包载治疗基因的聚合物纳米粒子:Ⅰ.纳米粒子制备及动物模型基因治疗实验研究

以可生物降解材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物（Poly—dl—lactic—cp—glycolic，PLGA）为原料，采用多相乳化技术制备载VEGP纳米粒子。并对纳米粒子的粒径，VEGF含量，体外释放等进行了测定。VEGF纳米粒子和VEGF裸质粒被注射到兔下肢缺血模型的缺血部位，通过RT—PCR，免疫组化和血管造影等技术来验证基因治疗的效果，评价VEGF纳米粒子作为基因载体在动物模型基因治疗中的效率。制备的VEGF纳米粒子的平均粒径约为300nm，包埋效率在96％以上，纳米粒子中VEGF含量约4％。可在体外维持恒定释放约两周。两周基因注射结果表明VEGF-NP治疗组与裸质粒VEGF治疗组的毛细血管密度明显高于对照组，VEGF纳米粒子组（81．22per mm^2），对照组（29．54mm^2），两者有显著性差异（P〈0．05）。RT—PCR结果显示VEGF纳米粒子组表达（31．79au＊mm）明显高于VEGF裸质粒组（9．15au＊mm）。在动物模型中VEGF纳米粒子是比裸质粒DNA更好的基因载体系统，结果显示了纳米粒子可望在人类基因治疗中得到很好的应用。     

紫杉醇纳米粒子的制备及其应用**◆

背景：紫杉醇临床用剂型紫素易引起过敏反应,因此研制新的紫杉醇新剂型就显得十分有意义。 目的：研制紫杉醇新剂型,观察其在动物模型上治疗肿瘤的效果。 方法：合成具有自主知识产权的生物可降解材料医用聚己内酯。采用溶剂替代法制备载紫杉醇纳米粒子,对其粒径、形态、紫杉醇含量、体外释放等进行测定。选用TA2系实验小鼠,建立乳腺癌动物模型,随机分为5组,分别局部注射生理盐水、紫素、低剂量、中剂量及高剂量紫杉醇纳米粒子进行治疗。 结果与结论：实验制备的紫杉醇纳米粒子平均粒径约为153.54 nm,包埋率为87.25%,紫杉醇含量19.06%。体外可恒定释放30 d以上。2周药物治疗显示,各治疗组均不同程度上抑制了肿瘤的生长,其中紫杉醇纳米粒子中、高剂量组的抑瘤率明显高于紫素治疗组(P < 0.01)。提示紫杉醇纳米粒子可缓释药物,中剂量组和高剂量组对小鼠乳腺癌的抑瘤率高于紫素组。关键词：紫杉醇;医用聚己内酯;纳米粒子;乳腺癌;缓释药物 缩略语注释：HPLC：high performance liquid chromatography,高效液相色谱 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.16.005     

包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因（腺病毒早期表达基因）的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多（P〈0.05）;PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。     

制备载mNGF的PLGA纳米粒子及其在磁场引导下修复大鼠坐骨神经损伤的初步探究

目的制备载鼠神经生长因子(mNGF)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)磁性纳米微粒,评价其体外释放行为,通过MRI显像研究大鼠左坐骨神经损伤后,在外加磁场的引导下,磁性纳米粒子在损伤部位的聚集情况。方法以mNGF为模型药物,采用超声乳化法,制成磁性mNGF-PLGA纳米粒子,分别用透射电子显微镜、激光粒度分析仪等对纳米粒子进行表征,用酶联免疫吸附分析(ELISA)法绘制mNGF标准曲线,测包封率和载药量及体外释放。用SD大鼠制作坐骨神经损伤模型,通过尾静脉注射药物磁性mNGF-PLGA纳米粒子,分别扫描未注射药物大鼠、尾静脉注射磁性mNGFPLGA纳米粒子溶液大鼠及尾静脉注射磁性mNGF-PLGA纳米粒子溶液后使左下肢固定在1.0 T外磁场引导2 h的大鼠,分别记录左、右下肢T2*值。结果所得磁性mNGF-PLGA样品为棕色混悬液,大小均匀,平均粒径为(205.9±1.2)nm,粒径分散均一,透射电子显微镜证实纳米粒子形态为球型,其内包裹了大量mNGF;药物包封率和载药率分别为(69.43±2.80)%和(3.11±3.27)%。体外释放实验显示,磁性mNGF-PLGA纳米粒子持续缓释mNGF,前12 h释放率为30%,第5天累积释放率为92%。MRI显像显示注射药物前左右下肢T2*值都较高,分别为312.68、314.74,注射药物后其有所下降,但左右两侧值差距不明显,分别为264.43、263.78。而在外在磁场下引导2 h后,T2*值进一步下降,并且左下肢明显低于右下肢,分别为150.90、233.54。结论 (1)通过单乳化溶剂挥发法能制备出粒径小、分布窄、包封率和载药率较高的磁性mNGFPLGA纳米粒子。(2)该磁性纳米粒子体外释放效果良好,具有可控的、持续时间较长的缓释效应。(3)载mNGF的PLGA磁性纳米粒子能够有效降低T2*值,在外在磁场下有明显聚集性,为进一步研究磁靶向修复周围神经损伤奠定良好基础。     

