抑制VEGF表达的锤头状核酶系统

目的:建立和评估抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)技术系统.方法:对VEGF121基因RNA序列进行二级结构分析,选择靶点;设计并构建针对VEGF的分泌肽RNA的可表达锤头状核酶(14)载体系统和VEGF-荧光色素酶融合基因报告质粒;通过试管内切割实验等方法评估核酶对于试管内转录得到的VEGF RNA切割特异性和效率;通过瞬时共转染实验和稳定转染实验评估核酶在细胞内对于VEGF RNA的切割效率.结果:设计和构建了对VEGF RNA二级结构水平上的暴露区( 8, 36和 71位点:核酶1,3和4)和非暴露区( 17位点:核酶2)4个锤头状核酶(14)的两套质粒;试管内切割检测表明,针对 8, 36和 71位点的核酶(1,3和4)可以有效地在试管内对VEGFRNA进行特异性切割,使其水平分别降至对照的61.7%,27.6%和44.8%(荧光色素酶活性)或66.3%,27.0%和30.0%(蛋白质水平);将核酶表达质粒与VEGF-LUC模板质粒瞬时共转染人SMMC-7721肝癌细胞,核酶1,3和4 VEGF-LUC水平分别降低到对照的81.4%,56.6%和69.1%;稳定表达针对VEGF的核酶1,3或4的SMMC-7721细胞株中,内源性VEGF RNA的水平降至对照水平的5%以下.对照未转染的、转染空载体的和转染了核酶2( 17)的SMMC-7721细胞.结论:分别针对VEGF 8, 36和 71位点锤头状核酶可有效地抑制VEGF的RNA水平.     

抗 VEGF发夹状核酶基因抑制 VEGF表达及卵巢癌细胞增殖的实验研究

背景与目的:研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在与上皮性卵巢癌有关的血管形成过程中可能发挥着重要作用.目前,核酶策略已成为一种基因治疗的策略,用于阻断肿瘤形成或肿瘤的生长与转移.VEGF在卵巢肿瘤形成中的作用尚不十分清楚.我们试图采用抗 VEGF发夹状核酶基因阻断卵巢癌中 VEGF的自分泌和 /或旁分泌通路,以检测其对卵巢癌细胞增殖的影响.方法:采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗 VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌 SKOV3细胞,采用 G418筛选获得阳性克隆 ; RNA斑点杂交检测核酶基因在卵巢癌细胞中的表达 ; 免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后卵巢癌细胞中 VEGF表达 ; 通过 MTT、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响.结果:与 SKOV3细胞相比,转染后的 SKOV3-RZ细胞 VEGF表达明显降低(P< 0.01); 细胞生长减慢,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 [(12.7± 1.4)% 和(9.4± 2.0)% 比(30.1± 1.9)% 和(24.8± 1.5)%,P< 0.001];G1期细胞显著增多(77.6% 比 57.9%,P< 0.01),S期细胞显著减少(17.0% 比 29.9%,P< 0.01). 结论:抗 VEGF发夹状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞 SKOV3增殖 ; 本研究为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗提供了实验依据.     

恩度诱导抑制性VEGFA选择性剪切异构体VEGF165b的表达及其意义

目的:探讨重组人血管内皮抑制素(恩度)对人肝癌细胞SMMC-7721VEGF165b表达的影响,及上调VEGF165b表达后,SMMC-7721对恩度敏感性的变化.方法:采用RT-PCR法和蛋白质印迹法检测恩度干预SMMC-7721后VEGF165b的表达变化;稳定转染VEGF165b真核表达质粒到SMMC-7721,RT-PCR和免疫细胞荧光共聚焦显微镜检测VEGF165b、HIF-1α和下游靶基因VEGFA表达的变化;MTT法检测恩度对人肝癌细胞生长抑制率的影响.结果:100和400 μg/mL恩度能够诱导VEGF165bmRNA和蛋白表达上调,而外源性VEGF165b下调HIF-1α及下游靶基因VEGFA的表述.转染空质粒后,500和1000μg/mL恩度引起SMMC-7721的生长移植率分别为1.6%和0.4%,转染VEGF165b后,500 μg/mL和1000 μg/mL恩度引起的生长移植率分别为8.5%(P=0.000 0)和20.2%(P=0.000 0).结论:恩度抗肿瘤新生血管的作用部分是通过上调VEGF165b介导的,VEGF165b增加SMMC-7721细胞对恩度的敏感性,两者治疗肿瘤有协同作用.     

