弱表达,在皮质几乎不表达,缺氧缺血组nestin蛋白12 h在皮质,24 h在海马、室管膜下区表达增加,nestin阳性细胞数分别为13.3±1.8,37.9±5.7,35.5±7.2,与假手术组相比有统计学差异,P＜0.05.皮质、海马、室管膜下nestin阳性细胞数均在7 d达高峰,分别为88.5±3.5,100.7±8.1,96.8±5.8,与假手术组相比有统计学差异,P＜0.05,在缺血14 d降低至假手术组水平.结论 新生大鼠缺氧缺血脑损伤后nestin蛋白表达增加,nestin的表达可能是神经干细胞增殖及胶质细胞反应共同作用的结果.     

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞巢蛋白表达的变化

目的了解神经干细胞巢蛋白(nestin)在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后表达的动态变化。方法56只新生7日龄SD大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血组。制备大鼠HIBD模型后分别于即刻、3、12、24h,3、7、14d将动物处死。采用SABC免疫组化方法检测nestin蛋白表达的动态变化。结果假手术组nestin蛋白在海马、室管膜下区弱表达,在皮质几乎不表达,缺氧缺血组nestin蛋白12h在皮质,24h在海马、室管膜下区表达增加,nestin阳性细胞数分别为13.3±1.8,37.9±5.7,35.5±7.2,与假手术组相比有统计学差异,P<0.05。皮质、海马、室管膜下nestin阳性细胞数均在7d达高峰,分别为88.5±3.5,100.7±8.1,96.8±5.8,与假手术组相比有统计学差异,P<0.05,在缺血14d降低至假手术组水平。结论新生大鼠缺氧缺血脑损伤后nestin蛋白表达增加,nestin的表达可能是神经干细胞增殖及胶质细胞反应共同作用的结果。     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室人神经干细胞移植的实验研究

目的研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室移植人胚胎脑神经干细胞后,植入细胞的存活、迁移及分化情况。方法孕12周人胚胎神经干细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和白血病细胞抑制因子的N2培养基(D/F12+N2+B27)中培养11天。生后7天的新生SD大鼠32只建立缺氧缺血性脑病模型,3天后将培养的人神经干细胞制成悬液(1.0×105/μl),采用立体定向移植至实验动物损伤侧脑室。移植后1、2、4周及3个月(每时间点各8只)取脑组织行HE染色和免疫组织化学分析。结果移植后1周大量抗人细胞核蛋白抗体阳性的植入细胞从脑室沿胼胝体向外迁移并到达损伤区,以损伤侧皮层、海马多见,在不同区域可见与宿主细胞类似的分化的植入细胞:移行至皮层的植入细胞85%分化为抗人细胞核蛋白神经丝蛋白或抗人核蛋白神经元管蛋白抗体双阳性的皮层细胞,而位于移行区域的植入细胞60%表达为抗人核蛋白胶质纤维酸性蛋白抗体双阳性的星形胶质细胞,其余细胞仍在迁移中未分化。移植后2周更多的移植细胞到达损伤区,移植后4周及3个月植入细胞数较前明显减少。结论人胚胎神经干细胞经脑室移植至缺氧缺血性脑损伤的鼠脑后能存活、迁移,并依迁移区域的不同分化为神经元和星形胶质细胞。     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后血管内皮生长因子的变化

目的 了解血管内皮生长因子(VEGF)在新生鼠缺氧缺血性脑损伤后表达的动态变化。方法 采用Rice法制备缺氧缺血性脑病模型，将80只7日龄SD大鼠随机分为：正常对照组、模型后即刻组、1h组、3h组、6h组、12h组、24h组、48h组、72h组、7d组。用免疫组织化学方法观察VEGF表达的动态变化。结果 正常对照组中大鼠脑内几乎无VEGF表达；模型组结扎侧大脑皮质，纹状体，海马在模型后即刻即有VEGF表达，3～12h达高峰，随后开始下降，7d后呈低水平稳定表达。结论 缺氧缺血作为一种信号刺激VEGF在神经细胞内表达增加；VEGF的表达增加具有时间依赖性；VEGF对缺氧缺血性神经元损伤可能具有一定的保护作用。     

