野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因Ⅱ亚型真核表达载体的构建及其功能

目的构建野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因（NF2）Ⅱ亚型的真核表达载体，观察其在人胚胎肾细胞293（HEK293）中的表达并检测其转染神经鞘瘤细胞（RT4）后的功能。方法以人胎脑cDNA文库中的NF2Ⅱ亚型基因为模板．应用聚合酶链反应技术扩增野生型NF2Ⅱ亚型基因，并定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1质粒中：经鉴定正确的重组质粒pEGFP-NF2Ⅱ亚型，用Lipofectamine2000脂质体导人人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Western Blotting法观察基因表达水平：随后转染大鼠神经鞘瘤细胞．利用水溶性四氮唑法观察野生型NF2Ⅱ亚型基因对大鼠神经鞘瘤细胞增殖的影响。结果经序列分析证实，克隆的NF2Ⅱ亚型基因与Genebank中的序列完全一致。DNA琼脂糖凝胶电泳检测显示，经双酶切后的质粒pEGFPcDNA片段大小约为4700bp：NF2Ⅱ亚型基因cDNA片段大小为l770bp，NF2Ⅱ亚型基因的真核表达载体可瞬时转染人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Westem Blotting方法得到证实；水溶性四氮唑法检测显示，转染pEGFP-NF2Ⅱ亚型并表达NF2Ⅱ亚型编码蛋白的293细胞与对照组293细胞的增殖指数相同。结论所构建的野生型NF2Ⅱ亚型基因真核表达载体可在人胚胎肾细胞293中表达，且不具有抑制肿瘤细胞增殖的特性。     

Ⅱ型神经纤维瘤基因突变型的构建及生物学功能研究

目的 构建Ⅱ型神经纤维瘤(NF2)抑癌基因546位点突变的真核表达载体,并在大鼠神经鞘瘤细胞(RT4)中诱导表达.方法 用定点突变法将pEGFP-N1-NF2第546位异亮氨酸(Ⅱe)突变为蛋氨酸(Met)从而构建NF2突变子pEGFP-N1-NF2~(△Ⅱe546Met),经酶切和测序鉴定后用脂质体法将其转染至RT4细胞,同时设pEGFP-N1-NF2转染组做为对照,Westem blot法检测细胞pEGFP-NF2蛋白的表达,MTT法检测转染后细胞的增殖情况. 结果 酶切测序证实定点突变成功,Western blot结果显示RT4细胞能表达pEGFP-NF2蛋白,pEGFP-N1-NF2~(△Ⅱe546Met)转染组RT4细胞抑制率低于pEGFP-N1-NF2转染组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了1个能够在RT4细胞中表达的单个点突变的NF2基因真核表达载体.     

LRIG2基因全长及胞外段对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2（LRIG2）基因全长及胞外段对脑胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法将LRIG2全长,LRIG2胞外段（LRIG2_ecto）及空白质粒（对照）经慢病毒法分别转染胶质瘤细胞系U251细胞,筛选稳定细胞株,实时PCR及免疫印迹法检测mRNA及蛋白表达,细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖,流式细胞分析检测细胞周期及细胞凋亡。结果两转染组Flag标签蛋白表达成功;两转染组LRIG2全长及LRIG2_ectomRNA表达较对照组明显升高（氏0．01）;两转染组细胞增殖率均明显高于对照组（P〈0．01）;两转染组s期与G2/M期细胞数之和（即细胞增殖指数）均明显高于对照组（P〈0．01）,而细胞凋亡率均明显低于对照组（P〈0．05）。结论LRIG2基因全长及LRIG2_ecto促进胶质瘤细胞增殖,并将细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞凋亡。     

IL-4基因修饰抗人脑胶质瘤效应的体外研究

目的 探讨人ＩＬ－４基因修饰对人脑胶质瘤的抑瘤效应及可能机制。方法 以逆转录病毒载体将人ＩＬ－４基因导入人脑胶质瘤细胞系ＳＨＧ４４细胞，用３Ｈ掺入法及流式细胞仪分析ＩＬ－４基因转染对人脑胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响；＾３Ｈ掺入法、＾５１Ｃｒ释放法检测ＩＬ－４基因修饰瘤苗对健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖、细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）反应的影响。结果 与野生型瘤细胞比较，ＩＬ－４基因修饰瘤细胞增     

