人胚胎纹状体区神经干细胞体外生物学特性

目的探讨人胚胎纹状体区神经干细胞在体外的生物学特性。方法从16～20周人胚胎纹状体区分离培养神经干细胞,在体外进行传代、分化,应用免疫组织化学荧光染色等方法,对此区神经干细胞在体外增殖和分化等情况进行研究。结果纹状体区神经干细胞在体外原代培养扩增1月内分裂增殖速度快,在含有EGF和bFGF的培养基中生长最为良好,平均倍增时间为3～4d。分化培养后可以形成各种神经细胞,在原代培养后2周分化情况好,分化为神经元比例高,约占50％左右,在原代培养8周以后分化为神经元的比例下降,约占20％左右。结论人胚胎纹状体区的神经干细胞在体外有较强的自我更新和增殖能力,并表达了干细胞的原始特征,在体外传代过程中,增殖速度随着时间不断下降,其分化为各种神经细胞的能力也不同。培养基中的有丝分裂原对于神经干细胞的增殖和分裂的影响不同。神经球并非均质的,内部仅有部分细胞在分裂增殖。     

纹状体星形胶质细胞诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的研究

目的 探讨纹状体组织对胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化的定向诱导作用,及其细胞来源和诱导方式。方法 分别用纹状体组织提取液、纹状体星形胶质细胞条件培养液和纹状体神经元条件培养液诱导胚胎干细胞定向分化,通过形态学观察和酪胺酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测,对细胞的分化情况进行鉴定,并对3组结果进行定量比较分析。结果 纹状体组织提取液对胚胎干细胞有明显的定向诱导作用,向多巴胺能神经元诱导分化的分化率为15％;纯化培养的纹状体星形胶质细胞条件培养液对胚胎干细胞的定向诱导作用与纹状体组织液无明显差异,分化率为15．2％;纯化培养的纹状体神经元条件培养液对胚胎干细胞向多巴胺能神经元诱导分化的作用很弱,其分化率仅为3％。结论 纹状体组织对胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化作用主要来源于纹状体中的星形胶质细胞,而这种诱导作用主要通过非接触性方式实现。     

羊膜对人脐血干细胞分化为多巴胺能神经元的作用

目的 探讨羊膜上皮细胞对人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的作用.方法 体外分离、原代培养人羊膜上皮细胞,通过高速离心制备成条件培养液(CM)对P1代脐血十细胞进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形念的变化,应用免疫荧光染色和免疫印迹法检测其酪氨酸羟化酶(TH)及多巴胺转运体(DAT)蛋白的表达情况.结果 P1代脐血干细胞经羊膜上皮细胞条件培养液诱导后,TH及DAT阳性细胞率明显高于对照组,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),免疫印迹分析结果 与免疫荧光染色结果 一致.结论 羊膜上皮细胞能诱导人脐血问充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元.     

两种人胚胎干细胞系向神经元方向诱导分化的比较研究

目的:比较研究两种人胚胎干细胞系H8和H9在维持培养、向神经前体细胞和神经元方向分化的特性.方法:采用mTeSR1做为基本培养基,Matrigel做为基质胶,进行无滋养层的维持培养.采用白细胞抑制因子1(Smad-1)双抑制剂的神经前体细胞诱导,和含B27的Neurobasal联合脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细...     

巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞

背景：细胞替代疗法是一种可以治疗帕金森病的非常有前景的方法。目前将人多能干细胞进行神经分化的主要方案是“双SMAD”抑制方案,利用阻断糖原合酶激酶3β来激活WNT通路信号,随后利用音猬因子信号与骨形态发生蛋白信号之间的调控相结合,可以精确地控制人多能干细胞从底板区域到顶板区域特异性的细胞命运。巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类具有独特结构的多效免疫调节细胞因子,在多项研究中证明MIF对神经发育和分化非常重要。然而,MIF是否参与诱导干细胞的分化还是未知的。目的：在“双SMAD”抑制分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂(S,R)-3-(4-羟基苯基)-4,5-二氢-5-异噻唑乙酸甲酯(ISO-1),观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径。方法：CCK8检测添加不同浓度MIF和ISO-1培养人胚胎干细胞的存活情况。免疫荧光法检测人胚胎干细胞上MIF受体CD74、CD44、CXCR7的表达。在胚胎干细胞分化...     

