宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞及血清中IL-10、TGF-β的表达及其临床意义

目的 探讨宫颈癌患者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Treg)、T淋巴细胞亚群以及血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2细胞因子的表达及其临床意义.方法 选取32例宫颈癌患者和24位健康体检者为研究对象,采用流式细胞术检测受试者外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例、T淋巴细胞亚群细胞比例;采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-10、TGF-β1、TGF-β2的含量.结果 与健康对照组相比,宫颈癌组外周血中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值明显增高,差异有统计学意义(P＜0.01),T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8+、CD19+)比例差异无统计学意义(P＞0.05),血清IL-10含量明显增高,TGF-β2含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),TGF-β1的含量差异无统计学意义(P＞0.05);宫颈癌组手术后、化疗后CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例,血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),CD4+ CD25+ Foxp3+Treg与TGF-β1之间存在正相关(r=0.673,P＜0.01).结论宫颈癌患者CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值增高,且与TGF-B1含量呈正相关,可能在宫颈癌的肿瘤发生发展及肿瘤免疫逃逸中起着重要作用.     

CD4~+Foxp3~+调节性T细胞在恶性血液病中的变化及机制研究

目的:分析CD4+Foxp3+调节性T细胞(CD4+Foxp3+Treg)在恶性血液病患者外周血的比例变化,探讨CD4+Foxp3+Treg参与恶性血液病发病的可能机制。方法:用流式细胞仪检测急性白血病、淋巴瘤患者及健康对照外周血CD4+Foxp3+Treg细胞的比例;然后用小鼠的淋巴瘤细胞EL-4和红白血病瘤细胞FBL3的培养上清液与C57BL/6小鼠脾细胞共同培养72小时,RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达。结果:恶性血液病患者外周血CD4+Foxp3+Treg数量显著高于正常对照(14.9±2.92)%、(5.68±1.21)%,P<0.001。小鼠EL-4和FBL3细胞上清液均能够使小鼠脾细胞Foxp3 mRNA表达水平明显增高。结论:恶性血液病患者CD4+Foxp3+Treg比例增高可能导致抗肿瘤免疫功能低下,此外肿瘤细胞分泌的可溶性物质使Foxp3表达增高,增强了CD4+Foxp3+Treg细胞的抑制功能,使肿瘤易于生长和转移。     

褪黑素对荷胃癌小鼠胸腺及脾CD4+CD25+调节性T细胞的影响

目的:研究褪黑素在抑制肿瘤过程中对荷胃癌小鼠胸腺及脾CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞表达变化的影响.方法:培养小鼠前胃癌细胞株(MFC),采用小鼠荷胃癌模型.用褪黑素干预1周后,测量小鼠胸腺、脾质量;并用流式细胞仪检测胸腺、脾Treg细胞;用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测胸腺、脾叉头型转录因子3 (Foxp3)的表达.结果:与正常对照组相比,小鼠胸腺、脾质量各组之间差异无统计学意义.在褪黑素抗肿瘤过程中,与正常对照组相比,荷瘤空白对照组小鼠胸腺与脾的Treg细胞均上升,褪黑素干预后降至正常水平;褪黑素还能使小鼠胸腺Foxp3 mRNA表达下降,脾Foxp3 mRNA反而上调;而小鼠胸腺、脾scurfin蛋白均明显下降.结论:褪黑素能下调荷胃癌小鼠胸腺、脾的CD4+CD25+Treg细胞及特异性转录蛋白scurfin及胸腺Foxp3 mRNA,使脾Foxp3 mRNA反而上调.褪黑素抗胃癌作用与免疫器官中CD4+CD25+Treg细胞免疫调节有关.     