Mdm2反义脱氧寡核苷酸抗胶质瘤的机理研究

目的探讨Mdm2反义寡核苷酸(ASODNs)对U251人胶质瘤细胞株的抗肿瘤作用。方法以Lipofectamine介导的Mdm2 ASODNs转染U251细胞,用RT-PCR检测Mdm2 mRNA的改变,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测野生型p53(wild type p53,wtp53)的表达,研究其抗肿瘤作用。结果Mdm2 ASODNs以不同浓度转染U251细胞后,Mdm2表达减少,细胞增殖抑制程度升高,细胞周期分析显示S期细胞下降,TUNEL法染色观察到明显的凋亡细胞。Western blot检测野生型p53的表达增加。结论Mdm2 ASODNs可提高野生型p53的表达,从而抑制U251细胞增殖,引起细胞周期停滞和诱导凋亡,该作用具有浓度依赖性。     

Rac1表达调控对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨Rac1基因沉默对髓母细胞瘤Daoy细胞株细胞周期、凋亡的影响.方法 将Daoy细胞分为2组:Rac1-shRNA组和对照组,Rac1-shRNA组将Rac1-shRNA质粒转染Daoy细胞,对照组则转染空白质粒.分别用RT-PCR、Western blot及流式细胞仪检测2组Daoy细胞Rac1 mRNA、Rac1蛋白、细胞周期、细胞凋亡率的变化,并进行统计学比较.结果 Rac1 mRNA和Racl蛋白在髓母细胞瘤Daoy细胞株中均有高表达;Rac1基因沉默后Daoy细胞细胞周期受阻于G0～G1期,G0～G1期细胞所占比例明显增加(80.9%±4.9%),而S期所占细胞比例减少(11.8%±2.3%);Rac1-shRNA组Daoy细胞凋亡率为36.7%±3.9%,而对照组为8.5%±0.9%.2组比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RNA干扰沉默Rac1基因可以抑制Daoy细胞增殖,促进细胞凋亡,Rac1可成为抑制髓母细胞瘤增殖并促进细胞凋亡新的靶点.     

下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨下调BAG3表达对胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养U87细胞,转染pEGFP-BAG3-shRNA质粒构建BAG3低表达胶质瘤U87细胞株（低表达组）,转染pEGFP-shRNA对照质粒为对照组;利用RT-PCR和免疫印迹法鉴定;利用CCK8和EdU检测U87细胞增殖,利用流式细胞术检测U87细胞凋亡。结果 与对照组相比,RT-PCR和免疫印迹法检测结果显示低表达组BAG3 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）,低表达组24、48、72 h细胞增殖水平均明显降低（P<0.05）,低表达组细胞凋亡率明显增高（P<0.05）。结论 下调胶质瘤U87细胞BAG3表达显著抑制其增殖、促进其凋亡。     

TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87细胞周期与增殖的影响

目的探讨金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)对人脑胶质瘤细胞的抑制作用,主要是对细胞周期与细胞增殖的作用.方法用含TIMP-2基因的重组腺病毒载体,体外转染人胶质瘤细胞系U87,用Western blot检测目的蛋白的表达.通过细胞生长实验,流式细胞仪分析技术检测U87转染前后细胞增殖、周期与凋亡的变化.结果转染AdTIMP-2病毒后的U87细胞TIMP-2蛋白表达上调,转染后对U87细胞的生长有抑制作用,并出现明显的G0 -G1 期阻滞,但无明显的细胞凋亡峰出现.结论重组腺病毒载体介导的TIMP-2基因在体外对人脑胶质瘤细胞系U87 的生长有抑制作用,可作为胶质瘤治疗的有效工具.     

MSP58基因小干扰RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的观察核微球蛋白58（MSP58）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对神经胶质瘤U251细胞的体外增殖的影响。方法体外化学合成针对MSP58基因的siRNA,脂质体法转染神经胶质瘤细胞系U251,荧光显微镜观察转染效率,逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测MSP58基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑法（MTT法）绘制细胞生长曲线,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期。结果MSP58基因的特异性siRNA转染U251细胞后,MSP58的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖受到明显抑制;流式细胞仪检测显示转染后的U251细胞G2/M期细胞明显减少（P〈0.01）,S期细胞略有减少,G1期细胞明显增加（P〈0.01）,G1期发生明显阻滞。结论MSP58基因的特异性siRNA可明显抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,并引起G1期细胞阻滞。     