抗VEGF发夹状核酶基因对人鼻咽癌细胞株VEGF表达及细胞增殖的影响

目的 探讨抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因对人鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE—2的VEGF表达及其细胞增殖的影响。方法 采用脂质体介导法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染CNE-2细胞；RNA斑点杂交检测核酶基因在CNE-2细胞中的表达；免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后CNE-2细胞中VEGF表达；MTT法、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及流式细胞仪进行细胞周期分析，观察其对CNE-2细胞增殖的影响。结果 转染后的CNE—2细胞VEGF表达明显降低；细胞生长减慢，细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低；Go／G1期细胞显著增多，S期细胞显著减少（P〈0．01）。结论 抗VEGF发央状核酶基因可显著抑制CNE-2细胞的VEGF表达和ENE-2细胞增殖。     

人血管内皮生长因子shRNA对小鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射,观察对其生长影响.方法:使用VEGF shRNA 真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,观察VEGF shRNA 真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射后负瘤的生长变化.结果:VEGF shRNA大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,裸鼠的负瘤生长速度变慢.结论:VEGF shRNA可明显使裸鼠的负瘤生长速度变慢,为将VEGF shRNA 真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据.     

抗血管内皮生长因子发卡状核酶基因抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖

 目的　观察抗VEGF发卡状核酶基因对卵巢癌细胞增殖的影响。方法　采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗VEGF发卡状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌细胞 ,通过MTT、细胞贴壁克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响。结果　转染后的SKOV3 RZ细胞生长减慢 ,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 (P <0 .0 0 1)。G1期细胞显著增多 (P <0 .0 1) ,S期细胞显著减少 (P <0 .0 1)。结论　抗VEGF发卡状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖 ,为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗提供了实验依据     

人血管内皮生长因子shRNA对小鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的：使用VEGF shRNA真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射,观察对其生长影响。方法：使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,观察VEGF shRNA真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射后负瘤的生长变化。结果：VEGF shRNA大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,裸鼠的负瘤生长速度变慢。结论：VEGF shRNA可明显使裸鼠的负瘤生长速度变慢,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

人参皂苷Rg3抗人肝癌细胞株侵袭和转移的实验研究

目的:探讨人参皂苷Rg3抗人肝癌细胞侵袭和转移的作用及其相关机制。方法:选择人类肝癌细胞株SMMC-7721细胞和建株人脐静脉内皮细胞株ECV304作为研究对象,通过细胞抑制实验(MTT法)、细胞粘附试验和免疫组化方法系统地观察人参皂苷Rg3体外对SMMC-7721细胞及ECV304细胞生长的抑制作用、SMMC-7721细胞与纤维粘连蛋白(FN)粘附以及表达nm23、CD44、VEGF基因蛋白的影响。结果:人参皂苷Rg3能够显著地抑制肝癌细胞株SMMC-7721细胞及内皮细胞株ECV304的生长,抑制SMMC-7721细胞与FN粘附及CD44、VEGF的表达,而增强nm23基因的表达。结论:人参皂苷Rg3具有抗人肝癌细胞侵袭和转移的作用,机制可能与其能够抑制肝癌细胞侵袭活力、调节与肝癌细胞侵袭与转移密切相关的基因表达和抗肿瘤血管形成有关。     

