逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

目的 通过构建CXCR7短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列的真核表达载体,探讨趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖、凋亡、周期的影响.方法 针对CXCR7构建编码shRNA序列的重组表达载体;分别用RT-PCR和Western blot检测CXCR7 mRNA及蛋白表达水平;MTT法检测细胞增殖;TUNEL法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期.结果 构建针对CXCR7短发夹状RNA序列的表达载体,经酶切及测序证实与设计完全一致;将2个CXCR7shRNA载体(CXCR7-shRNA1;CXCR7-shRNA2)转染MDA-MB-435s细胞后,CXCR7 mRNA及蛋白平均降低;抑制CXCR7的表达后,CXCR7-shRNA组细胞增殖率明显下降(P＜0.05),细胞凋亡增多(P＜0.05),细胞周期无明显改变.结论 重组表达载体CXCR7-shRNA1、CXCR7-shRNA2能有效抑制靶基因CXCR7的表达,进而可抑制人乳腺癌MDA-MB-435s细胞的增殖,促进细胞凋亡,而对细胞周期无明显影响.     

siRNA干扰乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达及对细胞增殖影响的研究

目的研究慢病毒载体介导的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞系血管内皮生长因子(VEGF-C)表达的敲减作用及对乳腺癌增殖和凋亡的影响。方法构建慢病毒VEGF-C/siRNA载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,观察其转染效率,采用实时定量PCR检测MCF-7细胞在转染前后VEGF-C的mRNA表达,计算VEGF-C敲减率,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。结果慢病毒VEGF-C/siRNA转染效率超过80%,VEGF-C的mRNA表达敲减率达50%,MTT结果提示慢病毒VEGF-C/siRNA能有效抑制细胞增殖,流式细胞学实验结果提示VEGF-C/siRNA干扰后S期细胞明显减少,G0/G1期细胞显著增加,细胞凋亡增加。结论慢病毒VEGF-C/siRNA转染率高,能有效敲减VEGF-C的mRNA表达,使细胞增殖受到抑制,凋亡增加。     

Down-regulation of VEGF-C Expression in MCF-7 Breast Cancer Cells With Lentivirus-mediated Small Interfering RNA Vectors and Its Effect on Cell Proliferation

目的 研究慢病毒载体介导的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞系血管内皮生长因子(VEGF-C)表达的敲减作用及对乳腺癌增殖和凋亡的影响.方法 构建慢病毒VEGF-C/siRNA载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,观察其转染效率,采用实时定量PCR检测MCF-7细胞在转染前后VEGF-C的mRNA表达,计算VEGF-C敲减率,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 慢病毒VEGF-C/siRNA转染效率超过80%,VEGF-C的mRNA表达敲减率达50%,MTT结果提示慢病毒VEGF-C/siRNA能有效抑制细胞增殖,流式细胞学实验结果提示VEGF-C/siRNA干扰后S期细胞明显减少,G0/G1期细胞显著增加,细胞凋亡增加.结论 慢病毒VEGF-C/siRNA转染率高,能有效敲减VEGF-C的mRNA表达,使细胞增殖受到抑制,凋亡增加.     

miR-210对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨microRNA-210(miR-210)对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 采用RNA干扰技术,构建针对miR-210的shRNA真核表达载体,转染MCF-7细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测转染后miR-210的表达情况,观察转染后MCF-7细胞的增殖、侵袭和凋亡情况.结果转染后MCF-7细胞中miR-210表达明显下降,同时细胞增殖和侵袭能力减弱、凋亡率上升.结论 miR-210能够影响乳腺癌的生物学行为.     

RNAi沉默MACC1基因表达抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移

目的探讨RNAi沉默MACC1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的影响及相关的分子机制。方法化学合成针对MACC1基因的荧光标记的siRNA-FAM,利用siRNA转染试剂将MACC1特异性siRNA-FAM转染至乳腺癌MCF-7细胞;采用RT-PCR检测siRNA对MACC1 mRNA表达的影响,Western blot检测siRNA对MACC1蛋白合成的影响;MTT实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞增殖活性的影响;Transwell迁移实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞迁移能力的影响;Western blot检测干扰MACC1对S100A4及vimentin蛋白合成的影响。结果 MACC1基因在乳腺癌MCF-7细胞高表达;针对MACC1基因的siRNA转染MCF-7细胞48 h后,siRNA组与空白对照组比较,能够显著抑制MACC1基因表达和蛋白合成,抑制效率分别为81%和75%;MACC1特异性siRNA转染MCF-7细胞24、48、72 h后,MMT结果显示与空白对照组比较,siRNA组能够抑制细胞生长,并随着时间延长抑制明显(P<0.05);转染MCF-7细胞48 h后,Transwell迁移实验结果显示siRNA组与空白对照组比较,穿过小室细胞数明显降低,其能有效抑制MCF-7细胞迁移(P<0.05);siRNA组与空白对照组相比,S100A4和vimentin表达降低(P<0.05)。以上实验阴性对照组和空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用特异性siRNA干扰MACC1基因表达,可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力,且这一过程可能与S100A4和Vimentin的表达下调有关。     