siRNA沉默CD99基因表达对髓母细胞瘤DAOY细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨siRNA沉默CD99基因表达对髓母细胞瘤细胞系DAOY细胞增殖和凋亡的影响。方法 利用CD99 siRNA转染髓母细胞瘤DAOY细胞,细胞分为沉默1组（转染CD99 siRNA-1#）、沉默2组（转染CD99 siRNA-2#）、对照组（转染siRNA阴性对照）,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测沉默效果。利用CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果 沉默1组和沉默2组CD99蛋白和mRNA表达水平均明显低于对照组（P<0.05）,而沉默2组又明显低于沉默1组（P<0.01）;因此,选用CD99 siRNA-2#进行后续实验。沉默CD99基因表达后3、4、5 d,沉默2组细胞增殖水平较对照组明显降低（P<0.05）;平板克隆形成实验结果显示,沉默2组细胞克隆集落数明显减少（P<0.05）。沉默2组G0/G1期细胞百分比较对照组明显增加（P<0.05）,S期细胞、G2/M期细胞百分比明显低于对照组（P<0.05）。沉默2组细胞早期凋亡率（8.75%±1.47%）显著高于对照组（3.42%±1.21%;P<0.05）。结论 CD99基因在髓母细胞瘤DAOY细胞的增殖和凋亡中发挥重要作用,推测CD99基因可能成为治疗髓母细胞瘤的一个新靶点。     

ShRNA-AKT2对人脑胶质瘤U87细胞株增殖及凋亡的影响

目的研究通过慢病毒载体靶向抑制丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因表达对胶质瘤细胞株U87增殖、凋亡的影响。方法利用慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)干扰载体感染U87细胞株,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术(Western blot)分别检测转染后细胞株AKT2 mRNA和蛋白表达水平变化,四唑盐(MTT)法检测细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期改变。结果转染AKT2-shRNA可有效降低U87细胞株内的AKT2表达。干扰组细胞从第3 d开始增殖明显降低(P0.05);AKT2-shRNA干扰组细胞的凋亡率为11.80%±1.83%,明显高于阴性对照组的2.01%±0.20%和未转染组的2.13%±0.32%(P0.05);AKT2-shRNA干扰组细胞周期S期细胞百分比显著低于对照组,而G0/G1期细胞比分比显著高于对照组(P0.05)。结论 AKT2-shRNA可抑制胶质瘤细胞株的增殖,并导致肿瘤细胞凋亡增加。     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

下调RNF138基因对胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡及细胞周期影响的研究

目的探讨RNA干扰下调胶质瘤细胞株高表达基因RNF138对胶质瘤细胞株U251体外增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法构建下调RNF138基因的siRNA,通过慢病毒转染导入胶质瘤细胞株U251,设立阴性干扰对照组及空白对照组,荧光显微镜观察转染效率;实时荧光定量PCR检测敲减效率;运用Cellomics仪器连续检测U251体外增殖情况;流式细胞仪检测U251凋亡及细胞周期变化情况。结果慢病毒载体高效、稳定转染U251细胞,靶向RNF138的siRNA有效抑制RNF138基因表达,使RNF138mRNA表达减少60%,U251体外增殖明显减缓,凋亡明显增加,细胞阻滞在G2/M期。结论 RNA干扰抑制RNF138基因表达可以明显抑制胶质瘤细胞株U251体外增殖,促进其凋亡,影响细胞周期,阻滞细胞分裂。     

华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖及凋亡的影响

目的初步探讨华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖、细胞周期分布及凋亡的影响机制。方法利用MTT法、流式细胞仪检测华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖及细胞周期变化的影响。AO／EB染色、透射电镜观察人脑胶质瘤细胞SHG44凋亡细胞形态学的变化。Westernblot检测Bcl-2与Caspase8蛋白的表达。结果华蟾素（1μg／ml、10μg／ml）对细胞株增殖具有显著抑制作用（P〈0．05）,并呈时间和浓度依赖性。沆式细胞仪检测可见凋亡峰,Go／G。期细胞明显增多（P〈0．05）;华蟾素作用后可使Bcl-2蛋白表达降低．Caspase8蛋白表达升高。结论华蟾素可调控人脑胶质瘤细胞SHG44的周期进程,诱导Bcl-2及Caspase8差异性表达,且具有抑制肿瘤细胞增殖及促凋亡的作用。     

