抗血管内皮生长因子发卡状核酶基因抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖

 目的　观察抗VEGF发卡状核酶基因对卵巢癌细胞增殖的影响。方法　采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗VEGF发卡状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌细胞 ,通过MTT、细胞贴壁克隆形成试验、软琼脂克隆形成试验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响。结果　转染后的SKOV3 RZ细胞生长减慢 ,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 (P <0 .0 0 1)。G1期细胞显著增多 (P <0 .0 1) ,S期细胞显著减少 (P <0 .0 1)。结论　抗VEGF发卡状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖 ,为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗提供了实验依据     

抗 VEGF发夹状核酶基因抑制 VEGF表达及卵巢癌细胞增殖的实验研究

背景与目的:研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在与上皮性卵巢癌有关的血管形成过程中可能发挥着重要作用.目前,核酶策略已成为一种基因治疗的策略,用于阻断肿瘤形成或肿瘤的生长与转移.VEGF在卵巢肿瘤形成中的作用尚不十分清楚.我们试图采用抗 VEGF发夹状核酶基因阻断卵巢癌中 VEGF的自分泌和 /或旁分泌通路,以检测其对卵巢癌细胞增殖的影响.方法:采用脂质体介导的方法将自行设计和构建的抗 VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染人卵巢癌 SKOV3细胞,采用 G418筛选获得阳性克隆 ; RNA斑点杂交检测核酶基因在卵巢癌细胞中的表达 ; 免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后卵巢癌细胞中 VEGF表达 ; 通过 MTT、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响.结果:与 SKOV3细胞相比,转染后的 SKOV3-RZ细胞 VEGF表达明显降低(P< 0.01); 细胞生长减慢,细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低 [(12.7± 1.4)% 和(9.4± 2.0)% 比(30.1± 1.9)% 和(24.8± 1.5)%,P< 0.001];G1期细胞显著增多(77.6% 比 57.9%,P< 0.01),S期细胞显著减少(17.0% 比 29.9%,P< 0.01). 结论:抗 VEGF发夹状核酶基因可显著抑制卵巢癌细胞 SKOV3增殖 ; 本研究为进一步开展肿瘤血管靶向基因治疗提供了实验依据.     

VEGF特异性核酶对Hela细胞VEGF表达的调节

目的：构建VEGF特异性发夹状核酶基因真核表达载体，观察其对Lela细胞VEGF表达的调节。方法：将核酶基因克隆入pcDNA3中，构建了抗VEGF发夹状核酶真核表达载体pcDNA3-RZ,并进行了核酶的体外切割活性检测。将真核表达载体转染人宫颈癌Hela细胞，采用RNA斑点杂交、流式细胞仪免疫荧光及免疫细胞化学方法，检测Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平。结果：所构建的重组表达载体pcDNA3-RZ正确，体外切割检测该核酶具有较高的切割活性。转染了pcDNA-RZ的Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平明显下降。结论：成功地构建了抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体，该载体能明显抑制Hela细胞VEGF的表达。     

抑制VEGF表达的锤头状核酶系统

目的:建立和评估抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)技术系统.方法:对VEGF121基因RNA序列进行二级结构分析,选择靶点;设计并构建针对VEGF的分泌肽RNA的可表达锤头状核酶(14)载体系统和VEGF-荧光色素酶融合基因报告质粒;通过试管内切割实验等方法评估核酶对于试管内转录得到的VEGF RNA切割特异性和效率;通过瞬时共转染实验和稳定转染实验评估核酶在细胞内对于VEGF RNA的切割效率.结果:设计和构建了对VEGF RNA二级结构水平上的暴露区( 8, 36和 71位点:核酶1,3和4)和非暴露区( 17位点:核酶2)4个锤头状核酶(14)的两套质粒;试管内切割检测表明,针对 8, 36和 71位点的核酶(1,3和4)可以有效地在试管内对VEGFRNA进行特异性切割,使其水平分别降至对照的61.7%,27.6%和44.8%(荧光色素酶活性)或66.3%,27.0%和30.0%(蛋白质水平);将核酶表达质粒与VEGF-LUC模板质粒瞬时共转染人SMMC-7721肝癌细胞,核酶1,3和4 VEGF-LUC水平分别降低到对照的81.4%,56.6%和69.1%;稳定表达针对VEGF的核酶1,3或4的SMMC-7721细胞株中,内源性VEGF RNA的水平降至对照水平的5%以下.对照未转染的、转染空载体的和转染了核酶2( 17)的SMMC-7721细胞.结论:分别针对VEGF 8, 36和 71位点锤头状核酶可有效地抑制VEGF的RNA水平.     