新生鼠缺氧缺血性脑病动物模型的建立及神经干细胞在缺氧缺血性脑病中的变化规律探讨

目的建立新生鼠缺氧缺血性脑病（HIE）动物模型,阐明HIE病程中神经干细胞（NSCs）的变化特点。方法210只7日龄新生SD乳鼠随机分为正常对照组、单纯缺氧组及缺氧缺血组,每组70只。根据处死时相点每组分成3、6h,1、3、7、14、21d等7个小组,每组10只。缺氧缺血组结扎血管后左颈总动脉后置于8％氧浓度的低氧环境中2．5h,单纯缺氧组仅缺氧2．5h。采用HE、免疫组织化学染色以及光镜技术分别对3组SD大鼠脑组织中的NSCs进行检测。结果缺氧缺血后3h出现轻度脑损伤,1d病变最严重,3、7d胶质细胞增生,14、21d出现脑萎缩。3组SD大鼠脑组织均存在NSCs,从第1天开始各组间NSCs细胞数差异有统计学意义,缺氧缺血组均低于单纯缺氧组,第3天时缺氧缺血组还低于正常对照组,第7—21天单纯缺氧组高于正常对照组。3组NSCs细胞数均有显著性动态变化,趋势也基本相似,除单纯缺氧组3d高于3h和6h外,3d内各时相点差异无统计学意义;以后随着时间延长而逐渐下降,每后一时相点低于前一时相点。结论成功建立了缺氧缺血性脑病动物模型;HIE早期NSCs增殖,随着病情的演变,NSCs开始减少,最后导致病变区的NSCs相继死亡;低氧有利于NSCs的增殖。     

神经生长因子对新生鼠缺氧缺血性脑损伤后神经再生的影响

目的 探讨外源性神经生长因子(NGF)对新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后神经再生的影响.方法 通过7日龄新生Wistar大鼠制作HIBD模型,设置假手术组、HIBD对照组、NGF治疗组,应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记新生神经细胞,免疫组化方法和计算机图像分析技术检测不同时点(术后4、7、14、21 d)海马齿状回(DG)巢蛋白(nestin)表达、BrdU阳性细胞数的变化.结果 各时点HIBD对照组nestin、BrdU阳性细胞数较假手术组增加(P均＜0.05);各时点NGF治疗组nestin、BrdU阳性细胞数较假手术组和HIBD对照组增加(P均＜0.01).结论 早期给予外源性NGF治疗可促使新生鼠脑缺氧缺血后中枢神经系统nestin、BrdU的表达增加,NGF治疗可促进受损神经细胞的增殖再生,在神经细胞损伤的修复巾发挥一定的保护作用.     

碱性成纤维细胞生长因子对新生鼠缺氧缺血性脑损伤巢蛋白表达的影响

目的探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对新生鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后巢蛋白（nestin）表达的影响。方法通过7日龄新生Wistar大鼠制作HIBD模型,设置对照组、治疗组,并设立假手术组。免疫组化方法观察巢蛋白表达的变化。结果各时点对照组巢蛋白阳性细胞数较假手术组增加,治疗组巢蛋白阳性细胞数较对照组增加明显,各时点三组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论新生鼠HIBD后脑缺血易损伤区巢蛋白表达增加,可能与脑损伤后神经再生有关;给予外源性bFGF可增强新生鼠脑缺氧缺血后中枢神经系统巢蛋白的表达,在神经细胞损伤的修复中发挥一定的保护作用。     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织Nogo-A mRNA和Nogo-A蛋白表达及意义

Nogo—A是最近发现的一种髓鞘源性神经生长抑制蛋白,它已成为当前研究中枢神经再生的新热点,并有望成为解开中枢神经系统（CNS）再生之谜的一把金钥匙。本实验旨在检测HIBD新生大鼠脑组织Nogo-A mRNA和Nogo-A蛋白表达的变化,以探讨缺氧缺血脑损伤（HIBD）时抑制坏死神经元再生的分子机制,为HIBD后神经元的损伤修复机制及治疗干预提供实验室资料及理论依据。     

亚低温对新生鼠缺氧缺血性脑损伤自由基影响的研究

目的 研究亚低温对新生鼠缺氧缺血性脑损伤后自由基的影响。方法 7日龄大鼠行左侧颈总动脉结扎后吸入8%氧气2h,制成缺氧缺血性脑损伤模型。动物随机分成五组：假手术组、缺氧缺血组、缺氧缺血后30min给予亚低温组、缺氧缺血后1h给予亚低温组、缺氧缺血后3h给予亚低温组。脑皮质细胞匀浆用于测定丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 缺氧缺血组MDA含量明显高于假手术组,而亚低温各组MDA含量均低于缺氧缺血组,而且亚低温应用越早者MDA含量减少越明显。结论 亚低温可以通过减少自由基的产生发挥对缺氧缺血性脑损伤的保护作用。     