人剪切修复基因XPD转染对人肝癌细胞SMMC-7721的生物学影响

目的 将人剪切修复基因XPD稳定转染人SMMC-7721肝癌细胞,观察转染后细胞内野生型p53、XPD、周期素依赖性蛋白激酶(CDK)7、c-myc等基因表达的变化以及对细胞生长的影响,探讨野生型XPD基因与p53、CDK7、c-myc的相互作用及细胞凋亡机制.方法 将表达绿色荧光蛋白并含有人类全长野生型XPD的pEGFP-N2-XPD重组体质粒稳定转染人SMMC-7721肝癌细胞中,选择培养基筛选单克隆稳定转染重组质粒的人SMMC-7721肝癌细胞(SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD)和稳定转染空载质粒的人SMMC-7721肝癌细胞(SMMC.7721-pEGFP-N2),并将人SMMC-7721肝癌细胞作为空白对照,利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westem blot法检测转染XPD基因后细胞内XPD、p53、CDK7、c-myc的表达量变化,并用细胞增殖力检测(MTT)法及流式细胞仪分别检测细胞增殖及凋亡和细胞周期变化.结果 ①免疫荧光显微镜下,SMMC.7721.pEGFP.N2.XPD和SMMC-7721-pEGFP-N2细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明pEGFP-N2-XPD重组质粒和pEGFP-N2空载质粒成功转染.②RT-PCR检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD中p53 mRNA、XPD mR-NA表达量与SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721相比均明显增高(P<0.01),CDK7 mRNA、c-myc mRNA在SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD的表达量比两对照组明显降低(P<0.01),而两对照组各个基因的表达没有明显差异(P>0.05).③Western blot检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞的p53、XPD蛋白表达最较两对照组升高(P<0.01),CDK7、c-myc的蛋白相对表达量比两对照组降低(P<0.01),两对照组差异没有统计学意义(P>0.05).④M1Tr检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD的细胞增殖力较对照组减弱(P<0.05),两对照组筹异没有统计学意义(P>0.05).⑤流式细胞仪检测:SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞进入s期出现障碍,停滞在G1期的细胞增多.结论 将XPD成功稳定转染到人SMMC-7721肝癌细胞中,XPD、p53在转录和蛋白水平的表达明显升高,CDK7、c-myc表达明显降低,野生型XPD基因的过表达可能抑制CDK7、c-myc表达,改变细胞周期,并促进p53抑制肝癌细胞增长,促进细胞凋亡.     

牛蒡子苷元对肿瘤血管生成抑制作用的观察

目的:观察牛蒡子苷元(ARG)对裸鼠体内、体外肿瘤血管生成的影响,并探讨其作用机制。方法:利用人肝癌SMMC-7721细胞进行体内、外实验。体外实验分别采用RT-PCR、细胞免疫组化检测ARG作用前后SMMC-7721细胞中血管内皮生长因子(VEGF)基因及蛋白的表达;体内实验建立裸鼠SMMC-7721细胞肺转移瘤模型,成瘤后ARG干预,第30天取出肿瘤组织,免疫组化检测裸鼠瘤体CD34标记的血管内皮细胞,计算微血管密度(MVD)。结果:VEGF mRNA表达量经ARG及5-FU作用后,阴性对照组、3个药物组及阳性对照组依次为1.01±0.03、0.92±0.02、0.81±0.15、0.72±0.03和0.82±0.26;实验组VEGF蛋白表达率为44.16%,明显低于对照组的82.13%。ARG作用后VEGF mRNA及蛋白表达水平下降,P<0.05。裸鼠SMMC-7721细胞肺转移瘤的MVD减少,空白对照组、药物组和5-FU组裸鼠MVD值分别为39.43±3.31、19.29±2.06和21.57±2.82,P<0.01。结论:ARG通过下调裸鼠VEGF mRNA及蛋白的表达,抑制裸鼠SMMC-7721细胞肺转移瘤的血管生成。     

Synergistic tumor suppression by adenovirus-mediated inhibitor of growth 4 and interleukin-24 gene cotransfer in hepatocarcinoma cells