抗VEGF发夹状核酶基因对人鼻咽癌细胞株VEGF表达及细胞增殖的影响

目的 探讨抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因对人鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE—2的VEGF表达及其细胞增殖的影响。方法 采用脂质体介导法将抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体转染CNE-2细胞；RNA斑点杂交检测核酶基因在CNE-2细胞中的表达；免疫组化、间接免疫荧光染色及流式细胞仪结合免疫荧光检测转染前后CNE-2细胞中VEGF表达；MTT法、细胞贴壁克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及流式细胞仪进行细胞周期分析，观察其对CNE-2细胞增殖的影响。结果 转染后的CNE—2细胞VEGF表达明显降低；细胞生长减慢，细胞贴壁克隆形成及软琼脂克隆形成率明显降低；Go／G1期细胞显著增多，S期细胞显著减少（P〈0．01）。结论 抗VEGF发央状核酶基因可显著抑制CNE-2细胞的VEGF表达和ENE-2细胞增殖。     

抗VEGF165核酶对人肺腺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨抗血管内皮生长冈子165(VEGF165)核酶对人肺腺癌细胞生物学特性的影响。方法设计合成针对VEGF165 212位点的锤头状核酶(vascular endothelial growth factor ribozyme，VRZ)及其突变体(mutant VRz，mVRz)，体外检测核酶的剪切活性。采用亚克隆技术，构建腺病毒介导的抗VEGF165核酶真核表达载体pAdVRz，用重组腺病毒感染人肺腺癌细胞A549，分别采用Northern blot印迹杂交、流式细胞仪、透射电镜和激光共聚焦等技术，观察感染前后A549细胞的生物学性状的改变。结果成功地合成了具有明显剪切活性的抗VEGF165核酶VRz及其重组腺病毒表达载体rpAdVRz，并在A549细胞中获得表达。重组腺病毒感染细胞的VEGF165表达减少了87％，而生物学性状不受外源基因表达的影响。结论抗VEGF165核酶能够显著抑制人肺腺癌细胞内VEGF165的表达，为进一步进行肺癌的抗血管治疗提供了实验基础。     

反义VEGF硫代寡脱氧核苷酸抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长的研究

目的 :检测硫代修饰的反义脱氧寡核苷酸 (ASPODN)抑制人肝癌血管形成和生长的作用 ,以探讨ASPODN的临床应用前景。方法 :传代培养的肝癌细胞系HepG2 ,接种于裸鼠颈背部皮下 ,自 4 8h始局部注射ASPODN和等量的PBS ,彩色多普勒能量图 (CDE)检测移植瘤内新生血管的数目和分布 ;LSAB法免疫组化染色检测移植瘤中微血管密度 (MVD) ;FCM分析裸鼠移植瘤细胞周期动力学和凋亡率。结果 :局部注射ASPODN组和PBS对照组 ,裸鼠人肝癌移植瘤瘤重及MVD平均值分别为 ( 1.2 8±0 .2 6)g、2 6.90± 7.4 2和 ( 3.4 6± 0 .86)g、50 .36± 10 .2 7(P <0 .0 1) ;局部注射ASPODN组 ,用CDE动态检测到移植瘤内的血管数目及血流丰富程度明显低于PBS组P <0 .0 1;经ASPODN治疗后的裸鼠人肝癌移植瘤细胞凋亡率 ( 7.4 8± 1.64) %高于PBS对照组 ( 2 .75± 0 .2 2 ) % (P <0 .0 1)。结论 :VEGFAS PODN明量抑制肝癌血管形成和生长 ,有望成为理想的抗肝癌血管生成基因治疗的新药     

Bevacizumab抑制高转移性人肝癌原位移植瘤的淋巴管形成

目的：探讨Bevacizumab抑制肝癌淋巴管形成及抑制肿瘤生长的作用。方法：建立LCI-D20高转移潜能肝癌组织原位移植裸鼠模型,给予治疗剂量的Bevacizumab并设对照组。28d后处死裸鼠,测量肿瘤负荷,免疫组织化学方法检测肿瘤组织微淋巴管密度(lymphatic microvessel density,LMVD)。结果：Bevacizumab治疗组肿瘤负荷低于对照组,统计学上具有显著性差异(P＜0.001)；Bevacizumab治疗组肿瘤内LMVD亦低于对照组,有统计学显著性意义(P＜0.001)。结论：动物实验中,Bevacizumab可有效地抑制肝癌细胞生长和淋巴管形成,为临床治疗肝癌治疗提供新的靶点。     

沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用

目的 研究沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用及其可能的机制.方法 将不同浓度的沙利度胺作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,采用四甲摹偶氮唑蓝(MTT)法检测沙利度胺对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用.将SMMC-7721细胞培养至对数生长期,采用DNA琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜观察、流式细胞仪检测等方法 观察沙利度胺处理后SMMC-7721细胞的凋亡梯度、形态学变化和凋亡率,并对凋亡调控蛋白caspase-3的表达进行测定.采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定不同浓度的沙利度胺处理后SMMC-7721细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的变化.结果 沙利度胺的浓度从3.125μg/ml增至200μg/ml时,其对SMMC-7721细胞的增殖抑制率从11.7%增至34.2%;当沙利度胺的浓度>25 μg/ml时,其对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用明显强于空白对照组(P<0.05).200 μg/ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞24 h后,行琼脂糖凝胶电泳,可见到DNA梯形条带;48 h后梯形条带更明显,并且在荧光显微镜下可见SMMC-7721细胞出现核固缩和核裂解现象.200μg/ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞12、24、48和72 h时,碘化丙啶(PI)法检测SMMC-7721细胞的凋亡率分别为3.1%±0.5%、8.4%±1.3%、19.4%±3.5%和25.8%±2.1%,24 h起的凋亡率均明显高于空白对照组SMMC-7721细胞48 h的自然凋亡率(1.6%±0.6%,均P<0.05).50、100和200μg/ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞48 h时,Annexin V-FITC/PI双标法检测SMMC-7721细胞的凋亡率分别为8.7%±1.2%、16.8%±2.5%和25.4%±4.5%,均明显高于空白对照组SMMC-7721细胞48 h的自然凋亡率(2.1%±0.5%,均P<0.05).随着沙利度胺浓度的增加,表达caspase-3蛋白的SMMC-7721细胞数量不断增加,而SMMC-7721细胞中VEGF的含量却逐渐下降.结论 沙利度胺可能通过诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肿瘤血管的生成而发挥双重抗肿瘤生长的作用.     

VEGF反义RNA对人食管癌细胞生长转移的抑制作用

目的:探讨研究血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)反义RNA在抑制恶性肿瘤生长和转移及抗肿瘤血管生成治疗中的意义。方法:采用脂质体法将反义VEGFcDNA质粒转染入食管癌细胞TE1;MTT法检测细胞增殖情况;原位杂交和RTPCR技术检测VEGF的表达水平,FCM分析细胞周期,并对转染前后细胞进行裸鼠体内生长转移等生物学行为实验。结果:转染反义VEGFcDNA质粒的TE1细胞中VEGF表达水平降低,与对照组比较,裸鼠体内成瘤时间延长,肿瘤生长速度减慢,质量和体积差异有显著性意义(P<0.05)。结论:VEGF反义RNA能抑制食管癌TE1细胞VEGF表达,对裸鼠体内TE1细胞的生长有抑制作用,有望成为食管癌基因治疗的优选基因之一。     