巯基烷基化壳聚糖载绿色荧光蛋白质粒基因纳米粒子的制备与研究

合成了新型的基因载体巯基烷基化壳聚糖(TACS),采用复凝聚法制备了巯基烷基化壳聚糖基因纳米粒子,并表征其形态和粒径。利用体外转染实验定性评估了纳米粒子的转染效率。结果表明,粒子形态不很均一,粒径在390nm左右;凝胶电泳实验证明了载体能有效地包裹和保护基因不受DNaseⅠ酶的消化;溶解实验证实了巯基化增强了TACS的水溶性;体外基因转染实验证实了TACS能够在人胚胎肾细胞(HEK293)转染基因,并且其转染效率远高于壳聚糖纳米粒子。这些结果表明,巯基烷基化壳聚糖有望成为有价值的基因载体。     

紫杉醇纳米粒子制备及血管内局部灌注后的组织分布

目的 制备紫杉醇纳米粒子,并考察其在实验兔体内经DispatchTM球囊灌注后组织分布情况.方法 以生物可降解材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)为原料,采用超声乳化-溶剂挥发法制备载紫杉醇纳米粒子.对纳米粒子的粒径、形态、药物含量和体内外释放进行测定.通过新西兰兔腹主动脉局部给药模型考察紫杉醇纳米粒子球囊灌注后组织分布情况.结果 制备的紫杉醇纳米粒子的平均粒径约为246 nm,包封率为93.25％,紫杉醇含量19.06％.体外可维持恒定释放30d以上.新西兰兔体内经腹主动脉实现DispatchTM球囊灌注,观察药物可在靶部位体内贮留长达21d.结论 紫杉醇PLGA纳米粒子作为一种局部药物传递系统,经球囊灌注在动物模型体内提高局部药物浓度,延长药物作用时间,可实现缓释靶向治疗.     

基于改性复合多糖的载阿霉素纳米粒子的制备及其靶向肝癌细胞的研究

目的 制备一种具有氧化还原敏感性的载阿霉素(DOX)纳米粒子,并研究其体外释放及靶向肝癌细胞的性能.方法 以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺为催化剂,使透明质酸(HA)侧链接枝胱胺,进一步通过Schiff碱反应偶联β-环糊精(β-CD)制备β-环糊精接枝透明质酸(HACD).然后以HACD为载体材料,采用透析法制备载DOX纳米粒子(HACD/DOX),并对其载药量、包封率、粒径及分布、zeta电位等理化性质及体外释放行为进行表征;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测HACD/DOX纳米粒子对肝癌细胞HepG2的毒性作用;通过流式细胞术及激光共聚焦显微镜(CLSM)研究HACD/DOX纳米粒子对HepG2细胞的靶向作用.结果 成功制备了HACD,其可携载DOX形成形态均匀的纳米粒子.DOX在纳米粒子中的载药量为(16.1±0.2)％,包封率为(64.2±0.9)％.透射电子显微镜结果显示其为球形结构;粒度分析结果表明,HACD/DOX纳米粒子的平均粒径为(203.1±2.5) nm,多分散系数为0.202,zeta电位为(-29.1±0.8)mV.该纳米粒子的体外释放行为具有明显的氧化还原敏感性.体外毒性结果显示,空白载体材料HACD对肝癌细胞无明显毒性,而HACD/DOX纳米粒子可有效杀伤肝癌细胞,48 h的半数抑制浓度(IC50)值为0.38 μg/ml.流式细胞术和CLSM结果均显示HACD/DOX纳米粒子是通过HA的介导而发挥肝癌靶向作用的.结论 制备的HACD/DOX纳米粒子具有适宜的粒径、高载药量和包封率,能在还原剂刺激下释放药物,且具有明显靶向肝癌细胞的作用,有望成为一种具有良好应用前景的靶向治疗肝癌的药物递送系统.     