胚胎小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化

目的：探索胚胎小鼠纹状体神经干细胞(striatum-neural stem cells，^strNSC)的体外培养和分化鉴定方法。方法：无菌条件下分离E15天胚胎小鼠纹状体，制成单细胞悬液，在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增，通过免疫细胞化学显色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果：培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖，同时表达神经干细胞特异性抗原nestin，并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和神经胶质细胞分化。结论：胚胎小鼠纹状体存在具有多分化潜能的神经干细胞，它们能在体外培养、传代和自然分化．     

脊髓神经管神经上皮干细胞的分离培养和诱导分化

目的：从胚胎大鼠脊髓神经管中分离神经上皮干细胞并诱导其向多巴胺能神经元方向分化。方法：利用无血清悬浮培养、单细胞克隆技术分离神经上皮干细胞；采用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记新生细胞，免疫细胞化学单标或双标染色技术，检测神经上皮干细胞蛋白（nestin）和分化后特异性神经细胞抗原的表达；用纹状体组织提取液，诱导神经上皮干细胞向多巴胺能神经元方向分化。结果：从胚胎大鼠脊髓神经管 中分离的细胞可以连续传代，表达nestin，它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；与对照组3％相比，纹状体组织提取液可以诱导这些细胞中的12％分化成为多巴胺能神经元。结论：分离自脊髓神经管的细胞具有自我更新能力和多分化潜能（multipotent)，是增殖能力很强的神经干细胞；这些干细胞在一定的体外环境中能被诱导成为特定的神经元，提示其可以为神经移植提供材料。     

神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化研究进展

在帕金森病的细胞移植治疗研究中 ,如何在体外获得足够的多巴胺能神经元一直是一个难以解决的问题。干细胞的研究让人们看到了希望的曙光 ,利用干细胞不仅能在体外大量得到相关的神经元 ,而且也可能解决胎脑移植引发的伦理问题。本文就神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化及相关因素的研究进展作一综述。     

KM小鼠胚胎干细胞大鼠纹状体内移植诱导分化的在体研究

目的探讨体外培养扩增的胚胎干细胞移植到纹状体内的存活、迁移和分化情况,确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法分别将未分化的胚胎干细胞和诱导分化至神经前体细胞阶段的胚胎干细胞进行纹状体内移植,移植4周后通过形态学观察、尼氏染色、TH与BrdU免疫组织化学染色,检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果初步诱导分化后的胚胎干细胞纹状体内移植后4周,移植区内有大量BrdU免疫阳性细胞出现,而且部分BrdU免疫阳性细胞已迁移出移植区,有些细胞已分化为TH免疫阳性细胞,胞浆内可见尼氏体;而未分化的胚胎干细胞进行脑内移植后有成瘤的趋向。结论在体外对胚胎干细胞进行诱导分化至神经前体细胞阶段,然后进行脑内移植,更有利于胚胎干细胞的存活和部位特异性分化。     

穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用

目的 探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AchE阳性神经元的影响。方法 切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14d后取两侧海马制成提取液;将神经干细胞接种于3块24孔培养板中,每板分成切割组、正常组和对照组各8孔,前2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液。第1、2块分别于第7d和14d时行MAP-2免疫荧光检测;第3块于10d时行AChE组织化学染色。计数MAP-2和AChE阳性神经元数,观察胞体大小和突起长度。结果 切割组第7d时MAP-2阳性神经元较多,胞体大、突起长,14d时细胞进一步迁移、成熟;正常组第7d时仅见少量突起短的MAP-2阳性神经元,14d时细胞稍增多,突起稍增长：对照组第7d时未见MAP-2阳性神经元,14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP-2阳性神经元。第10d切割组AChE阳性神经元较多,突起多而长,正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元,对照组未见AChE阳性神经元。结论 穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元。     