Inhibitor of growth 4 (ING4) is a novel member of ING tumor suppressor family and has apparent tumor-suppressive effect. Interleukin-24 (IL-24) as a unique cytokine-tumor suppressor displays ubiquitous antitumor property and tumor-specific killing activity. Multigene-based combination therapy may be an effective practice in cancer gene therapy. The therapeutic potential of a conjunction of ING4 and IL-24 for cancers is still elusive. This study evaluated the combined effect on SMMC-7721 and HepG2 human hepatocarcinoma cells by adenovirus-mediated ING4 and IL-24 coexpression (Ad-ING4-IL-24) and also elucidated its underlying molecular mechanism. It was demonstrated that Ad-ING4-IL-24 induced synergistic growth inhibition, apoptosis, invasion suppression, as well as an enhanced effect on upregulation of P21, P27, Fas, FasL, FADD, Bad, Bax, Bak, cleaved Bid, cleaved Caspase-8, -9, and -3, and cleaved PARP, downregulation of Bcl-2, Bcl-X(L), matrix metalloproteinase (MMP)-2, 9, vascular endothelial growth factor (VEGF), IL-8, CD34, and microvessel density, and cytochrome c release from mitochondria into cytosol in in vitro SMMC-7721 and HepG2 hepatocarcinoma cells and/or in vivo SMMC-7721 hepatocarcinoma subcutaneous xenografted tumors in athymic nude mice. The in vitro and in vivo synergistic antitumor activity elicited by Ad-ING4-IL-24 was closely associated with the cooperative activation of extrinsic and intrinsic apoptotic pathways and reduced proangiogenic factors' production of VEGF and IL-8, leading to synergistic inhibition of tumor angiogenesis. Thus, results indicate that cancer gene therapy combining two or more tumor suppressors such as ING4 and IL-24 may constitute a novel and effective therapeutic strategy for hepatocarcinoma and other cancers.     

Ａｄ-ＩＮＧ４抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长的体内实验研究

目的　研究携带ＩＮＧ４基因的重组腺病毒（Ａｄ-ＩＮＧ４）对人肝癌细胞株ＳＭＭＣ-７７２１移植瘤生长的抑制作用及其潜在的分子机制。方法　将扩增的Ａｄ-ＩＮＧ４感染ＳＭＭＣ-７７２１细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测Ａｄ-ＩＮＧ４在ＳＭＭＣ-７７２１细胞中的转录。用ＳＭＭＣ-７７２１细胞建立裸鼠人肝癌移植瘤模型,予Ａｄ-ＩＮＧ４（１×１０^９ｐｆｕ／ｍｌ）５０μｌ对移植瘤瘤体注射治疗,观察肿瘤生长变化;３周后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重;免疫组化法检测ｐ２１、ＣＯＸ-２、Ｆａｓ、Ｂｃｌ-２、Ｂａx、Ｃａｓｐａｓｅ-３、ＶＥＧＦ、ＣＤ３４等因子的表达。结果　Ａｄ-ＩＮＧ４在ＳＭＭＣ-７７２１细胞中成功表达;Ａｄ-ＩＮＧ４对裸鼠人肝癌移植瘤有明显的生长抑制作用,Ａｄ-ＩＮＧ４组瘤体显著减小（Ｐ＜０.０１）,抑瘤率达４１.６４％;免疫组化检测显示,Ａｄ-ＩＮＧ４抑癌的分子机制可能与上调ｐ２１、Ｆａｓ、Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ-３的表达及下调ＣＯＸ-２、Ｂｃｌ-２、ＶＥＧＦ和ＣＤ３４的表达有关。结论　Ａｄ-ＩＮＧ４能有效抑制ＳＭＭＣ-７７２１裸鼠人肝癌移植瘤的生长,其机制可能通过抑制肿瘤细胞生长、血管形成和激活细胞凋亡等多个途径共同发挥抑癌效应。     

腺病毒介导VEGF-siRNA对荷人骨肉瘤裸鼠移植瘤生长的影响

目的:观察腺病毒介导的VEGF-siRNA对荷人骨肉瘤细胞株MG63裸鼠移植瘤生长的影响。方法:将Ad-VEGF-siRNA感染MG63,用噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)法检测细胞体外增殖活力,反转录-聚合酶链反应(reverse transeription-poly-merase chain reaction,RT-PCR)法检测VEGF抑制效果。建立裸鼠移植瘤模型,定期瘤内注射Ad-VEGF-siRNA,观察裸鼠致瘤率、肿瘤体积、抑瘤率及免疫组化法检测肿瘤组织中bcl-2的表达。结果:感染Ad-VEGF-siRNA能明显抑制MG63细胞的生长,瘤灶内注射Ad-VEGF-siRNA后裸鼠移植瘤的质量和体积均显著低于对照组(P<0.01)。TUNEL染色显示肿瘤细胞凋亡增加,免疫组化结果提示肿瘤组织中bcl-2表达明显减少(P<0.01)。结论:Ad-VEGF-siRNA可有效而特异地阻断VEGF基因表达,抑制裸鼠移植瘤生长,促进肿瘤细胞的凋亡。     

