一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶酶学性质的研究

目的研究蚯蚓组织中1种新型脱氧核糖核酸酶(EWD1)的主要酶学性质。方法用SDS-PAGE凝胶电泳、质谱分析、毛细管等点聚焦电泳法和酶活性测定等方法。结果EWD1的相对分子质量约为157000。Mn2+、Ca2+是该酶的抑制剂,Mg2+对酶的活性基本上没有影响。该酶的最适温度为37℃,最适pH值为5.2,等电点为6.12。以小牛胸腺DNA为底物,测得Km为1.58 mg/mL,Vmax为5.36 mg/(mL.min)。结论蚯蚓组织中发现的此种脱氧核糖核酸酶EWD1具有特殊的酶学性质,明显区别于已知的脱氧核糖核酸酶类。     

木瓜凝乳蛋白酶动力学研究

以软骨蛋白多糖为底物,木瓜凝乳蛋白酶的最适反应温度为60°C(pH=7.0),最适pH值7.0(37℃).在pH值7.0、反应温度为37℃的条件下,木瓜凝乳蛋白酶的Km值为11.11 mg/ml,Vmax为0.03 mg/(min·ml).一定浓度下的NaCl和Ca2+对木瓜凝乳蛋白酶均有激活作用,并研究了其它金属离子对酶活性的影响.     

重组人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶2B7三个功能性突变体的构建、表达及活性比较

目的构建人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)2B7重组酶的3个功能性突变体UGT2B7*71S(A71S,211G>T),UGT2B7*2(H268Y,802C>T)和UGT2B7*5(D398N,1192G>A),以进一步研究该酶野生型和其突变体在对底物作用过程中的功能差异。方法应用细菌/杆状病毒系统,将构建的pFastBac-UGT2B7*71S,pFastBac-UGT2B7*2和pFastBac-UGT2B7*5重组质粒转化E.coli DH10Bac大肠杆菌,通过转座作用获得各自的重组粘粒(bac-mid),然后将其转染草地夜蛾(Sf)9细胞后,产生重组杆状病毒。这些病毒再感染Sf9细胞,即可获得野生型UGT2B7*1及其突变体的重组酶。野生型及突变体酶的活性以7-羟基-4-三氟甲基香豆素(7-HFC)为底物,用荧光法测定并分析比较。结果利用杆状病毒/昆虫细胞系统,成功地构建人UGT2B7重组酶的3个功能性突变体。UGT2B7*1对7-HFC的Km值为(0.331±0.018)mmol·L-1,Vmax值为(2.14±0.04)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*71S对7-HFC的Km值为(0.260±0.026)mmol·L-1,Vmax值为(1.36±0.05)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*2对7-HFC的Km值为(0.53±0.06)mmol·L-1,Vmax值为(9.5±0.5)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*5对7-HFC的Km值为(0.59±0.05)mmol·L-1,Vmax值为(7.52±0.28)μmol·min-1·g-1蛋白。结论应用细菌/杆状病毒系统,成功构建了UGT2B7的3个功能性突变体,这些突变体可进一步用于对其他底物的代谢活性比较。     

龙葵碱对HepG_2人肝癌细胞NAT酶动力学常数的影响

目的探讨龙葵碱对HepG2细胞NAT酶米氏常数Km及最大反应速率Vmax的影响。方法MTT法测定龙葵碱对消化系统SGC-7901人胃癌、HepG2人肝癌、Ls-174人大肠癌3种肿瘤细胞株的细胞毒作用,采用高效液相色谱(HPLC)法,以2-AF为底物,以2-AF的浓度为底物浓度,在以HepG2完整细胞及细胞质内2-AF被NAT酶乙酰化为2-AAF的速度为NAT酶的反应速率,采用双倒数作图法,以底物2-AF浓度的倒数1/S对NAT反应速率的倒数1/V作直线,得出回归方程,计算Km和Vmax。结果MTT法测定表明龙葵碱对HepG2人肝癌细胞比较敏感,酶动力学研究表明,以2-AF为底物,对于HepG2完整细胞,阴性对照组的Km和Vmax分别为(2.37×10-3±8.37×10-5)mmol.L-1、(9.16×10-4±7.54×10-5)nmol.106cells-1,龙葵碱组的Km和Vmax分别为(2.22×10-3±9.05×10-5)mmol.L-1和(5.14×10-4±3.72×10-5)nmol.106cells-1。对于HepG2细胞质,阴性对照组的Km和Vmax分别为(8.95×10-3±2.61×10-4)mmol.L-1、(2.55×10-6±1.92×10-8)μmol.min-1g-1Pro,龙葵碱组的Km和Vmax分别为(9.48×10-3±3.63×10-4)mmol.L-1和(2.43×10-6±1.32×10-8)μmol.min-1g-1Pro,统计学表明对于HepG2完整细胞和细胞质,阴性对照组和龙葵碱组的Km没有差异,而Vmax差异有显著性(完整细胞P<0.01,细胞质P<0.05)。结论龙葵碱是HepG2人肝癌细胞NAT酶2-AF底物的非竞争性抑制剂。     

