日本血吸虫TGF-β1成熟肽编码序列的克隆、表达及其转录水平

目的 获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)转化生长因子β1(TGF-β1)成熟肽基因的DNA,进行原核克隆和表达.并比较它与Sj26kd的谷胱甘肽转移酶(Sj26GST)在成虫和虫卵期的转录水平.方法 根据美国国立生物信息学中心(NCBI)上登录的小鼠TGF-β1基因的全长序列,设计两条位于保守区的寡核苷酸作为引物.利用RT-PCR从日本血吸虫成虫的mRNA中扩增SjTGF-β1基因的部分序列,并利用生物信息学进行分析和鉴定.克隆SjTGF-β1成熟肽基因的cDNA到原核表达载体pGEX-6p-3,将重组载体转化大肠杆菌BL21株并诱导表达.利用RT-PCR半定量分析SjTGF-β1基因与Sj26GST基因在成虫和虫卵期的转录水平.结果 成功获得并构建了SjTGF-β1成熟肽基因的原核表达载体.融合表达后的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为3 5000.与目的 基因编码蛋白的预测分子量相符.SjTGF-β1在成虫与虫卵期的转录水平都低于Sj26GST基因,但虫卵期的转录水平比成虫高.结论 SjTGF-β1成熟肽基因的获得为其编码序列全长的获得奠定了基础;重组融合蛋白的成功表达为进一步的功能研究提供保障;虫卵期该基因的转录水平高提示该基因在血吸虫虫卵与宿主的相互作用中可能具有一定的作用.     

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosorna japonicum,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY226980)，全长594bp，编码157个氨基酸，编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。     

日本血吸虫精氨酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析

目的获取日本血吸虫(Sj)精氨酸酶(ARG)新基因的DNA编码序列及其启动子序列,实验验证ARG基因编码序列的完整性。方法以日本血吸虫成虫DNA做模板,PCR扩增ARG基因编码区的DNA序列并测序;根据Sj ARG基因已扩增的DNA序列设计2条巢式引物,用BaKaRa LA Taq PCR Cloning in vitro Kit,扩增Sj ARG基因的启动子序列;对已扩增得到的序列进行TATA盒的寻找以分析启动子序列的位置,实验验证我们曾获取的SjARG新基因编码序列的完整性。结果扩增得到长约1000bp ARG基因DNA序列,SjARG基因DNA序列内没有内含子,与cDNA序列完全一致。对启动子序列扩增后,得到一略大于250bp的序列,测序后分析发现其中有36bp与ARG基因DNA序列的5’端重叠。因此,将精氨酸酶基因的DNA序列又向前延伸了221bp,与前面得到的序列拼接后得到一条1486bp的总序列,将该序列在NCBI上进行ORF的寻找发现其最长的ORF达1164bp,起始密码子在第156位,终止密码子在第1319位,该起始密码子前32位为TATA盒的位置。因此,确定该SjARG基因全长cDNA编码序列长应为1164bp。结论成功扩增获得了日本血吸虫精氨酸酶基因编码区的DNA序列,其不舍有内含子;并扩增得到了该基因的启动子序列,从而获得了SiARC基因真正的全长cDNA序列,为进一步的功能鉴定奠定了基础。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的体外扩增及克隆

为了构建日本血吸虫（中国大陆株)Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16。根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1;转化感受态BL21/DE3菌;用酶切,PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。结果表明,从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因。结果提示,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,为进一步研究Sj16基因功能打下基础。     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的：克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列，构建其正、反义真核表达载体，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果：RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（ ），并经酶切鉴定证实。结论：成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列，并构建了正、反义真核表达载体。     

十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物Ad-TIMPL-1基因克隆及其原核表达

目的克隆十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物(TIMPL)Ad-TIMPL-1基因并进行原核表达。方法分别用3’RACE及RT-PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增编码Ad-TIMPL-1的cDNA3’末端及5’末端序列;序列经拼接后进行初步生物信息学分析;将Ad-TIMPL-1成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒;重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆获得了编码Ad-TIMPL-1的全长cDNA序列并登记到GenBank(accession no.EF495071);Ad-TIMPL-1完整阅读框为396bp,编码132个氨基酸残基组成的蛋白,含16个氨基酸残基组成的信号肽;成功构建了原核表达重组质粒pET-32a/Ad-TIMPL-1,并在大肠杆菌中得到了表达。结论本研究首先从十二指肠钩虫中克隆到了Ad-TIMPL-1基因并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫新基因BBC1的获得和分析

目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新的蛋白基因，为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫cDNA文库，挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果 获得了1个日本血吸虫新基因一BBC1基因(AY220747)，长623bp，编码184个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为60．8kDa，等电点为5．13。结论 步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因。     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。     

日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

日本血吸虫14-3-3蛋白质编码基因在原核细胞中的表达

目的 :为了寻找日本血吸虫病新的诊断和候选疫苗分子 ,克隆日本血吸虫 14 -3 -3蛋白质编码基因 ,并进行表达。方法 :提取日本血吸虫成虫RNA ,设计合成引物 ,用RT -PCR法扩增出日本血吸虫 14 -3 -3抗原 (Sj14 -3 -3 )基因编码序列 ,将其克隆入pGEM -T载体 ,然后在真核表达载体 pBKCMV中亚克隆 ,用IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE观察表达结果。结果 :RT -PCR法扩增出一条大小约 765bp的特异性片断 ,克隆质粒pGEM -Sj14 -3 -3和真核表达质粒pBKCMV经双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段 ,诱导表达后 ,经SDS -PAGE可见一条约 3 2 5kDa大小的融合蛋白条带。结论 :本实验成功地克隆了日本血吸虫 14 -3 -3抗原的编码基因 ,并在原核细胞中进行表达 ,为进一步的免疫诊断和核酸疫苗研究奠定了基础。     