小鼠脾细胞CD4~+ CD25~+调节性T细胞的表型特征

观察CD4+CD25+T和CD4+CD25-T细胞的表型和细胞因子的表达。自小鼠脾脏制备单个细胞悬液,分离CD4+T细胞、CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞,进行细胞表面标记,激活后进行细胞内细胞因子染色,利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析细胞表面分子、转录因子和细胞因子表达之间的关系。结果:在CD4+T细胞中,约有7.8%的细胞同时表达CD25分子。与CD4+CD25-T细胞相比,CD4+CD25+T细胞CD44的表达略有增加,CD45RB的表达明显下降,CTLA-4和Foxp3明显增加。以同时表达CTLA-4和Foxp3的细胞为主,其次为单独表达Foxp3的细胞。细胞因子的研究结果表明,与CD4+CD25-T细胞相比,CD4+CD25+T细胞IL-2、IFN-γ明显减少,而只产生IL-10的细胞略有增加。CD4+CD25+调节性T细胞无论在表型、转录因子的表达以及细胞因子表达方面均于非调节性T细胞不同。     

FBL3细胞在小鼠体内外诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖的实验研究

目的：通过小鼠体内外实验观察肿瘤细胞是否可以诱导CD4^＋CD25^＋Treg的分化增殖。方法：将小鼠的红白血病瘤细胞系FBL3接种于C57BL/6小鼠腹壁皮下,流式细胞仪检测小鼠外周血、脾脏及瘤组织CD4^＋CD25^＋Treg细胞含量,RT-PCR检测小鼠脾脏及瘤组织Foxp3 mRNA的表达;体外实验检测FBL3细胞培养上清液对小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg细胞的作用。结果：荷瘤鼠外周血CD4^＋CD25^＋Treg比例与正常鼠比较无统计学差异（P〉0.05）,但荷瘤鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg比例显著高于正常对照（P〈0.01）,荷瘤小鼠脾脏组织Foxp3 mRNA的表达量明显增加;体外实验表明FBL3培养上清液促使CD4^＋CD25^＋Treg细胞比例增高,并诱导Foxp3 mRNA表达增加。结论：FBL3细胞及其分泌的可溶性物质能诱导CD4^＋CD25^＋Treg细胞的增殖,说明是肿瘤的发生促进了CD4^＋CD25^＋Treg增高。     

小鼠CD4~+ CD25~+ Foxp3~+调节性T细胞体外扩增

目的:本研究旨在探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞体外扩增的方法。方法:采用磁珠分选小鼠CD4+T细胞,αCD3单克隆抗体包被24孔板,加入αCD28单克隆抗体、雷帕霉素、rhIL-2,培养3周后,流式细胞仪测定培养细胞中CD4+CD25+T细胞的含量,实时定量PCR检测CD4+CD25+T细胞Foxp3 mRNA的表达;单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验测定扩增的CD4+CD25+T细胞的增殖及其抑制功能;ELISA检测培养上清中IL-10和TGF-β1的含量。结果:小鼠CD4+T细胞培养3周后,CD4+CD25+T细胞达(76.05±2.73)%,高于未加雷帕霉素组(52.17±1.36)%(P<0.001),磁珠分选的CD4+CD25+T细胞Foxp3 mRNA的表达是未加雷帕霉素组的5倍(P<0.001),增殖能力是未加雷帕霉素组的0.29倍(P<0.001),对CD4+T细胞增殖抑制能力是未加雷帕霉素组的3.6倍(P<0.001),培养上清中IL-10和TGF-β1分别是对照组的1.8倍和1.6倍(P<0.001)。结论:小鼠CD4+T细胞在含有1μg/ml的αCD28、rhIL-2 100 U/ml和终浓度为10 nmol/L雷帕霉素的培养体系中培养3周后能有效扩增CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+CD25~+Treg与CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的相关研究

目的:探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的含量和CD4+CD8+T淋巴细胞亚群分布,两者之间相关性及与HBV的相关性。方法:采用流式细胞术检测50例慢性乙型肝炎患者和20例健康对照者外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达及CD3/CD4/CD8 T淋巴细胞亚群,荧光定量PCR法检测HBV DNA含量。结果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25highTreg明显高于健康对照组(P0.01),且随HBV DNA载量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg细胞的水平逐渐升高。慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞也相应增高,且与CD4+CD25highTreg细胞的变化成正相关(r=0.890,P0.001)。与健康对照组比较,患者组CD4+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,而CD3+T细胞和CD8+T细胞百分率差异无显著性(P0.05)。CD4+CD25highTreg细胞与HBV DNA取对数后成正相关(r=0.782,P0.001),与谷丙转氨酶(ALT)成正相关(r=0.432,P0.005);与CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无相关性(P0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值与HBV DNA载量之间亦无相关性(P0.05)。结论:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞增高,且与HBV的复制水平及ALT增高具有一致性,而T细胞亚群是否可作为监测CHB患者免疫状态的指标需进一步探讨。     