蚯蚓纤溶酶的药用淀粉化学修饰

用活化的药用淀粉对蚯蚓纤溶酶进行化学修饰 ,并筛选优化了化学修饰条件。其中以 1mg/ml的淀粉二醛对相同体积的酶液 (酶的比活力为 390U/mg蛋白质 ;底物为酪蛋白 )进行修饰 ,于4℃反应 2h ,制备的修饰酶效果最佳。实验结果表明 ,修饰酶的Kmapp(底物为碱性氨基酸的酯 )为 8.6 9× 10 5mg/ml,较原酶降低了近 2倍 ,修饰酶的反应最适 pH值为 8.6 ,原酶为 7.2 ;原酶和修饰酶的反应最适温度均为5 5℃。     

大鼠心肌多胺代谢限速酶ODC、SSAT活性分析

目的建立大鼠心肌多胺代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT)活性分析方法。方法以Langendorff离体灌流心肌为实验材料,制备心肌组织匀浆;分别以dl[114C]Ornithine及[114C]acetylCoenzymeA为底物,以液体闪烁计数仪记录生成的14CO2及[14C]acetylspermidine的放射活度,并以其代表ODC,SSAT的活性;计算大鼠心肌ODC、SSAT的酶促反应动力学参数,筛选出适宜的底物浓度;同时观察一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对酶活性的影响。结果①大鼠心肌ODC、SSAT基础活性分别为:(9.67±3.09)nmol·mg-1Pro·h-1;(3.59±0.91)nmol·mg-1Pro·min-1。②ODC催化LOrnithine的酶促反应动力学参数Km=(54.95±8.14)μmol·L-1;Vmax=(2.364±0.37)nmol·mg-1·h-1;SSAT催化AcetylCoenzymeA的酶促反应动力学参数Km=(12.87±1.88)μmol·L-1;Vmax=(0.50±0.07)nmol·mg-1·min-1。③大鼠心肌ODC、SSAT活性检测的底物浓度分别为:90μmol·L-1(18.5kBq)DL[114C]Ornithine及36μmol·L-1(2.96kBq)[114C]acetylCoA。④SNP呈浓度依赖性地抑制ODC的活性、诱导SSAT的活性。结论建立了大鼠心肌多胺代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶(ODC)及精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT)活性的分析方法,该方法简便易行;根据Km值确定测定大鼠心肌ODC及SSAT?     

活化C蛋白样酶的筛选与特性研究Ⅱ.分离纯化与特性研究

运用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱从蝮蛇毒中分离出活化C蛋白样酶(APCL)。经SDS-PAGE和凝胶过滤色谱检测纯度,表明该蛋白为单一组分。SDS-PAGE测得分子量为15.3k,等电聚焦法测得等电点为4.80。酶学动力学研究表明APCL水解显色肽反应的Km为3.16×10-5mol/L、Vmax为1.16×10-4mol·L-1·min-1。     

兔肾脏DDAH活性测定方法的研究

目的　建立日本大耳白家兔肾脏二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶 (DDAH)活性的检测方法。方法　空气栓塞处死正常日本大耳白家兔后 ,取出肾脏并制备匀浆 ,以非对称性二甲基精氨酸 (ADMA)为底物 ,用UV 2 6 5型分光光度计在 5 2 5nm下测定生成L 胍氨酸 (L Cit)的量 ,不同条件下比较 ,筛选最适条件 ,并计算DDAH降解ADMA的酶促反应动力学参数。结果　DDAH降解ADMA的酶促反应动力学参数为Km =(0 2 8± 0 10 )mmol·L-1,Vm =(1 36±0 4 2 )mmol·L-1·g-1·min-1。本实验选定的兔肾DDAH活性检测最适条件为 :酶蛋白浓度 12g·L-1、缓冲液最适pH7 4、ADMA终浓度 2mmol·L-1、反应时间 30min。结论　本法简便易行 ,且以Km 值作为确定酶促反应底物浓度的依据 ,有利于准确检测该酶活性     