神经营养因子与神经干细胞移植联合治疗缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的 观察神经营养因子与神经干细胞(NSCs)联合移植对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠的治疗效果.方法 取新生24 h的Wistar大鼠海马NSCs进行培养、鉴定.选7日龄Wistar大鼠制备HIBD动物模型,7 d后行损伤侧侧脑室移植.将实验大鼠随机分为9组正常组、模型组、磷酸盐缓冲液移植组、NSCs移植组、BDNF组、BDNF NSCs移植组、NT-3组、NT-3 NSCs移植组、BDNF NT-3 NSCs移植组.移植4周后进行功能实验,取脑组织进行免疫组化及免疫荧光检查.结果 从新生大鼠海马可成功培养出NSCs,并表达NSCs的标志物神经巢蛋白(neuroepithelial stem cell protein,Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞.Y迷宫实验NSCs移植组达到学会的次数(163±11.60)n,正确记忆次数(5.00±1.13)n;BDNF组(150.00±8.94,5.17±1.47)n;BDNF NSCs移植组(111.25±13.56,6.23±1.60)n;NT-3组(153.56±10.35,5.07±1.03)n;NT-3 NSCs移植组(117.27±11.4,6.30±1.1)n;BDNF NT-3 NSCs移植组(110±11.55,6.30±1.1)n.悬吊实验NSC移植组平均(30.10±11.8)s;BDNF组(36.25±10.98)s;BDNF NSCs移植组(43.6±10.56)s;NT-3组(34.95±10.15)s;NT-3 NSCs移植组(40.64±10.6)s;BDNF NT-3 NSCs移植组(42.20±6.25)s.斜坡试验NSCs移植组平均(20.3±8.25)s;BDNF组(14.33±2.88)s;BDNF NSC移植组(11.17±2.48)s;NT-3组(15.26±2.98)s;NT-3 NSC移植组(12.8±3.65)s;BDNF NT-3 NSCs移植组(12.9±5.18)s.说明各联合移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与NSCs移植组比较,明显改善(P＜0.05),而NSCs组大鼠学习记忆能力及神经功能与HIBD组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).各联合移植组损伤侧皮层、海马存活的NSCs数量(BDNF NSC移植组9.31±0.71个,10.10±1.65个;NT-3 NSCs移植组6.18±1.83个,8.18±3.06个;BDNF NT-3 NSCs移植组为9.58±1.61个,11.45±1.36个)与NSCs组(3.33±0.24个,4.22±0.33个)比较明显增多(P＜0.05),且NSCs分化为神经元的比例明显增多,与NSCs移植组比较,有统计学意义(P＜0.05),但双因子联合移植组与其单因子移植组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BDNF、NT-3与NSCs联合移植是治疗HIBD的有效方法.     

神经营养因子与神经干细胞移植联合治疗缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的观察神经营养因子与神经干细胞(NSCs)联合移植对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠的治疗效果。方法取新生24h的Wistar大鼠海马NSCs进行培养、鉴定。选7日龄Wistar大鼠制备HIBD动物模型,7d后行损伤侧侧脑室移植。将实验大鼠随机分为9组:正常组、模型组、磷酸盐缓冲液移植组、NSCs移植组、BDNF组、BDNF NSCs移植组、NT-3组、NT-3 NSCs移植组、BDNF NT-3 NSCs移植组。移植4周后进行功能实验,取脑组织进行免疫组化及免疫荧光检查。结果从新生大鼠海马可成功培养出NSCs,并表达NSCs的标志物神经巢蛋白(neuroepi-thelial stem cell protein,Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞。Y迷宫实验:NSCs移植组达到学会的次数(163±11.60)n,正确记忆次数(5.00±1.13)n;BDNF组(150.00±8.94,5.17±1.47)n;BDNF NSCs移植组(111.25±13.56,6.23±1.60)n;NT-3组(153.56±10.35,5.07±1.03)n;NT-3 NSCs移植组(117.27±11.4,6.30±1.1)n;BDNF NT-3 NSCs移植组(110±11.55,6.30±1.1)n。悬吊实验:NSC移植组平均(30.10±11.8)s;BDNF组(36.25±10.98)s;BDNF NSCs移植组(43.6±10.56)s;NT-3组(34.95±10.15)s;NT-3 NSCs移植组(40.64±10.6)s;BDNF NT-3 NSCs移植组(42.20±6.25)s。斜坡试验:NSCs移植组平均(20.3±8.25)s;BDNF组(14.33±2.88)s;BDNF NSC移植组(11.17±2.48)s;NT-3组(15.26±2.98)s;NT-3 NSC移植组(12.8±3.65)s;BDNF NT-3 NSCs移植组(12.9±5.18)s。说明各联合移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与NSCs移植组比较,明显改善(P<0.05),而NSCs组大鼠学习记忆能力及神经功能与HIBD组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各联合移植组损伤侧皮层、海马存活的NSCs数量(BDNF NSC移植组9.31±0.71个,10.10±1.65个;NT-3 NSCs移植组6.18±1.83个,8.18±3.06个;BDNF NT-3 NSCs移植组为9.58±1.61个,11.45±1.36个)与NSCs组(3.33±0.24个,4.22±0.33个)比较明显增多(P<0.05),且NSCs分化为神经元的比例明显增多,与NSCs移植组比较,有统计学意义(P<0.05),但双因子联合移植组与其单因子移植组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论BDNF、NT-3与NSCs联合移植是治疗HIBD的有效方法。     