E1A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及其分子机制

目的：本研究将E1A基因转染HER-2表达阳性的乳腺癌细胞系MCF-7，并研究E1A对MCF-7细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：利用基因转染技术检测MCF-7细胞中E1A的表达，RT-PCR和Western杂交检测E1A基因对HER-2mRNA和蛋白表达水平的调控，MTT法检测E1A对MCF-7细胞增殖的抑制作用，软琼脂集落法检测E1A对MCF-7细胞集落形成的影响，并利用流式细胞术检测E1A对MCF-7细胞凋亡的调控。结果：MCF-7细胞无内源性的E1A表达，E1A在MCF-7细胞内的表达显著性地降低了细胞中HER-2mRNA和蛋白表达水平，诱导MCF-7细胞发生凋亡。细胞增殖曲线显示E1A基因显著性抑制MCF-7细胞增殖和细胞集落形成能力。结论：E1A基因能降低人乳腺癌细胞MCF-7的HER-2表达，诱导细胞发生凋亡，从而抑制细胞的增殖和细胞集落形成能力。     

缺氧诱导因子-1在人乳腺癌细胞系MCF-7中的抗凋亡作用

目的研究缺氧诱导因子-1在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中对凋亡的作用。方法氯化钴（COCl2）模拟低氧环境。采用RNA干扰技术,构建针对HIF-1α的shRNA真核表达载体,转染MCF-7细胞。Real-timePCR和Western-blot技术分别检测HIF-1αmRNA和蛋白质水平。Sub-G1测定,AnnexinV荧光标记和DNAladder检测细胞凋亡。结果缺氧后MCF-7细胞HIF-1α的蛋白质水平表达增加,但缺氧后细胞的凋亡率比正常氧水平时低。实时定量PCR和Westernblot结果证实转染短发夹RNA后,MCF-7细胞中HIF-1α基因表达被成功抑制。阿糖胞苷诱导或无凋亡诱导剂时,干扰组凋亡率比未转染组明显增高。结论这项研究证明HIF-1在MCF-7中发挥抗细胞凋亡的作用,为针对HIF-1α的shRNA有效地用于乳腺癌的治疗提供新的思路。     

ADAM17-shRNA在缺氧条件下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的：研究在缺氧环境下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17（ADAM17）的短发夹状 RNA（shRNA）对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖的影响。方法针对 ADAM17设计4个特异性的 ADAM17-shRNA,经电穿孔法转染 MCF-7细胞。缺氧条件下培养细胞。试验分为：对照组（空白磷酸盐缓冲液）、无义序列组（转染无义序列 ADAM17-shRNA）和 shRNA 转染组（转染 ADAM17-shRNA,选择沉默 ADAM17基因效率最高的 shRNA 用于后续试验）。分别采用实时荧光定量 PCR、iCELLigence、流式细胞仪检测细胞 ADAM17 mRNA 的表达水平、细胞增殖活性和细胞周期变化。结果4个 shRNA 转染组对 MCF-7细胞的 ADAM17基因表达均有沉默作用,与对照组及无义序列组相比,差异具有统计学意义（P ＜0．05）,尤以 shRNA1219抑制率最高（F ＝5．11, P ＜0．01）。shRNA 转染组的细胞生长速度和增殖活性较对照组和无义序列组显著降低,差异有统计学意义（P ＜0．05）。shRNA转染组的绝大多数细胞停留在 G0／G1期（73．35±2．45）,与对照组（62．56±2．35）、无义序列组（62．68±1．20）相比较,差异有统计学意义（P ＜0．05）,细胞周期进展明显延缓。结论 ADAM17-shRNA 在缺氧条件下抑制乳腺癌细胞 MCF-7的增殖。     