牛肝β-D-葡萄糖醛酸苷酶的分离纯化和性质研究

采用自溶、35 %硫酸铵分部沉淀、CM 纤维素柱层析、羟基磷灰石柱层析由动物肝脏中分离纯化β D 葡 萄糖醛酸苷酶 ,获得比活 2 6 70 0U/mg的纯酶 ,活力回收率为 4 2 .8% ,纯化的酶经SDS PAGE呈单一条带。该酶以 β D 酚酞葡萄糖醛酸苷为底物的Km值为 2 .0× 10 -4mol/L ,以对硝基苯酚葡萄糖醛酸苷为底物的Km值为 2 .5× 10 -4mol/L。在 pH值 5～ 6的范围内 ,该酶的活力较高 ,最适 pH值为 5 .5 ,在pH值 5 .5时稳定性最好。在 30～ 5 0℃范围内酶活力均较稳定     

罗通定在人、比格犬和大鼠肝微粒体代谢转化的体外比较研究

目的体外研究罗通定(rotundine,RTD)在大鼠、比格犬和人肝微粒体中酶代谢动力学及代谢产物差异。方法优化3个种属肝微粒体与RTD反应体系,应用LC-MS测定RTD在3种肝微粒体中的体外代谢消除,应用LC-MS/MS分析比较RTD在3种肝微粒体中代谢产物种类和生成量的差异,计算并比较相应的活性值。结果RTD在人肝微粒体中代谢转化最慢,其相应的动力学参数为Km=2.67μmol·L-1、Vmax=0.095μmol·L-1·min-1、T21=298±18.0min、CLint=14.6±0.91ml·min-1·kg-1;大鼠中相应的动力学参数为Km=3.24μmol·L-1、Vmax=0.122μmol·L-1·min-1、T12=71.0±2.30min、CLint=87.5±2.79ml·min-1·kg-1;比格犬中相应的动力学参数为Km=5.31μmol·L-1、Vmax=0.228μmol·L-1·min-1、T21=62.3±0.647min、CLint=139±1.43ml·min-1·kg-1。RTD在3个种属肝微粒体中均代谢产生4个O-去甲基后的羟基化同分异构体产物,但4个产物的相对生成百分比在不同种属肝微粒体中有一定差异。结论罗通定在体外人、大鼠和比格犬肝微粒体中主要的I相代谢途径相同,但是酶代谢动力学性质及代谢产物的生成量存在着一定的差异。     

3T磁共振动态配准技术灌注成像在识别肝硬化结节恶变中的应用

目的 分析3.0T磁共振(MRI)动态配准技术(DynaVIBE)灌注成像(PWI)在识别肝硬化结节恶变中的应用价值.方法 选择2014年7月至2016年6月于本院拟行手术治疗且经常规MRI检查存在可疑肝硬化结节恶变的30例患者,均作DynaVIBE PWI扫描,并与病理结果进行对照.结果 癌结节血流量(BF)为(330.15±98.36) ml·min-1·ml-1、血容量(BV)为(30.45±14.26) ml/min、肝动脉灌注量(HAP)为(210.33±50.46) ml·min-1·m1-1、肝动脉灌注指数(HPI)为(0.52±0.11)均高于肝硬化结节[(149.01 ±73.12) ml· min-1· ml-1、(17.66±6.84) ml/min、(65.71±21.55) ml·min-1·ml-1、(0.26±0.05)]与不典型增生结节[(211.54±90.25)ml· min-1·ml-1、(25.33±15.32)ml/min、(145.21±30.64)ml·min-1·m1-1、(0.44±0.06)](P＜0.05),不典型增生结节上述各参数高于肝硬化结节;同时癌结节平均通过时间(MTT)、峰值时间(TTP)[(7.46±1.79)s、(25.22±1.75)s]快于肝硬化结节[(10.24±4.76)s、(39.55±1.66)s]与不典型增生结节[(8.71±2.11)s、(35.86±1.38)s](P＜0.05),而不典型增生结节MTT、TTP快于肝硬化结节(P＜0.05).结论 PWI可直接反映肝硬化结节血流灌注情况,为良恶性肝硬化结节鉴别提供依据.     