促红细胞生成素对新生鼠缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞的影响

目的探讨外源性促红细胞生成素(Epo)对新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后神经干细胞的影响以及Epo的神经保护机制。方法72只新生7日龄Wistar大鼠随机分为对照组、HIBD组和干预组,每组24只。结扎大鼠右侧颈总动脉和8%低氧暴露2h制备新生大鼠HIBD模型。对照组仅游离右侧颈总动脉,不予结扎和缺氧处理。干预组大鼠缺氧缺血后立即腹腔注射重组人促红细胞生成素(rh-Epo)5000IU/kg,每天1次,连用3d。HIBD组大鼠缺氧缺血后连续腹腔注射等量生理盐水3d。每组随机取8只分别于术后4、7、14d处死。应用免疫组化方法和计算机图像分析技术检测不同时点海马齿状回巢蛋白(nestin)标记阳性细胞的变化。结果各时点HIBD组nestin阳性细胞数较对照组增加(P<0.05);各时点干预组nestin阳性细胞较对照组和HIBD组均增加(P<0.05)。3组大鼠海马齿状回区nestin阳性细胞数均于术后7d达高峰。结论早期给予rh-Epo可促使新生鼠HIBD后海马齿状回区nestin表达增加,促进神经干细胞的增殖再生,在HIBD后神经再生、修复中发挥一定的保护作用。     

不同褪黑素治疗方案对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

目的 探讨不同褪黑素治疗方案对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠脑内源性神经干细胞（NSCs）增殖及远期组织学的影响,以寻求褪黑素治疗的较优方案。方法 将96只7日龄Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、缺氧缺血性脑损伤（HIBD）组、单剂量即刻褪黑素治疗（SDIT）组及7日连续褪黑素治疗（7DCT）组（n=24）。HIBD大鼠模型采用分离并电凝大鼠右侧颈总动脉,低氧舱（氧气浓度为8%±0.01%）内缺氧2 h的方法建立。造模后7 d,采用增殖细胞核抗原（PCNA）/巢蛋白（Nestin）免疫荧光双标法检测各组大鼠侧脑室室管膜下区（SVZ）及海马齿状回（DG）区内源性NSCs的增殖情况（n=8）;采用Western blot法检测各组大鼠脑Nestin蛋白的表达水平（n=8）。造模后28 d,采用苏木精-伊红染色（HE）和尼氏染色法观察海马CA1区的组织病理学及锥体细胞数的变化（n=8）。结果 免疫荧光染色结果显示：SDIT组和7DCT组PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数均较HIBD组增加,且7DCT组显著多于SDIT组（P < 0.01）;Western blot结果显示：SDIT组与7DCT组Nestin蛋白的表达水平均显著高于HIBD组,且7DCT组显著高于SDIT组（P < 0.05）;HE染色结果显示：SDIT组及7DCT组细胞损伤减轻;尼氏染色结果显示：SDIT组和7DCT组锥体细胞数均较HIBD组增加,且7DCT组显著高于SDIT组（P < 0.01）。结论 SDIT和7DCT均可促进HIBD新生大鼠脑内源性NSCs的增殖,减轻远期组织学损伤,且7DCT疗效优于SDIT。     