BMP-4基因影响乳腺癌细胞增殖、凋亡和迁移能力涉及NF-κB途径

目的探讨骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein 4,BMP-4)基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响途径。方法通过向乳腺癌MCF-7细胞株转染PET-BMP-4质粒过表达BMP-4;采用RT-PCR、MTT法、Boyden小室培养、Hoechst染色、Western blot方法,检测质粒转染、NF-κB抑制剂吡咯二硫代氨基甲酸盐(pyrrodlidine dthiocarbamate,PDTC)预处理和对照组细胞增殖、凋亡、迁移能力及NF-κB、Bax、Bcl-2水平。结果与空质粒转染组和空白对照组细胞相比,过表达BMP-4基因可导致MCF-7细胞增殖能力升高,凋亡细胞比例降低,细胞迁移能力增强,NF-κB和Bcl-2表达水平升高,Bax表达水平降低(P<0.05);PDTC预处理后NF-κB和Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高,显著降低过表达BMP-4对MCF-7细胞的生物学效应(P<0.05)。结论过表达BMP-4基因可增强乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移能力并抑制其凋亡,可能与上调NF-κB有关。     

S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因沉默抑制乳腺癌MCF7细胞生长的研究

目的探讨S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖及侵袭能力的抑制作用。方法用特异性沉默SAMDC基因表达的RNA干扰真核表达载体SAMDC shRNA表达载体(pGPU6 SAMDC)转染乳腺癌MCF 7细胞,采用RT PCR和Western blot技术分别检测SAMDC mRNA和蛋白质表达水平;细胞增殖实验（CCK 8法）和细胞周期分析评价SAMDC基因沉默对乳腺癌MCF 7细胞增殖的影响,肿瘤侵袭实验观察SAMDC基因沉默对乳腺癌细胞MCF 7侵袭活性的影响。结果SAMDC shRNA表达载体转染后,MCF 7细胞SAMDC mRNA水平下调43.8％,蛋白表达水平下降66.5％;MCF 7细胞的增殖活性和侵袭能力均受到明显抑制,细胞增殖活性下降37%,细胞周期分析G1期细胞增加。结论SAMDC基因沉默可通过延长细胞周期的G1期而抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖,并能降低癌细胞侵袭活性,提示SAMDC可作为乳腺癌基因治疗的靶分子。     

RunX2的真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的：构建人 RunX2真核表达载体,观察 RunX2对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法运用逆转录 PCR （RT-PCR）扩增、酶切、连接等基因重组技术将人 RunX2基因插入 pcDNA3．1真核表达载体中;并经酶切、PCR、测序鉴定;将构建的 RunX2真核表达载体瞬时转染 MCF-7细胞,利用 Western blot 法检测 RunX2蛋白表达,用 MTT 实验和细胞划痕实验检测其对乳腺癌细胞的生物学影响。结果构建的 RunX2真核表达载体在 MCF-7细胞中高表达 RunX2蛋白;发现高表达 RunX2的 MCF-7细胞活力增加,移动能力增强。结论构建的 RunX2真核表达载体能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。     

长链非编码RNA LINC00173在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中的作用

目的探讨长链非编码RNA LINC00173对紫杉醇耐药乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响,并探讨其可能的作用机制。方法利用qRT-PCR方法检测LINC00173在乳腺癌细胞株（MCF-7、MDA-MB-231和SKBR-3）和正常乳腺癌上皮细胞系（MCF-10A）的表达水平;构建LINC00173过表达载体和干扰片段,各自转染到乳腺癌细胞株中,利用qRT-PCR方法检测转染后LINC00173的表达水平;采用CCK8实验检测乳腺癌细胞的增殖能力;Transwell侵袭和划痕实验,检测细胞的侵袭和迁移能力;Western blotting方法检测CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白的表达。结果与MCF-10A细胞相比,LINC00173在乳腺癌细胞株中低表达;MCF-7细胞转染干扰片段及MCF-7/PR耐药细胞株转染过表达LINC00173载体后,与阴性对照（si-NC）组相比,si-LINC00173的表达降低;而与LV-NC组相比,过表达LV-LINC00173后的表达增加,且差异有统计学意义（P < 0.01）;干扰LINC00173的表达后,MCF-7细胞的增殖及迁移能力增强（P < 0.01）;过表达LINC00173后,MCF-7/PR细胞的增殖、侵袭及迁移能力减弱（P < 0.01）;干扰LINC00173后,MCF-7细胞CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白的表达水平明显增加（P < 0.01）;过表达LINC00173后,MCF-7/PR的CyclinD1、β-catenin、P-gp蛋白表达水平明显下降（P < 0.01）。结论LINC00173在乳腺癌细胞中表达降低并可能通过调控β-catenin表达参与紫杉醇耐药过程且与其发生、发展及侵袭有关,是涉及到乳腺癌发展的一种新的分子,可为临床诊断、治疗乳腺癌提供新的理论依据。     