Enhanced antitumor activity by combining an adenovirus harboring ING4 with cisplatin for hepatocarcinoma cells

The inhibitor of growth (ING) family proteins have been defined as candidate tumor suppressors. ING4 as a novel member of the ING family has potential tumor-suppressive effects. In this study, we explored the combined effect of adenovirus-mediated ING4 (Ad-ING4) gene transfer plus chemotherapy drug cisplatin (CDDP) on SMMC-7721 human hepatocarcinoma cells in vitro and in vivo, and its underlying mechanism. We demonstrated that Ad-ING4 plus CDDP induced synergistic growth inhibition, enhanced apoptosis, and had an additive effect on upregulation of Fas, Bax, Bak, cleaved Bid, cleaved caspase-8, caspase-9, caspase-3 and cleaved PARP, and on downregulation of Bcl-2 and Bcl-X(L) in SMMC-7721 hepatocarcinoma cells. Moreover, Ad-ING4 plus CDDP synergistically suppressed in vivo SMMC-7721 hepatocarcinoma subcutaneous (s.c.) xenografted tumor growth and reduced tumor vessel CD34 expression and microvessel density (MVD) in athymic nude mice. Most importantly, Ad-ING4 plus CDDP did not have overlapping toxicities in HL-7702 normal human liver cells and normal liver tissues of mice. The in vitro and in vivo enhanced antitumor effect elicited by Ad-ING4 plus CDDP was closely associated with the cooperative regulation of extrinsic and intrinsic apoptotic pathways and synergistic inhibition of tumor angiogenesis. Thus, our results indicate that Ad-ING4 plus CDDP is a potential combined treatment strategy for hepatocarcinoma.     

表达抗-VEGF发夹状核酶腺病毒载体的构建及其对结肠癌生长的抑制作用

背景与目的：VEGF过表达提示结肠癌预后不良。本实验构建带有抗-VEGF发夹状核酶的复制缺陷型腺病毒，观察其对结肠癌VEGF表达及肿瘤生长的抑制作用。方法：将人工合成的抗-VEGF发夹状核酶DNA定向克隆至转移质粒pAdTrack—CMV多克隆位点，然后与病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中重组，在293a细胞中包装成完整病毒（命名为Ad-Rz）并复制扩增、纯化。RT-PCR检测病毒感染后抗-VEGF发夹状核酶在HT-29细胞中的表达、real-time PCR及ELISA检测其对VEGF mRNA及蛋白表达的抑制作用。观察Ad-Rz对HT-29细胞和裸鼠移植瘤生长的抑制作用，CD34标记检测肿瘤组织微血管密度（MVD）。结果：抗-VEGF发夹状核酶成功克隆至复制缺陷型腺病毒载体上。抗-VEGF发夹状核酶可在HT-29细胞中表达．Ad—Rz感染的HT-29细胞中VEGFmRNA的相对表达量大约为PBS组的45％（e〈0．05）。ELISA结果显示Ad—Rz感染后的细胞上清液中蛋白含量（A值）为0．455±0．35／百万细胞，低于PBS组（P〈0．05）。Ad—Rz对HT-29细胞的生长抑制无统计学意义（P〉0．05），但可显著抑制肿瘤组织内血管的形成（P〈0．05），Ad—Rz治疗的移植瘤增殖率低于PBS组，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：腺病毒载体介导的抗-VEGF发夹状核酶可有效抑制HT-29细胞VEGF的表达及移植瘤组织内血管的生成。     