Elimination of flecainide as a function of urinary flow rate and pH

In order to evaluate the influence of urinary flow rate at different pH values on the pharmacokinetics of the basic antiarrhythmic drug flecainide 7 healthy men received 50 mg flecainide under 4 different conditions: 1. acidic urine (pH 5) and a high fluid load (125 ml.h-1) 2. acidic urine (pH 5) and a low fluid load (25 ml.h-1) 3. alkaline urine (pH 8) and a high fluid load (125 ml.h-1) 4. alkaline urine (pH 8) and a low fluid load (25 ml.h-1) At acidic pH the half-life, the amount of unchanged drug in the urine (Ae), renal clearance (CLR) and area under the curve (AUC) were independent of the fluid load. At alkaline pH Ae (5.8 vs 2.6 mg) and CLR (73 vs 33 ml.min-1) were significantly affected by fluid load (high vs low), whereas half-life and AUC were not different (15.7 vs 16.0 h, 1480 vs 1540 ng.ml-1.h). When comparing acidic and alkaline urinary pH conditions, half-life, Ae, CLR, and AUC were different. For a high fluid load the values at acidic vs alkaline pH were half-life 10.0 vs 15.7 h; Ae 15.9 vs 5.8 mg; CLR 288 vs 73 ml.min-1; AUC 976 vs 1480 ng.ml-1.h. For a low fluid load the corresponding values at acidic vs alkaline pH were half-life 10.1 vs 16.0 h; Ae 15.9 vs 2.6 mg; CLR 267 vs 33 ml.min-1; AUC 1045 vs 1540 ng.ml-1.h. It is concluded that urinary pH affects flecainide pharmacokinetics independently of urinary flow rate, and that a high flow enhances the elimination of flecainide only with an alkaline urine. This effect of flow rate does not appear to be of clinical relevance.     

ELISA法研究聚乙二醇重组人生长激素注射液单次给药人体药代动力学

目的 建立ELISA方法研究聚乙二醇重组人生长激素(PEG-rhGH)注射液单次给药人体药代动力学.方法 将30名健康受试者随机分成4组(其中两组为自身对照),分别单次皮下注射PEG-rhGH注射液(0.1 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1、0.4 mg·kg-1)、注射用重组人生长激素(rhGH)(0.067mg· kg-1).ELISA法测定不同时间点PEG-rhGH、rhGH的血药浓度,并计算药代动力学参数.结果 PEG-rhGH、rhGH血药浓度分别在0.312 5～40.0000 ng·ml-1、0.312 5～10.0000 ng· ml-1范围内线性关系良好,最低检测性均为0.312 5ng· ml-1,批间、批内RSD均＜15％. PEG-rhGH(0.1、0.2、0.4 mg·kg-1)、rhGH(0.067mg· kg-1)的t1/2分别为:(31.70±4.70)h、(32.19±4.58)h、(30.39±5.93)h、(1.95±0.44)h,Tmax为:(22.20±9.82)h、(29.40±10.75)h、(40.80±8.39)h、(3.20±1.10)h,Cmax:(105.24±45.37)ng·ml-1、(379.09±109.61)ng·m1-1、(920.69±293.21)ng·ml-1、(30.17±3.20)ng·m1-1,CL/F:(26.97±13.86) ml· kg-1· h-1、(9.21±4.05) ml· kg-1· h-1、(6.29±2.87) ml· kg-1· h-1、(284.26±43.47)ml· kg-1· h-1,AUC0→∞:(4657.70±2337.30) ng· m1-1·h、(25279.58±9407.63) ng· ml-1·h、(74438.89±29 007.81) ng·ml-1·h、(240.97±39.40) ng·ml-1·h.结论 PEG-rhGH体内过程符合线性动力学特征,与rhGH相比,明显推迟达峰时间、延长半衰期、减慢清除率,具有长效特征.     

磷酸喹哌抗实验性心律失常作用

磷酸喹哌(PQP)9mg·kg~(-1)iv明显降低小鼠室颤的死亡率;PQP 18mg·kg~(-1)ip对氯仿诱发小鼠室颤具有保护作用;PQP 6.3mg·kg~(-1)ip显著增加恒速(10mg·L~(-1)·min~(-1)滴注乌头碱引起麻醉大鼠室性早搏(VE)、室性心动过速(VT)、室性纤颤(VF)所需的乌头碱用量;PQP5.4 mg·kg~(-1)iv显著增加恒速(50mg·L~(-1)·min~(-1))滴注哇巴因引起麻醉豚鼠VE、VT和VF所需哇巴因用量;PQP3.36mg·kg~(-1)iv明显缩短肾上腺素诱发家兔室性心律失常的持续时间.结果表明PQP具有抗心律失常作用。小鼠PQPLD_(50)iv为93.33 mg·kg~(-1)。     