p27kip1基因纳米粒子在动物模型上的应用

目的p27 Kip1是一种细胞周期素依赖激酶抑制物,它抑制G1期的进程并对其进行调节。方法采用乳化-溶剂挥发法制备含p27kip1的纳米粒子,粒度集中分布在243～343 nm,平均粒度为288．9 nm,粒径呈窄分布,粒度分布指数为0．192。p27Kip1纳米粒子的载基因率为3％。包封效率为86％。p27Kip1基因纳米粒子的体外释放,开始的5 d累积释放曲线接近直线,约1周后释放量开始变慢,释放曲线缓慢上升,可平稳维持释放2周以上。用p27kip1基因纳米粒子转染大鼠动脉平滑肌细胞,分为p27Kip1基因纳米粒子组、空白纳米粒子组、对照组,培养48 h后收集细胞,流式细胞仪测定p27kip1纳米粒子对细胞周期调控的结果显示转染前细胞G1／G0期比例为92．4％,转染后48 h,对照组及空白纳米粒子组G1／G0期比例为64．5％、68．3％,S期为12．4％、10．3％,表明G0／G1→S的过程非常迅速,细胞增殖活跃。而基因组G1／G0期比例为88．3％,S期为7．2％,说明细胞发生G1期阻滞,细胞增殖受到抑制。建立大鼠自体静脉移植模型,随机分成转基因治疗组、空白纳米粒子组、单纯静脉移植组,应用显微...     

胰岛素纳米粒子缓释制剂的实验研究

目的研究胰岛素纳米级粒子缓释制剂的体内生物作用,以期在临床上实现胰岛素注射剂的更长效稳定释放给药治疗糖尿病.方法以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)作为基质材料,采用超声乳化/溶剂挥发法制备PLGA包囊胰岛素的纳米级微粒(NP),借助扫描电镜观察微粒形态,通过激光光散射实验测定纳米微粒的粒径分布;利用高效液相色谱(HPLC)测定纳米微粒制剂的载药率;并做纳米胰岛素制剂在糖尿病动物模型体内的药效学研究.结果经电镜观察PLGA-胰岛素NP为表面光滑的球形微粒,粒径分布平均值是112.4nm,呈正态分布;PLGA-胰岛素NP载药率为7.4%;体内研究表明,所制备的纳米制剂生物活性没有改变;皮下注射途径给药纳米胰岛素可以在至少72小时内长效控释,有效降低血糖并保持在正常范围.此外纳米制剂的量-效关系明显,未见任何不良反应.结论PLGA纳米粒子可以作为胰岛素的有效载体,达到更长效稳定控制释放的目的,发挥药物更佳的降糖作用.     

壳聚糖载基因纳米粒子的研究

以壳聚糖为基质研究载基因纳米粒子的制备及其对血管平滑肌细胞的转染效率。制备载绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescen t prote in,EGFP)和组织因子途径抑制因子(T issue factor pathw ay inh ib itor,TFP I)质粒DNA的壳聚糖纳米粒子,透射电镜观察两种纳米粒子皆呈球形,光子相关色谱仪(PCS)测定显示纳米粒子的平均粒径为149 nm,粒径分布在80~250 nm之间;载基因纳米粒子的DNA包埋效率和DNA含量分别为96%±1.38%和37%±3.0%。载基因壳聚糖纳米粒子可以有效地保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用。血管平滑肌细胞转染实验表明,纳米粒子对细胞基本无毒性,其转染效率与阳离子脂质体转染试剂L ipofectAM INETM相近。     

Nanosphere-mediated delivery of vascular endothelial growth factor gene for therapeutic angiogenesis in mouse ischemic limbs