AFP对裸鼠肝癌移植瘤生长的促进作用及对血管形成相关因子的影响

目的:探讨AFP对肝癌移植瘤生长及血管生成调节因子表达的影响。方法:采用pEGFP-N1-AFP和pEGFP-N1质粒分别转染SMMC-7721细胞构建SMMC-7721/AFP和SMMC-7721/CON细胞,将裸鼠分为实验组和对照组,分别于裸鼠皮下接种SMMC-7721/AFP和SMMC-7721/CON,从而建立人肝癌移植瘤模型,动态观测裸鼠肿瘤体积和质量变化;取肿瘤组织用实时定量RT-PCR和Western blot检测组织中的HOXA7、eIF4E、VEGFA和FGF2表达。结果:构建SMMC-7721/AFP和SMMC-7721/CON细胞,并将其接种到裸鼠皮下成功建立肝癌移植瘤模型。与对照组比较,实验组移植瘤体积与质量显著增高,成瘤后第12天,实验组移植瘤体积和质量分别为（307.71±47.63）mm3和（20.243±0.411）g,差异均具有显著性（P=0.012,P=0.04）。实时定量RT-PCR结果显示AFP过表达提高了肝癌移植瘤细胞HOXA7、eIF4E和FGF2 mRNA表达水平,分别为2.488±1.155、23.828±2.465和4.407±1.164,与对照组相比增高程度具有显著性差异,但VEGFA mRNA表达未见显著增强。Western blot结果显示:SMMC-7721/AFP较SMMC-7721/CON细胞显著提高HOXA7蛋白表达水平,但对FGF2和VEGFA无显著影响。结论:AFP基因转染可明显促进裸鼠肝癌移植瘤的生长,该作用可能与其促进肿瘤血管形成因子在mRNA水平的调控有关。     

膜型基质金属蛋白酶-1上调人乳腺癌细胞血管内皮生长因子的表达并诱导肿瘤血管新生

目的 研究膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)在肿瘤血管新生过程中的作用,探讨其诱导肿瘤血管新生的作用途径.方法 应用基因转染方法 ,将MT1-MMP导入人乳腺癌细胞系MCF-7细胞;应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光染色,比较转染前后肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化;通过裸鼠异种移植瘤模型,检测MT1-MMP对肿瘤生长速度、肿瘤组织微血管密度(MVD)和VEGF表达的影响.结果 在MT1-MMP稳定转染后的MCF-7细胞中,VEGF189、VEGF165和VEGF121 mRNA表达水平显著上调(P＜0.001).免疫荧光检测结果 显示,MT1-MMP组的VEGF蛋白免疫荧光强度为93.8±10.3,明显强于MCF-7组(42.9±5.3)和pcDNA3.1组(41.0±5.4,P＜0.001).裸鼠异种移植瘤模型结果 显示,MTI-MMP能够加快肿瘤生长速度.肿瘤组织MVD检测结果 显示,MT1-MMP能够显著提高肿瘤组织的MVD(P＜0.05).免疫组织化学染色结果 显示,VEGF在MT1-MMP组呈强阳性表达.结论 MT1-MMP能够通过上调肿瘤细胞VEGF表达水平而有效诱导肿瘤血管新生.MT1-MMP的这一作用途径可能为临床抗肿瘤研究及抗肿瘤药物开发提供新思路.     

转染抗VEGF发夹状核酶基因白血病细胞模型的建立

 目的 建立转染抗血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶基因的白血病细胞模型,探讨发夹状核酶对白血病细胞系K562 VEGF基因表达的效应。方法 采用脂质体介导的方法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体（pcDNA3-RZ）转染入人白血病细胞系K562,G418抗性筛选获得阳性克隆,转染VEGF pcDNA3-RZ和空载体（pcDNA3）的细胞组均有抗性细胞生长,分别命名为K562-RZ和K562-PC;抽提基因组DNA,用PCR方法验证核酶基因已转染入K562细胞,荧光定量PCR和western blot方法分别检测白血病细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量;同时测定K562-RZ,K562-PC和 K562三组培养上清刺激内皮细胞生长的情况。结果 抗VEGF pcDNA3-RZ成功转入白血病细胞系K562,G418筛选2周获得阳性克隆,PCR检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组DNA;与K562及K562-PC细胞相比,转染VEGF核酶基因的K562-RZ细胞VEGF mRNA和蛋白的表达量明显降低;K562-RZ组培养上清对内皮细胞的刺激作用明显弱于K562-PC组。结论 建立了转染VEGF发夹状核酶基因的白血病细胞模型,抗VEGF发夹状核酶基因可明显下调白血病细胞VEGF的表达,为抗肿瘤治疗提供了新的线索。