不明原因复发性流产小鼠模型CD4~+CD25~+ Treg的比例及Foxp3表达的变化

目的分析比较小鼠正常妊娠模型和流产模型中CD4+CD25+调节性T细胞CD4+CD25+Treg的比例、Foxp3蛋白表达水平及胎盘吸收率,探讨CD4+CD25+Treg与不明原因复发性流产的关系。方法以雌性CBA/J×雄性Balb/c为对照组,以雌性CBA/J×雄性DBA/2J为流产组,各10对,于妊娠第14天采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析CD4+CD25+Treg在CD4+细胞中所占比例,Western blot检测并比较2组CD4+T细胞中Foxp3的表达,并观察2组小鼠的胎盘吸收情况。结果流产组CD4+CD25+Treg所占比例为(10.1±0.59)%低于对照组(15.5±0.78)%(P<0.05)。流产组胚胎吸收率为(25.6±3.5)%,明显高于对照组(2.4±1.6)%(P<0.01)。流产组Foxp3谱带密度相对值为0.30±0.018,低于正常组的0.68±0.025(P<0.05)。结论小鼠的自然流产模型建立成功,流产组孕鼠CD4+CD25+Treg的比例和Foxp3蛋白表达水平明显低于正常妊娠组,提示流产组高流产率可能与CD4+CD25+Treg数量和Foxp3的表达减少有关,CD4+CD25+Treg细胞的数量减少和功能缺陷可能是不明原因复发性流产的发生机制之一。     

Lewis肺癌细胞通过TLR9对CD4~+CD25~+Treg细胞影响的研究

目的:本研究以Lewis肺癌细胞为研究对象,探讨肿瘤细胞通过TLRs对CD4+CD25+Treg细胞的影响。方法:我们采用流式细胞术检测了Lewis肺癌细胞与脾淋巴细胞共培养系统中CD4+CD25+Treg细胞数量变化;通过RT-PCR方法检测了共培养对Foxp3和TLR1-9mRNA表达的影响;采用TLR9受体阻断剂氯喹阻断Lewis肺癌TLR9的表达。结果:与对照组相比,共培养组CD4+CD25+Treg细胞数量及Foxp3 mRNA表达均明显增高(P0.05);Lewis肺癌细胞与淋巴细胞共培养后可影响多种TLRs表达,其中TLR9 mRNA表达与对照组相比明显增高(P0.05),阻断Lewis肺癌细胞TLR9可明显降低CD4+CD25+Treg细胞数量及Foxp3 mRNA表达(P0.05)。结论:Lewis肺癌细胞可通过TLR9促进CD4+CD25+Treg细胞产生及功能增强,参与诱导肿瘤的免疫耐受,从而促进肿瘤的发生和发展。     

CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与LSCC发病的相关研究

为研究调节性T细胞在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)、发展中的变化及其参与疾病进展的作用机制,收集2010～2011年上海市五官科医院收治的50例LSCC患者的肿瘤组织和外周血,应用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及趋化因子受体CCR6的表达变化,Real-time PCR法检测转录因子Foxp3以及细胞因子mRNA的表达量。结果发现:LSCC患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比较正常人显著增加,并与临床分期相关;CD4+CD25+CCR6+Treg Foxp3的表达,以及肿瘤组织Foxp3mRNA的表达皆明显高于对照组,且与临床分期、淋巴结转移相关。同时发现,LSCC患者外周血中TGF-β和IL-10mRNA的检出水平分别高于对照组,但IFN-γ、IL-2、IL-12mRNA的水平低于对照组。提示此类Foxp3+Treg属于一类诱导性T抑制细胞(Foxp3+iTreg),可通过产生IL-10和TGF-β抑制LSCC患者的细胞免疫功能。Foxp3的检测可能对判断LSCC的预后有一定价值。     