Polymeric nanosphere-mediated gene delivery may sustain the duration of plasmid DNA (pDNA) administration. In this study, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanospheres were evaluated as a gene carrier. The pDNA-loaded PLGA nanospheres were formulated with high encapsulation efficiency (87%). The nanospheres sustained release of pDNA for 11 days. The released pDNA maintained its structural and functional integrity. Furthermore, the PLGA nanospheres showed lower cytotoxicity than polyethylenimine (PEI) in vitro and in vivo. The nanospheres with vascular endothelial growth factor (VEGF) gene were injected into skeletal muscle of ischemic limb model, and gene expression mediated by the PLGA nanospheres with VEGF gene was compared to that of PEI/pDNA or naked pDNA in vivo. PLGA nanosphere/pDNA had significantly higher VEGF expression levels in comparison to PEI/pDNA and naked pDNA at 12 days after administration. In addition, gene therapy using PLGA nanospheres resulted in more extensive neovascularization at ischemic sites than both naked pDNA and PEI/pDNA. These results indicated that PLGA nanosphere might be useful as a potential carrier for skeletal muscle gene delivery applications.     

mPEG-CS纳米粒介导livin shRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景：作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。 目的：制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。 方法：通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。 结果及结论：成功制备出约60 nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100 nm左右;其包封率为(94.32±0.35)%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

Acid-degradable cationic methacrylamide polymerized in the presence of plasmid DNA as tunable non-viral gene carrier

New acid-degradable cationic nanoparticles were synthesized using a monomer-to-polymer approach, which enabled highly flexible nanoparticle fabrication to obtain controlled properties such as size and conjugation with additional functionalities. The nanoparticles were designed to cause swelling and osmotic destabilization of the endosome, while cationic branches holding anionic DNA are cleaved from the polymeric backbone of the nanoparticles and make plasmid DNA accessible for efficient gene expression. Efficient release of plasmid DNA upon hydrolysis of the nanoparticles at the endosomal pH 5.0 and transportation of the released DNA to the nucleus of a cell were shown. In vitro studies showed significantly higher transfection efficiency by the degradable nanoparticles than polyethylenimine (PEI) polyplexes at very low concentrations (i.e., ng/mL). Size-dependent selective transfection of phagocytic cells (e.g., RAW 309 macrophages) and non-phagocytic cells (e.g., NIH 3T3 fibroblasts) was also achieved by using nanoparticles of two different sizes (240 nm and 680 nm in diameter), which implies feasibility of tunable gene therapy and DNA vaccination using the nanoparticle system. Preliminary pulmonary transfection of mice using the degradable nanoparticles demonstrated a remarkably higher expression of firefly luciferase at 70% lower concentration than using naked DNA alone. Implications and further improvement of the nanoparticles to be used in gene therapy are also discussed.     

人血管内皮生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析

目的 克隆人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因，构建真核表达载体，观察其对脐静脉内皮细胞的增殖作用和血管新生的影响。方法 利用RT-PCR方法，从人扁桃体组织中扩增人VEGF165 cDNA完整编码区，并构建成pcDNA3．1( )／VEGF165(简称pcDNA／V)重组体；应用脂质体介导的基因转移技术将构建的真核表达载体pcDNA／V体外转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，MTT法检测其对内皮细胞增殖的影响。建立家兔下肢缺血模型，注射重组质粒pcDNA／V，pcDNA3．1( )空质粒作对照，选取不同时间点，行血管造影。结果 构建的真核表达载体pcDNA／V的酶切电泳分析和测序表明结果正确。pcDNA／V转染HUVEC能明显促进内皮细胞的分裂增殖。血管造影显示，术后基因治疗组远端动脉充盈早于对照组，新生血管数目也明显多于同时期对照组。结论 成功克隆了人VEGF165基因，构建了其真核表达载体。体内外生物学活性研究证实，重组质粒的表达产物具有刺激HUVEC增殖和促进缺血肢体侧枝循环建立的功能。     

黏膜免疫壳聚糖-多胺转运蛋白D(PotD)DNA纳米微粒对小鼠鼻咽部肺炎链球菌定植的保护作用研究

目的 探讨以壳聚糖包裹的PotD DNA(Chitosan-potD)纳米微粒经鼻黏膜免疫小鼠对肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用.方法 将制备的Chitosan-potD微粒、裸pVAX1-potD重组质粒(裸potD)及pVAX1分别鼻腔免疫小鼠,收集黏膜和血清标本用以检测特异性抗体水平;分离并培养脾淋巴细胞,检测IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;于免疫小鼠鼻腔进行肺炎链球菌攻击,通过菌落计数评估各免疫组对小鼠肺炎链球菌鼻咽部定植的保护作用.结果 Chilosan-potD纳米微粒在小鼠体内诱导产生的抗PotD特异性血清IgG、IgG1、IgG2a、黏膜IgA抗体水平及IL-17A、IL-4、IFN-γ水平与裸potD组及pVAX1组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);菌落计数结果 显示,Chitosan-potD微粒组在鼻咽部定植的肺炎链球菌数量显著减少(P<0.05).结论 壳聚糖包裹PotD DNA微粒对肺炎链球菌鼻咽部定植具有免疫保护作用.     

