单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。     

啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

[目的] 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子.[结果] 通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定.[结论] 成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体.     

pGAPZαA/HD5酵母表达载体的构建

目的 利用分子生物学技术和方法将pGAPZαA质粒改建为带有人防御素5(HD5)基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5,为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础.方法 PCR技术,以设计的引物P1/P2从克隆载体pMD18-T/HD5中扩增人防御素5基因片段,并将扩增出来的目的 基因和pGAPZαA质粒用EcoRI和XbaI双酶切后连接构成重组质粒,然后转化至E.coli Top10感受态细胞,筛选阳性克隆.最后对PCR及酶切鉴定含有目的 基因的克隆进行测序和电泳.结果 获得HD5基因片断大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的 基因的正确序列;电泳结果证明已将此片段克隆到pGAPZαA内.结论 成功构建了HD5基因的新型表达载体pGAPZαA/HD5.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

【目的】构建含有人巨细胞病毒（CMV）调控表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。【方法】设计HSV-tkcDNA的特异引物,PCR扩增获得HSV-tk基因序列,将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒pMD18T-TK,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,将HSV-tk基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含EGFP和HSV-tk基因的重组质粒,Lipofectin介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞并检测其表达情况。【结果】酶切见特异酶切图谱,该质粒在瞬时表达时获得EGFP的良好表达。【结论】含HSV-tk和EGFP基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP构建成功,为利用绿色荧光蛋白标记在后续实验中进行自杀性基因治疗的深入研究奠定了基础。     

HP450基因的克隆及其重组载体pMD18-HP450的构建与鉴定

目的构建HP450基因的克隆载体。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体。以菌液为模板做PCR、酶切和测序鉴定pMD18-HP450重组质粒载体。结果菌液PCR扩增出目的条带、重组体的酶切产物合理,测序显示目的基因与基因库中的H1基因100%同源。结论实现了HP450基因的克隆及其重组质粒载体pMD18-HP450的构建。     

小鼠Hsp84真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建小鼠Hsp84基因真核表达质粒。方法：采用逆转录、热降落PCR方法，扩增BALb／c小鼠Hsp84基因片段。将其连人pMD18-T载体，筛选阳性克隆、测序验证。然后以重组T载体为模板，PCR扩增目的序列，插入真核表达质粒pcD—NA3.1中，转化大肠杆菌DH5α，通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和验证阳性重组克隆。结果：RT—PCR自小鼠脑组织中扩增出目的基因片段，克隆人pMD18-T载体后，测序结果证明为BALb／c小鼠Hsp84基因．插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致。结论：成功构建了小鼠Hsp84编码框全长的真核细胞表达质粒。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

顺式串联家蝇抗菌肽Attacin基因真核表达载体的构建

目的 构建家蝇抗菌肽Attacin基因多拷贝串联体，并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法 PCR法扩增家蝇抗菌肽Attacin基因成熟肽片断，目的片断的上游5’端带有EcoR Ⅰ和NheⅠ位点，下游5’端带有NotⅠ和XbaⅠ位点，目的片断首先克隆入pMD18-T载体，利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶（NheⅠ和XbaⅠ），多次酶切连接，串联成多拷贝的Attacin成熟肽基因，再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明串联体基因重组质粒构建成功。结论 该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因，为进一步进行高效表达打下基础。     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

Construction and identification of prokaryotic expression vector of native human pepsinogen A gene

目的 构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A )原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达.方法 以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒.结果 PCR扩增出约1000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功.结论 成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础.     

hTFF2毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的 构建三叶因子2(hTFF2)的毕赤酵母表达载体.方法 从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF2 cDNA,用PCR方法扩增hTFF2基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pGAPZαA中,构建真核重组表达质粒pGAPZαA-hTFF2.结果 通过双酶切和基因序列分析确定插入pGAPZαA中的片段为hTFF2基因片段.结论 重组质粒pGAPZαA-hTFF2成功构建,为在真核细胞中高效表达hTFF2及下一步的功能研究奠定了基础.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白基因 真核共表达质粒的构建

 【目的】 构建含有人巨细胞病毒(CMV)调控表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。【方法】 设计HSV-tk cDNA的特异引物,PCR扩增获得HSV-tk基因序列, 将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒pMD18T-TK,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,将HSV-tk基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含EGFP和HSV-tk基因的重组质粒,Lipofectin介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞并检测其表达情况。【结果】 酶切见特异酶切图谱, 该质粒在瞬时表达时获得EGFP的良好表达。【结论】 含HSV-tk和EGFP基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP构建成功,为利用绿色荧光蛋白标记在后续实验中进行自杀性基因治疗的深入研究奠定了基础。     

pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0 酵母表达载体     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

单纯疱疹病毒I型DNA疫苗的构建(英文)

目的　构建表达单纯疱疹病毒 1型糖蛋白D的DNA疫苗。方法　采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从HSV 1基因组中扩增出 gD基因 ,插入中间载体pGEM T ,然后克隆入真核表达载体pcDNA3 .1 ,构建重组质粒 pLy D .经部分测序和限制性内切酶分析证实。将pLy D转染Cos 7细胞 ,并肌肉接种ICR小鼠。用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体。结果　转染的Cos 7细胞中有 gD蛋白的表达 ;经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV 1抗体产生。结论　本研究构建的重组质粒 pLy D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白 ,免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应     

登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别.     

人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-2基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-2(sKDR)基因,构建sKDR基因真核表达载体,为进一步研究sKDR抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sKDR基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-sKDR重组载体,胶回收sKDR基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒做双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sKDR基因真核表达载体pCMV-Script-sKDR分别做双酶切和测序鉴定,证实其中含有sKDR基因,测序结果经BLAST分析,与预期设计的编码区cDNA序列一致。结论成功克隆了人sKDR基因的真核表达载体。