BRCA1对MCF-7细胞hTERT基因表达的抑制作用研究

目的将BRCA1真核表达质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞中,观察外源性BRCA1基因转染MCF-7细胞后对hTERT蛋白表达的抑制作用及对细胞增殖的影响.方法应用脂质体法将BRCA1真核表达质粒转染至乳腺癌MCF-7细胞中,Western blot检测转染细胞中hTERT蛋白表达的变化.MTF比色试验观察BRCA1真核表达质粒转染后MCF-7细胞增殖活性的变化.结果外源性BRCA1真核表达质粒组MCF-7细胞较未转染组MCF-7细胞hTERT蛋白表达明显减弱.BRCA1基因转染后的MCF-7细胞的增殖活性明显降低.结论外源性BRCA1基因的表达可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞中hTERT基因的表达,并抑制MCF-7细胞的增殖能力.BRCA1基因的表达异常可能在乳腺肿瘤发生发展机制中具有重要的作用.     

Inhibition of cell proliferation by siRNA targeting hPRLR in breast cancer MCF-7 cell line

Objective： To study the inhibition of proliferation of breast cancer by small interfering RNA（siRNA） targeting human prolactin （hPRLR） and the underlying mechanisms. Methods：The siRNA targeting hPRLR was chemically synthesized and transfected into MCF-7 cells, the expression of hPRLR was analyzed by real-time quantitive PCR, cell growth inhibition was measured with MTT assay, cell cycle of the transfected cells was examined by flow cytometry, meanwhile, expression of cyclin D1 was tested by semi-quantitative RT-PCR, Results：24 h after transfection with 100 nmol/L siRNA-PRLR, the expression of hPRLR mRNA was suppressed by 65%, cells in G1 phase increased, but cells in S phase decreased. Down regulated hPRLR expression exhibited significant inhibition in cell proliferation. And the expression of cyclin D 1 was down regulated. Conclusion：The results indicate that siRNA-hPRLR is a useful tool for silencing hPRLR expression and inhibiting cell proliferation in breast cancer MCF-7 cell line, and it may be a possible new approach for breast cancer gene therapy.     

外源性p27Kip1基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响

目的：探讨外源性p27Kip1基因对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响。方法：应用脂质体转染法将含人野生型p27Kip1基因质粒DNA转染乳腺癌MCF-7细胞,免疫细胞荧光化学方法验证p27Kip1基因转染MCF-7细胞后蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞周期的变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,观察外源性p27Kip1对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响。结果：免疫细胞荧光化学方法证实p27Kip1基因转染MCF-7细胞后存在蛋白表达;流式细胞仪检测结果提示,细胞周期出现G0/G1期阻滞;细胞计数法绘制细胞生长曲线显示细胞增殖明显抑制。结论：外源性p27Kip1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和细胞周期有明显抑制作用。     

miR-373抑制剂对乳腺癌细胞生长的影响

目的探索miR-373抑制剂对乳腺癌细胞系MCF-7生长的影响。方法设计并合成miR-373抑制剂,通过脂质体转染至MCF-7细胞,采用荧光定量聚合酶链式反应检测转染后细胞内miR-373的表达水平,同时检测Caspase-3与Caspase-8的表达情况,并应用MTT实验检测miR-373抑制剂对MCF-7细胞生长的影响。结果 miR-373抑制剂能有效抑制MCF-7细胞中miR-373的表达。转染后,MCF-7细胞中Caspase-3与Caspase-8的mRNA水平均升高（P〈0.05）。miR-373抑制剂对MCF-7细胞的生长有明显的抑制作用,抑制率随浓度升高而增加（P〈0.05）。结论 miR-373抑制物可有效抑制MCF-7细胞增殖,有望成为治疗乳腺癌的新靶点。     

PIN1反义核酸转染抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖

目的 研究利用Pin1反义核酸阻断乳腺癌MCF-7细胞中Pin1的表达,并观察其对增殖的影响.方法 构建Pin1反义核酸真核表达质粒pPIN1as,用脂质体转染法将重组质粒转染MCF-7细胞,G418筛选稳定表达重组质粒的克隆,RT-PCR检测Pin1基因表达水平,Western blot检测Pin1蛋白的表达,MTT检测细胞增殖状况稳定表达Pin1反义核酸的MCF-7细胞内Pin1基因表达在Mrna水平和蛋白水平都显著降低;MTT实验显示MCF-7PINAS细胞的增殖速度较MCF-7细胞明显减慢（P＜0.05）.结论 阻断Pin1可以显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性.这为乳腺癌的基因研究及治疗提供了新思路.