MG63和MG63/ADR骨肉瘤裸鼠模型血管内皮生长因子和核因子κB1的表达

背景：恶性肿瘤耐药研究中发现核因子κB1及血管内皮生长因子基因可能与肿瘤耐药密切相关。 目的：观察MG63和MG63/ADR骨肉瘤裸鼠模型中血管内皮生长因子和核因子κB1表达的差异。 方法：对数期生长的MG63细胞采用阿霉素浓度递增培养法冲击诱导建立MG63/ADR细胞株。BALB/C裸鼠随机分为2组,分别将含5.0×106个MG63和MG63/ADR细胞的0.2 mL细胞悬液采用皮下接种法注入裸鼠的一侧腋部皮下。第6周处死裸鼠取材。 结果与结论：注射MG63和MG63/ADR细胞的2组裸鼠成瘤率均为100%;免疫组织化学及RT-PCR方法检测发现MG63/ADR组瘤灶中血管内皮生长因子和核因子κB1基因和蛋白的表达均明显高于MG63组(P < 0.05)。说明血管内皮生长因子和核因子κB1表达的上调可能是导致骨肉瘤耐药的重要原因。     

Electro-Gene-Transfer: A New Approach for Muscle Gene Delivery

Gene transfer into skeletal muscle cells by direct injection of naked plasmid DNA results in sustained gene expression. Intramuscular injection of plasmid DNA might thus be used to correct myopathies, to secrete locally or systematic therapeutic proteins and to elicit an immune response against specific antigens. However, the potential utility of this technique for gene application in humans is limited by the poor transduction efficiency and the low and highly variable level of gene expression. Different methods are thus being developed to increase the efficiency of gene transfer in muscles. It has been recently reported that a dramatic improvement of DNA transfer is achieved by applying an electric field to the muscle fibers subsequent to local DNA injection. Electro-gene-transfer increases gene expression by several orders of magnitude and strongly reduces interindividual variability. Electroinjection of genes encoding for secreted proteins resulted in sustained expression and disease correction in animal models of gene therapy. Moreover, the immunogenicity of DNA vaccines is dramatically increased when antigen-encoding plasmids are delivered by this technique. This technique may thus have broad and important applications in human gene therapy. This review provides a brief overview of the theory of electro-gene-transfer and describes parameters governing its efficiency in muscle. We also summarize the results obtained with electro-gene-transfer in animal models to date and the technical issues that must be solved before its use for human therapy can be considered.     

Transfection of VEGF(165) genes into endothelial progenitor cells and in vivo imaging using quantum dots in an ischemia hind limb model

Endothelial progenitor cells (EPCs) were transfected with fluorescently labeled quantum dot nanoparticles (QD NPs) with or without VEGF(165) plasmid DNA (pDNA) to probe the EPCs after in?vivo transplantation and to test whether they presented as differentiated endothelial cells (ECs). Bare QD NPs and QD NPs coated with PEI or PEI?+?VEGF(165) genes were characterized by dynamic light scattering, scanning electron microscopy, and atomic force microscopy. Transfection of EPCs with VEGF(165) led to the expression of specific genes and proteins for mature ECs. A hind limb ischemia model was generated in nude mice, and VEGF(165) gene-transfected EPCs were transplanted intramuscularly into the ischemic limbs. At 28 days after transplantation, the VEGF(165) gene-transfected EPCs significantly increased the number of differentiated ECs compared with the injection of medium or bare EPCs without VEGF(165) genes. Laser Doppler imaging revealed that blood perfusion levels were increased significantly by VEGF(165) gene-transfected EPCs compared to EPCs without VEGF(165). Moreover, the transplantation of VEGF(165) gene-transfected EPCs increased the specific gene and protein expression levels of mature EC markers and angiogenic factors in the animal model.