日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因的克隆、表达和初步鉴定

目的为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Ts4样融合蛋白。方法提取日本血吸虫成虫RNA,设计引物,用RT-PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Ts4样蛋白基因编码序列,T载体连接,将其亚克隆入PGEX-5X-1载体中,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌DH5α并用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。结果RT-PCR法扩增出一条大小约为870bp的片段,表达质粒PGEX-5X-1-SjTs4经双酶切和以该重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段,诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约58ku大小的GST融合蛋白条带,并可与抗GST特异性抗体反应。结论本实验成功地克隆了日本血吸虫Sj-Ts4样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

Construction and Expression of Bivalent Membrane-anchored DNA Vaccine Encoding Sj14FABP and Sj26GST Genes

In order to construct a eukaryotic co-expression plasmid containing membrane-anchored Sjc14FABP and Sjc26GST genes and identify their expression in vitro, Sj 14 and Sj26 genes were obtained by RT-PCR with total RNA of Schistosoma japonicum adult worms as the template and cloned into eukaryotic expression plasmid pVAC to construct recombinant plasmids pVAC-Sj14 and pVAC-Sj26. Then a 23 amino-acid signal peptide of human interleukin-2 (IL-2) upstream Sj14 or Sj26 gene and a membrane-anchored sequence containing 32 amino-acids of carboxyl-terminal of human plaeental alkaline phosphatase (PLAP) downstream were amplified by PCR as the template of plasmid pVAC-Sj14 or pVAC-Sj26 only to get two gene fragments including Sj14 gene and Sj26 gene. The two modified genes were altogether cloned into a eukaryotic co-expression plasmid pIRES, resulting in another new recombinant plasmid pIRES-Sj26-Sj 14. The expression of Sl14 and Sl26 genes was detected by RT-PCR and indirect immunofluorescent assays (IFA) when the plasmid pIRES-Sj26-Sj14 was transfected into eukaryotic Hela cells. Restriction enzyme analysis, PCR and sequencing results revealed that the recombinant plasmids pVAC-Sj14, pVAC-Sj26 and pIRES-Sj26-Sj 14 were successfully constructed and the expression of modified Sj 14 and Sj26 genes could be detected by RT-PCR and IFA. A bivalent membrane-anchored DNA vaccine encoding Sj14 and Sj26 genes was acquired and expressed proteins were proved to be mostly anchored in cellular membranes.     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因,并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接成全长cDNA,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上,经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后,选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA,其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD,且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

Construction and Expression of Bivalent Membrane-anchored DNA Vaccine Encoding Sj14FABP and Sj26GST Gene

In order to construct a eukaryotic co-expression plasmid containing membrane-anchored Sjc14FABP and Sjc26GST genes and identify their expression in vitro, Sj 14 and Sj26 genes were ob- tained by RT-PCR with total RNA of Schistosoma japonicum adult worms as the template and cloned into eukaryotic expression plasmid pVAC to construct recombinant plasmids pVAC-Sjl4 and pVAC-Sj26. Then a 23 amino-acid signal peptide of human interleukin-2 （IL-2） upstream Sj 14 or Sj26 gene and a membrane-anchored sequence containing 32 amino-acids of carboxyi-terminal of human placental alkaline phosphatase （PLAP） downstream were amplified by PCR as the template of plasmid pVAC-Sj14 or pVAC-Sj26 only to get two gene fragments including Sj14 gene and Sj26 gene. The two modified genes were altogether cloned into a eukaryotic co-expression plasmid plRES, resulting in another new recombinant plasmid plRES-Sj26-Sj14. The expression of Sj 14 and Sj26 genes was detected by RT-PCR and indirect immunofluorescent assays （IFA） when the plasmid plRES-Sj26-Sj 14 was transfected into eukaryotic Hela cells. Restriction enzyme analysis, PCR and sequencing results revealed that the recombinant plasmids pVAC-Sj14, pVAC-Sj26 and plRES-Sj26-Sj 14 were successfully constructed and the expression of modified Sj 14 and Sj26 genes could be detected by RT-PCR and IFA. A bivalent membrane-anchored DNA vaccine encoding Sj 14 and Sj26 genes was acquired and expressed proteins were proved to be mostly anchored in cellular membranes.     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的 :寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子 ,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法 :用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库 ,并对阳性克隆的插入基因片段进行PCR扩增及测序分析。结果 :经三轮筛选 ,获 10个阳性克隆 ,其插入的SjcDNA片段大小为 1 5～1.8kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中 2个序列分别与Sj动力蛋白轻链 5 (DLC 5 )及Sj线粒体基因明显同源 ,其余 3个序列为未知的新基因片段。结论 :获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码抗日本血吸虫感染的抗原基因     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的：寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子，为血吸虫病疫苗研究提供新的侯选抗原。方法：用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ，Ｓｊ）成虫ｃＤＮＡ文库，并对阳性克隆的插入基因片段进行ＰＣＲ扩增及测序分析。结果：经三轮筛选，获１０个阳性克隆，其插入的Ｓｊ ｃＤＮＡ片段大小为１．５～１．８ｋｂ。初步测序获５个部分序列，其中２个序列分别与Ｓｊ动力蛋白