缺氧缺血性脑损伤发病中神经干细胞变化规律初探

目的：探讨缺氧缺血性脑损伤后神经干细胞(NSCs)的变化规律。方法：取新生7日SD大鼠随机分为正常对照组、缺氧组和缺氧缺血组。每组再根据处死时间点随机分成3 h,6 h,1 d,3 d,7 d,14 d,21 d 7个亚组(n=10)。缺氧缺血组大鼠分离并结扎左颈总动脉,置于密闭缺氧箱2.5 h,缺氧组不结扎血管,仅缺氧2.5 h。免疫组织化学检测海马、皮层及纹状体区阳性NSCs数。结果：正常7日龄大鼠脑组织存在NSCs,且呈明显的区域性分布,在10日龄后数目逐渐减少。缺氧组及缺氧缺血组大鼠NSCs较正常组增多,差异有显著性,在缺氧后3d(10日龄)时达高峰,后逐渐减少,缺氧组在缺氧后21 d(28日龄)时仍高于正常组。结论：H IBD发病中早期NSCs增殖;NSCs随着病情的演变开始减少;早期采用NSCs干预治疗可能为临床治疗H IBD提供重要途径。     

乌司他丁对缺氧缺血性新生鼠的脑保护作用

目的探讨乌司他丁对新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的作用。方法选7日龄新生Wistar大鼠60只制备HIBD模型。乌司他丁治疗组大鼠分别于术后即刻、术后8、16h腹腔注射乌司他丁一次,术后24h处死。取脑组织迅速秤重,固定,切片行HE和TUNEL染色,测定凋亡细胞数,对皮层脑细胞变性坏死和胶质细胞增生行病理量化评分,电镜观察海马区细胞形态。结果治疗组在脑重增加值及左、右脑重差值、凋亡细胞数和病理量化评分明显低于缺氧缺血组(P<0·01);各治疗组之间比较上述指标无统计学意义(P>0·05)。结论乌司他丁可减轻缺氧缺血后脑细胞水肿、变性、坏死及凋亡,对新生鼠HIBD具有保护作用。     

乌司他丁对缺氧缺血性新生鼠的脑保护作用

目的 探讨乌司他丁对新生鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的作用。方法 选7日龄新生Wistar大鼠60只制备HIBD模型。乌司他丁治疗组大鼠分别于术后即刻、术后8、16h腹腔注射乌司他丁一次，术后24h处死。取脑组织迅速秤重，固定，切片行HE和TUNEL染色，测定凋亡细胞数，对皮层脑细胞变性坏死和胶质细胞增生行病理量化评分，电镜观察海马区细胞形态。结果 治疗组在脑重增加值及左、右脑重差值、凋亡细胞数和病理量化评分明显低于缺氧缺血组（P〈0．01）；各治疗组之间比较上述指标无统计学意义（P〉0．05）。结论 乌司他丁可减轻缺氧缺血后脑细胞水肿、变性、坏死及凋亡，对新生鼠HIBD具有保护作用。     

环氧化酶-2在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的表达

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的作用.方法 新生7日龄大鼠制成HIBD模型,缺氧时间为2h,RT-PCR半定量分析COX-2mRNA,免疫组化方法测定COX-2蛋白表达,光镜下观察神经元坏死情况.结果 HIBD后6、24、48h,5d COX-2mRNA表达出现不同程度的表达增强,分别为(0.461±0.052),(0.887±0.0816),(0.660±0.119),(0.474±0.104),与对照组(0.321±0.175)比较,差异有统计学意义(P＜0.01),其中HIBD 24 hCOX-2mRNA表达为最高峰,同其余各组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01),免疫组化结果与之一致.结论 COX-2在新生儿HIBD形成中发挥一定的作用.     

环氧化酶-2在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的表达

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的作用。方法新生7日龄大鼠制成HIBD模型,缺氧时间为2h,RT-PCR半定量分析COX-2mRNA,免疫组化方法测定COX-2蛋白表达,光镜下观察神经元坏死情况。结果HIBD后6、24、48h,5dCOX-2mRNA表达出现不同程度的表达增强,分别为(0·461±0·052),(0·887±0·0816),(0·660±0·119),(0·474±0·104),与对照组(0·321±0·175)比较,差异有统计学意义(P<0·01),其中HIBD24hCOX-2mRNA表达为最高峰,同其余各组相比,差异均有统计学意义(P<0·01),免疫组化结果与之一致。结论COX-2在新生儿HIBD形成中发挥一定的作用。