LRIG3基因对脑胶质瘤细胞系U87和U251的细胞周期、侵袭性和凋亡的影响

目的探讨过表达的富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因对脑胶质瘤细胞系U251和U87的细胞周期、侵袭能力和凋亡的影响。方法将过表达的LRIG3质粒(实验组)和空白质粒(对照组)经慢病毒法感染胶质瘤细胞系U251和U87,筛选稳定细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测LRIG3表达的变化,碘化丙啶染色后用流式细胞仪测定细胞周期的变化,TransWell小室法检测细胞的侵袭能力,用免疫组化原位末端标记法(TUNEL)检测各组凋亡细胞。结果与对照组相比,实验组U251与U87细胞中LRIG3mRNA水平分别上升67.6%和79.9%,蛋白表达水平分别升高62.3%和91.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组U251细胞中S期与G2/M期细胞数之和低于对照组,有统计学意义(P<0.05);但U87细胞与对照组比无明显差异。实验组U251细胞中穿出细胞数量均明显少于对照组(P<0.05),TUNEL染色结果显示对照组U251细胞凋亡率为23.4%,实验组为35.7%;对照组U87细胞凋亡率为20.2%,实验组为39.5%;对照组与实验组间凋亡率均有明显差异(P<0.05)。结论 LRIG3基因过表达能阻断细胞周期于S期和G2/M期,降低胶质瘤细胞的侵袭能力,加速细胞凋亡。     

反义miR-30a-5p抑制人脑胶质瘤细胞U87生长的体外实验研究

目的 前期发现miR-30a-5p在胶质瘤中表达明显上调,本实验探究敲低miR-30a-5p对人脑胶质瘤细胞U87细胞生物学特征的影响.方法 real-time PCR检测转染miR-30a-5p I(miR-30a-5p抑制物)后U87细胞的miR-30a-5p表达水平,流式细胞术、MTT、Transwell、Annexin V法检测细胞周期、生长、侵袭及凋亡的改变;Western blot检测相关蛋白.结果 real-time PCR结果显示miR-30a-5p I可有效降低U87细胞中miR-30a-5p表达,抑制细胞增殖活性,使细胞周期阻滞在G0/G1期,侵袭能力明显受抑,凋亡增加,促增殖蛋白PCNA、促细胞周期进展蛋白Cyclin D1及促侵袭蛋白MMP-9的表达明显下调,而抑制侵袭蛋白TIMP-1及凋亡相关蛋白p53表达明显上调.结论 敲低U87细胞的miR-30a-5p表达可抑制胶质瘤的增殖及侵袭,诱导凋亡;miR-30a-5p可成为人脑胶质瘤基因治疗的潜在候选靶点.

Abstract：

Objective Our previous study had shown that there was overexpression of miR- 30a- 5p in malignant glioma cell lines.In the present study, we aim to investigate the effect of knocking -down miR -30a -5p on the biological characteristics of U87 glioblastoma cells.Method The U87 cells were divided into three groups:control cells,cells transfected with scramble oligonucleotides and cells transfected with miR -30a -5p inhibitors(miR-30a-5p I).Oligonucleotides mediated by lipofectamine were transfected to U87 cells.Real -time PCR was conducted to detect the expression of miR- 30a -5p in transfected cells.The cell proliferation was determined by 3- (4,5- Dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometry.The cell invasion was evaluated by Transwell assay and cell apoptosis was detected with Annexin V staining Moreover, the relevant molecules regulating proliferation, invasion, cell cycle progression and apoptosis were examined by Western blot analysis.Results The expression of miR - 30a - 5p in the cells transfected with miR - 30a - 5p I was significantly reduced.The cell proliferation activity of U87 cell was inhibited.The cell cycle was arrested in G0/G1 phase, cell invasive ability was attenuated and apoptotic cells were increased in cells transfected with miR -30a -5pI as compared to those of the cells transfected with scrambled siRNA and control cells.The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), matrix metallopeptidase 9 ( MMP - 9) and Cyclin D1 were downregulated while the tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP - 1 ) and p53 were upregulated.Conclusions Transfection of miR - 30a-5p I into glioma cells could inhibit the proliferation activity and invasive ability of U87 cell and induce cell apoptosis, miR -30a -5p is a potential target of gene therapy for glioma.     

反义miR-21通过调控hTERT表达抑制胶质瘤细胞生长

目的探讨敲低miR-21表达对人胶质瘤细胞系U87细胞功能的影响以及相关作用机制。方法脂质体介导转染miR-21反义寡聚核苷酸（miR-21 inhibitor）敲低U87细胞miR-21的表达。使用实时荧光定量PCR鉴定转染后U87细胞miR-21表达水平;MTT法检测转染后细胞增殖水平,流式法评价转染后细胞周期分布及凋亡变化,并结合Western印迹及RT-PCR验证在U87细胞中miR-21和hTERT间关系。结果体外转染反义miR-21寡聚核苷酸能明显抑制U87细胞生长,诱导其凋亡,并且能够明显下调hTERT表达。结论反义miR-21可能通过下调hTERT表达抑制胶质细胞生长,miR-21可作为胶质瘤基因治疗的靶点。