CD4~+CD25~+T细胞在CD8~+T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用

实验旨在研究CD4+CD25+T细胞在CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的调节作用。将小鼠脾脏中分离的单个核细胞分为两组,即去除CD4+CD25+T细胞组和未去除CD4+CD25+T细胞组,测定树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽刺激不同T细胞增殖活性、细胞因子IFN-γ分泌,以及多肽特异性CD8+T细胞对同源性胃癌细胞株MFC的杀伤活性。结果显示预先去除未致敏T细胞中的CD4+CD25+T细胞,所诱导的特异性CD8+CTL对肿瘤细胞免疫应答增强,表现为反应性T细胞对树突状细胞提呈的肿瘤抗原多肽增殖反应增强,IFN-γ分泌量提高及CD8+T细胞对MFC杀伤活性增强。这些结果表明,预先去除未致敏T细胞中的CD4+CD25+T细胞,肿瘤抗原多肽修饰的树突状细胞肿瘤疫苗效能可明显增加。CD4+CD25+T细胞在CD8+T细胞抗肿瘤免疫中起下调作用。     

过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对不明原因复发性流产的治疗作用

目的观察过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋Treg）对不明原因流产的作用机制及妊娠预后的影响。方法以雌性CBA/J×雄性BALB/c为正常妊娠模型,以雌性CBA/J×雄性DBA/2J为自然流产模型,使用免疫磁珠方法分选雌性CBA/J小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg细胞,并使用流式细胞术检测分选纯度。采用TSA对流产孕鼠外周CD4^＋/CD25^-T细胞Foxp3基因特定位点进行表观修饰,以实现Foxp3稳定、持久的表达,并将CD4^＋Treg分别转输至流产模型孕4d（着床期）的雌性CBA/J孕鼠,于孕14d分别观察宿主孕鼠的胚胎吸收率。结果与对照组比较,过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞的宿主孕鼠的胚胎吸收率（11.27%）显著下降。结论孕早期过继转输TSA诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞疗法能诱导宿主母胎免疫耐受,有利于妊娠的维持。     

卵巢癌细胞培养上清诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的研究卵巢癌细胞培养上清液是否能诱导外周血CD4^＋CD25^- T细胞转变为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。方法将外周血CD4^＋CD25^- T细胞分离后，对照组用CD3和CD28单抗活化，实验组在对照基础上加用卵巢癌细胞株SKOV3培养上清，72h后分离各组的CD25^＋和CD25^-T细胞，溴化脱氧尿嘧啶掺入标记法测定增殖能力及对静息的自体同源CD4^＋CD25^- T细胞的增殖抑制能力，流式细胞仪测定细胞糖皮质激素诱发型TNF受体（glucocorticoid-induced TNFR,GITR）与CTLA-4分子的表达，RT-PCR检测细胞卿mRNA的表达。结果与对照组相反，实验组的CD4^＋CD25^＋T细胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR和CTLA-4分子的表达和CD4^＋CD25^＋调节性T细胞相似，并被诱导表达转录因子Foxp3 mRNA。结论卵巢癌细胞分泌的可溶性物质能诱导外周血CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。     

Pertussis toxin as an adjuvant suppresses the number and function of CD4+CD25+ T regulatory cells

We observed a remarkable reduction in the frequency and immunosuppressive activity of splenic CD4+CD25+ T cells in C57BL/6 mice with MOG33-55-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Our study revealed that pertussis toxin (PTx), one component of the immunogen used to induce murine EAE, was responsible for down-regulating splenic CD4+CD25+ cells. Treatment of normal BALB/c mice with PTx in vivo reduced the frequency, suppressive activity and FoxP3 expression by splenic CD4+CD25+ T cells. However, PTx treatment did not alter the expression of characteristic phenotypic markers (CD45RB, CD103, GITR and CTLA-4) and did not increase the expression of CD44 and CD69 by the residual splenic and lymph node CD4+CD25+ T cells. This property of PTx was attributable to its ADP-ribosyltransferase activity. PTx did not inhibit suppressive activity of purified CD4+CD25+ T regulatory (Treg) cells in vitro, but did so in vivo, presumably due to an indirect effect. Although the exact molecular target of PTx that reduces Treg activity remains to be defined, our data suggests that alteration of both distribution and function of splenic immunocytes should play a role. This study concludes that an underlying cause for the immunological adjuvanticity of PTx is down-regulation of Treg cell number and function.     