一种赤子爱胜蚓脱氧核糖核酸酶作用机制的研究

目的研究赤子爱胜蚓组织中脱氧核糖核酸酶1(EWD1)作用于底物的机制。方法采用ZORBAX-Oligo柱-高效液相色谱法(HPLC)、琼脂糖电泳、紫外分光光度法等分析技术,进行了蚯蚓EWD1对环状、线状DNA、单链DNA的降解中间产物和终产物的观察和分析。结果EWD1对所有形式的DNA底物均有降解作用,对单链DNA的降解产物为较均一的、<18bp的寡核苷酸,并显示EWD1无降解RNA的作用。结论蚯蚓组织中发现的EWD1能够分解多种来源的遗传物质,属于脱氧核糖核酸内切酶。     

In vitro metabolism of the epoxide substructure of cryptophycins by cytosolic glutathione S-transferase: species differences and stereoselectivity

The enzyme kinetics of the glutathione (GSH) conjugation of cryptophycin 52 (C52, R-stereoisomer) and cryptophycin 53 (C53, S-stereoisomer) by cytosolic glutathione S-transferases (cGSTs) from human, rat, mouse, dog and monkey liver were studied. Vmax, Km, and CLint values for glutathione conjugation of C52 (R-stereoisomer) were 0.10 +/- 0.01 nmol min-1 mg-1, 3.24 +/- 0.23 microM, and (3.15 +/- 0.09) x 10(-2) ml min-1 mg-1, respectively, in human cytosol. Due to limited solubility relative to the Km, only CLint values were determined in rat ((7.76 +/- 0.10) x 10-2 ml min-1 mg-1) and mouse ((7.61 +/- 0.50) x 10(-2) ml min-1 mg-1) cytosol. Enzyme kinetic parameters could not be determined for C53 (S-stereoisomer). Microsomal GSH conjugation in human, rat, and mouse was attributed to cytosolic contamination. No GSH conjugation was seen in any biological matrix from dog or monkey. There was little GSH conjugation of C53 by cytosol or microsomes from any species. The metabolism of C52 and C53 by epoxide hydrolase was also investigated. No diol product was observed in any biological matrix from any species. Thus, cGSTs are primarily responsible for C52 metabolism.     

苄普地尔消退L－甲状腺素诱发的大鼠心肌肥厚及其质膜Ca~（2＋），Mg~（2＋

研究了苄普地尔对Ｌ－甲状腺素（１ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１×７ｄ）诱发的大鼠心肌肥厚和心肌质膜Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活力增高的影响，经苄普地尔１０或２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１ｐｏ治疗３ｄ后，心肌肥厚及其升高的Ｃａ２＋，Ｍｇ２＿－ＡＴＰ酶活力和Ｖｍａｘ均降至正常，但甲状腺素引起的该酶对ＡＴＰ的亲和力降低未被苄普地尔改变。苄普地尔组左心室蛋白质含量较未治疗组亦显著减少，但未恢复至正常。结论：苄普地尔消退Ｌ－甲状腺素诱发的大鼠心肌肥厚，心肌Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活力增高和蛋白质生物合成的增加。     

Characterisation of theophylline metabolism in human liver microsomes.

1. A radiometric high performance liquid chromatographic method is described for the assay of theophylline metabolism in vitro by the microsomal fraction of human liver. 2. Formation of the three metabolites of theophylline (3-methylxanthine, 1-methylxanthine and 1,3-dimethyluric acid) were linear with protein concentrations to 4 mg ml-1 and with incubation times up to 180 min. 3. The coefficients of variation for the formation of 3-methylxanthine, 1-methylxanthine and 1,3-dimethyluric acid were 1.2%, 1% and 1.6%, respectively. 4. Theophylline is metabolised by microsomal enzymes with a requirement for NADPH. 5. The mean (n = 7) Km values for 1-demethylation, 3-demethylation and 8-hydroxylation were 545, 630 and 788 microM, respectively, and the mean Vmax values were 2.65, 2.84 and 11.23 pmol min-1 mg-1, respectively. 6. There was a high correlation between the Km and Vmax values for the two demethylation pathways suggesting that the demethylations are performed by the same enzyme. 7. Overall the in vitro studies are consistent with the in vivo results which suggest the involvement of two cytochrome P-450 isozymes in the metabolism of theophylline.