青蒿琥酯对急性单核细胞白血病SHI-1细胞株血管内皮生长因子及其受体表达的影响

 目的　研究青蒿琥酯对急性单核细胞白血病SHI-1细胞株血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）的影响。方法　酶联免疫吸附法检测非细胞毒性浓度（5、10、20 ng／ml）青蒿琥酯作用SHI-1细胞后培养上清液VEGF浓度,流式细胞术检测有或无青蒿琥酯作用时,SHI-1细胞表面VEGFR-1及VEGFR-2阳性表达率。结果　培养24、48 h后,无青蒿琥酯作用的 SHI-1细胞培养上清液VEGF质量浓度分别为（980.3±2.2）、（982.4±2.3）pg／ml,VEGFR-1表达率分别为（5.40±3.11）%和（4.45±2.85）%,VEGFR-2表达率分别为（13.90±2.26）%和（13.95±1.96）%。 5、10 、20 ng／ml青蒿琥酯作用24 h后,SHI-1细胞培养上清液VEGF质量浓度分别为（234.6±1.8）、（114.9±1.6）、（108.8±1.5）pg／ml,作用48 h后分别为（62.3±1.7）、（60.9±1.6）、（32.7±1.7）pg／ml,与培养相同时间无青蒿琥酯组相比,VEGF浓度明显下降（均P＜0.05）,且相同浓度青蒿琥酯作用24 h与48 h间差异亦有统计学意义（均P＜0.05）。5、10 、20 ng／ml青蒿琥酯作用24 h,VEGFR-1阳性率分别为（4.30±2.21）%、（4.20±1.37）%和（3.90±1.86）%,作用48 h后分别为（3.80±2.87）%、（3.60±1.73）%和（3.00±1.82）%,相同作用时间不同浓度青蒿琥酯组间及相同浓度作用不同时间组间VEGFR-1阳性率差异均无统计学意义（均P＞0.05）;作用24 h后,SHI-1细胞VEGFR-2阳性率分别为（4.40±1.15）%、（3.10±0.68）%和（1.10±0.72）%,作用48 h后分别为（3.00±1.68）%、（2.20±0.93）%和（0.60±0.92）%,3个不同浓度青蒿琥酯作用相同时间后VEGFR-2表达率降低（均P＜0.05）,相同浓度作用24与48 h间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论　SHI-1细胞株高分泌VEGF,青蒿琥酯可下调VEGF分泌及VEGFR-2的表达,而对VEGFR-1表达的调节作用不显著。     

VEGF的单抗制备及胃癌细胞MGC803表达VEGF的鉴定

目的 从胃癌细胞ＭＧＣ８０３克隆并在体外表达血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）,利用ＶＥＧＦ１２１单克隆抗体对其产物进行鉴定,为进一步明确肿瘤组织中ＶＥＧＦ来源,并以ＶＥＧＦ为靶点治疗奠定基础。方法 用杂交瘤技术制备ＶＥＧＦ１２１单克隆抗体,通过ＥＬＩＳＡ、＾３－ＴｄＲ掺入检测其活性;用ＲＴ－ＰＣＲ从ＭＧＣ８０３细胞克隆ＶＥＧＦ基因,与原核表达载体ＰＧＥＸ２Ｔ重组,大肠杆菌中进行表达,以Ｗｅｓｔｅｒ     

血管内皮生长因子在肝细胞癌血清中的表达意义

目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在肝细胞癌(HCC)患者周围血血清中的表达水平与肝癌临床病理特征及肝癌转移复发之间的关系.方法运用sandwich酶联免疫吸附测定法定量检测115例HCC、40例肝脏良性疾病患者和30例健康人血清中VEGF的含量.结果HCC组血清VEGF表达水平[(465.62±336.24)pg/ml]与肝脏良性疾病组[(159.54±120.58)pg/ml]、与健康人组[(123.53±51.84)pg/ml]比较,差异均有显著性(P值均=0.0001);VEGF表达阳性率分别为77.4%、25.0%和3.3%.HCC转移组患者血清VEGF表达水平与未转移组相比,差异有显著性(P=0.001).血清VEGF表达水平还与HCC合并门静脉瘤栓、肿瘤大小和TNM分期密切相关,VEGF含量随TNM分期升高而逐步升高.结论疗前HCC患者的血清VEGF表达水平,是反映HCC侵袭生长及转移潜能的有效生物学指标.     

血管内皮生长因子与肺癌的关系

许多研究表明,新生毛细血管的形成对原发实体肿瘤细胞的增殖和生长是必不可少的,也是肿瘤侵袭转移的必须条件。同时,肿瘤的淋巴转移也是影响许多实体肿瘤发生、进展的一个重要因素。近年来的许多研究证实,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）与肺癌新生血管和淋巴管的生长以及生物学行为密切相关。现就VEGF的结构功能特点与肺癌之间的关系分析报告如下。     

血管内皮生长因子抗体对肿瘤转移的抑制作用

目的探讨阻断血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）是否可以抑制肿瘤的转移。方法应用ＩＶＴＡ２ＭＡ－８９１津白Ⅱ小鼠自发乳腺癌模型进行抗肿瘤转移的研究,此模型伴有高自发肺转移。结果Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及免疫组化证实,该乳腺癌原发灶及肺转移灶均可表达ＶＥＧＦ,且以后者为高。接种肿瘤后第９天,以ＶＥＧＦ抗体处理荷瘤小鼠,可明显抑制原发肿瘤的生长（４４．０％,Ｐ＜０．０５）,而对肺转移灶数目及转移灶大小的抑制率分别达７３．０％和８３．７％。结论ＶＥＧＦ抗体对肿瘤转移的抑制有潜在的应用价值。     