NOD小鼠自然状态下CD4~+CD25~+T细胞的动态变化及意义

研究自发的1型糖尿病雌鼠模型(NOD)在自然状态下发生1型糖尿病过程中CD4+CD25+T细胞的动态变化,旨在初步探讨调节性T细胞参与1型糖尿病发病的可能机制。采用雌性NOD小鼠作动物模型,每2周尾静脉采血1次,采用三色流式细胞术测定NOD小鼠外周血中CD4+CD25+T细胞(CD3+CD4+CD25+)的百分率。在32周时,对比发生糖尿病和未发生糖尿病NOD小鼠不同脏器中的CD4+CD25+T细胞阳性率。HE法检测胰岛炎。结果显示:(1)自第6周起NOD小鼠CD4+CD25+T细胞百分率逐渐降低。发生糖尿病NOD小鼠CD4+CD25+T细胞比率低于未发病NOD小鼠对照组(外周血分别为0.94%±0.21%、1.62%±0.23%,P=0.01;脾脏2.09%±0.14%、2.77%±0.36%,P=0.019),提示糖尿病NOD小鼠外周血中存在异常比例的CD4+CD25+T细胞;(2)32周龄糖尿病NOD小鼠与未发病NOD小鼠的CD4+CD25+T细胞抑制功能减低,与阳性对照组有显著性差异;(3)HE染色结果示糖尿病NOD小鼠胰岛结构完全破坏,胰岛炎程度较未发病NOD小鼠严重。该结果提示NOD小鼠发生糖尿病时免疫功能紊乱与CD4+CD25+T细胞参与调节及T细胞亚群变化相关,糖尿病的发生受致病性T细胞和调节性T细胞的调节。     

CD4~+CD25~+调节性T细胞对巨噬细胞泡沫化的影响

目的 研究CD4~+ CD25~+调节性T细胞(Tr)对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制.方法 磁性细胞分离器(MACS)分离CD4~+ CD25~+ T细胞及CD4~+ CD25~- T细胞,在氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)作用下,将巨噬细胞分别与CD4~+ CD25~+ T细胞、CD4~+ CD25~- T细胞共培养48 h.采用油红O染色和细胞内脂质测定的方法观察CD4~+ CD25~+ T细胞对巨噬细胞泡沫化的影响;采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot的方法测定泡沫细胞清道夫受体(CD36和SRA)的表达.结果 与对照组比较,CD4~+ CD25~+ T细胞可显著抑制巨噬细胞脂质聚集及清道夫受体的表达.结论 CD4~+CD25~+ T细胞可显著抑制巨噬细胞泡沫化,其作用机制可能为下调清道夫受体的表达.     

CD4+ CD25+调节性T细胞AICD机制的研究

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞活化诱导的细胞死亡（AICD）发生的机制。方法CD4^＋CD25^＋T细胞以磁性细胞分离器（MACS）从BALB／c小鼠或DO11．10小鼠的静息T细胞分离纯化。体外细胞增殖抑制实验证实其免疫调节作用。CD4^＋CD25^＋T细胞的AICD以CD3／CD28单克隆抗体活化或以特异性OVA323-339肽、抗原提呈细胞活化等两种方法获得。CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡相关基因的表达通过实时定量PCR检测。流式细胞仪检测细胞的凋亡率。进一步观察FasL中和抗体、TRAIL中和抗体及caspase抑制剂zVAD-fmk对CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡的影响。结果MACS成功分离CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，该细胞可特异性表达Foxp3基因，能明显抑制效应性T细胞的体外增殖。CD3／CD28抗体以及OVA特异性抗原活化8d的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞AICD达39％～45％。活化前后的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞死亡受体家族表达发生明显变化；FasL、TRAIL中和抗体及zVAD-fmk可明显抑制CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。结论FasL／Fas及其他凋亡相关分子可能参与了CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。