常见消化道恶性肿瘤患者血清VEGF表达水平及其临床意义

目的研究血管内皮生长因子在常见恶性消化道肿瘤患者血清中的水平及其临床意义.方法应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测210例恶性消化道肿瘤患者及87例对照者血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平.结果肿瘤患者血清VEGF平均水平为201 ng/L,对照组为76.21 ng/L,两组差别有统计学意义(P＜0.001);有负荷组患者血清VEGF水平高于无负荷组(P＜0.001).血清VEGF水平与肿瘤分化程度、浸润深度和临床分期密切相关(P＜0.01),但与患者年龄、性别无关(P＞0.05).肿瘤患者血清VEGF水平随着KPS评分的降低,而逐渐升高(P＜0.05).结论VEGF作为一个促进血管渗透性和促进血管内皮生长的主要因子,在肿瘤发生、生长和转移过程中起着极其重要的作用,并可作为判断恶性肿瘤患者术后有无复发或转移的良好指标,在临床上具有重要的参考价值.     

尿纤溶酶原激活物及血管内皮生长因子在食管癌中的表达及对肿瘤血管形成的影响

目的探讨尿纤溶酶原激活物（uPA）、血管内皮生长因子（VEGF）在食管癌中的表达及对肿瘤血管生成的影响。方法采用免疫组织化学sP法检测正常食管黏膜上皮组织（18例）及食管癌组织（68例）中uPA、VEGF的表达,检测CD。用以标记肿瘤微血管密度（MVD）,根据MVD均值分为高、低MVD组,分析食管癌uPA、VEGF的表达和临床病理特征的关系及对肿瘤血管形成的影响。结果uPA蛋白在正常食管黏膜上皮组织、食管癌组织中的阳性率分别为27．8％（5／18）和70．6％（48／68）,差异有统计学意义（X^2=11．63,P〈0．05）;VEGF蛋白在正常食管黏膜上皮组织、食管癌组织中的阳性率分别为22．2％（4／18）和63．2％（43／68）,差异有统计学意义（X^2=9．78,P〈0．05）。食管癌组织中uPA与VEGF表达有一致性（X^2=9．72,P〈0．05）。MVD平均为42．38±11．62,高MVD组uPA、VEGF蛋白表达显著高于低MVD组（X^2值分别为6．13和10．12,均P〈0．05）。uPA、VEGF蛋白表达与年龄、性别、病理类型无关（均P〉0．05）,均与临床病理分期、分化程度和淋巴结转移相关（P〈0．05）。结论食管癌组织中uPA、VEGF蛋白高表达,可能促进肿瘤血管形成,提示预后不良。     

血清VEGF、bFGF与胃癌生物学行为的关系

目的:探讨VEGF、bFGF与胃癌的生物学行为的关系,复发转移患者血清VEGF、bFGF的表达水平与化疗疗效的关系。方法:应用ABC-ELISA方法检测胃癌患者血清VEGF、bFGF的表达情况。结果:(1)术前未作放化疗的胃癌组患者术前血清VEGF、bFGF表达水平明显高于健康体检者(P<0.05),也明显高于同组患者术后血清VEGF、bFGF表达水平(P<0.05)。(2)术前未作放化疗的胃癌组患者术前血清VEGF、bFGF的表达水平与原发肿瘤的浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移有关。(3)术前未作放化疗的胃癌组患者术前血清VEGF与bFGF的表达水平呈正相关(r=0.439,P<0.01)。(4)胃癌患者复发转移组化疗前血清VEGF、bFGF的表达水平比健康体检者及无病生存组明显增高(P<0.05)。(5)胃癌患者复发转移组化疗后CR PR组血清VEGF、bFGF表达水平比化疗前明显减低(P<0.05),胃癌患者复发转移组化疗后NC PD组血清VEGF、bFGF表达水平比化疗前略高,但没有显著性差异(P>0.05),胃癌患者复发转移组化疗后CR PR组血清VEGF、bFGF表达水平比NC PD组明显低(P<0.05)。结论:胃癌患者血清VEGF、bFGF与胃癌生物学行为有关,而且与胃癌化疗疗效有关。血清VEGF、bFGF可能成为胃癌的诊断、术后随访、复发转移监测新的肿瘤标志物。