不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞比率的研究

目的 比较不同时间点人胚胎脑神经干细胞分化为神经元和胶质细胞的比例.方法 取胎龄8～12 周的人胚胎脑海马,机械分离成单细胞悬液,以2×106 个细胞/ml接种到含h-EGF、h-bFGF和h-LIF的DMEM/F12培养液中.用1?S诱导神经干细胞球分化,12 h后行RNA-结合蛋白(musashil)免疫细胞化学鉴定,分别在2、5、7、14和23 d时行β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin/Tuj1)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(galc)免疫细胞化学鉴定.结果 诱导分化12 h时细胞球中绝大部分细胞为Musashil阳性细胞,第2 d时有少量的β-ⅢTubulin和GFAP阳性细胞,未见galc阳性细胞;第7 d时β-Ⅲ Tubulin阳性细胞数目最多,约为细胞总数的48.2%,以后逐渐下降,而GFAP阳性细胞数目在第2～23 d内呈逐渐增加趋势,到第23 d时达细胞总数的65.3%;随分化时间延长,只能检测到极少量的galc阳性细胞.结论 1?S可促使人神经干细胞分化为中枢神经系统的3种主要细胞类型,且其分化为神经元和胶质细胞的比例在不同时间点上有显著差异.     

人胚胎干细胞表达生殖细胞分化相关基因的研究

目的 探讨人胚胎干细胞(hES)系H1生殖细胞分化相关基因的表达.方法 免疫荧光、碱性磷酸酶检测和核型分析等方法联合鉴定H1的基本生物学特性,RT-PCR方法检测未分化H1的生殖细胞分化相关基因的基本表达模式,分别以人正常睾丸组织和人胚胎成纤维细胞株HFF-1作为阳性和阴性对照组织.结果 H1保持正常核型并维持未分化状态.未分化H1表达减数分裂前生殖细胞标志基因STELLAR、DAZL、FRAGILIS、PUM1、PUM2和GDF3;不表达原始生殖细胞(PGCs)标志基因BLIMP-1、减数分裂特异标志基因SCP1、减数分裂启动标志基因STRA8以及生殖细胞分化后期标志基因VASA.结论 未分化Hl细胞表达生殖细胞减数分裂前标志基因,但不表达分化后期基因,BLIMP-1可能成为区分未分化hES细胞与PGCs的特异性标志基因.     

鹿茸多肽对胎大鼠脑神经干细胞体外诱导分化的实验研究

目的　探讨鹿茸多肽对胎大鼠脑神经干细胞体外分化的影响。　方法　从E12～ 14d的Wistar大鼠脑中分离扩增获得大量神经干细胞后 ,加入不同浓度的鹿茸多肽 ,观察其对胚胎神经干细胞分化的影响 ,并通过免疫组织化学染色检测神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的状况。　结果　 5 0 μg L组分化细胞总数与对照组相比有显著性差异 (P <0 0 1) ;5 0 μg L、10 0 μg L、2 0 0 μg L组神经元特异烯醇化酶 (NSE)阳性率与对照组相比有显著性差异 (P <0 0 1) ,并呈一定的剂量依赖性。　结论　鹿茸多肽在体外可明显促进神经干细胞向神经元分化 ,为鹿茸多肽应用于神经系统损伤性疾病的治疗提供了实验依据。     

不同浓度的银杏内酯B 对培养的神经干细胞分化的影响

目的探讨不同浓度的银杏内酯B对神经干细胞分化的影响。方法从新生大鼠海马中分离和培养神经干细胞。将其接种在24孔培养板中,并分成4组：20mg／L内酯B组、40mg／L内酯B组、60mg／L内酯B组和对照组。4组神经干细胞被分别加入含不同浓度银杏内酯B的DMEM／F12培养液,在培养7d和14d后,用免疫细胞化学染色方法检测其神经丝蛋白(NF)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞特异性蛋白(Oligo)的表达,并计算阳性染色细胞的百分率。结果在同一时间内不同浓度银杏内酯B组分化为NF阳性神经元样细胞的百分率都比对照组高,但不同浓度之间没有显著差异。在同一时间内不同浓度银杏内酯B对少突胶质样细胞的百分率影响不大。而不同浓度银杏内酯B组分化为GFAP阳性星形胶质样细胞的百分率都比对照组高,并随其浓度的增加而百分率增高。结论不同浓度的银杏内酯B可促进神经干细胞向神经元样细胞分化,似与其浓度关系不大;对少突胶质样细胞的百分率影响不大;对星形胶质样细胞的百分率有促进作用,并随浓度的增加而增高。     

胎儿骨髓间质干细胞体外诱导为神经细胞的初步实验研究

目的：体外定向诱导胎儿骨髓问质干细胞(MSC)分化为神经细胞。方法：采用Ficoll淋巴细胞分离液分离MSC，体外扩增、传代，采用β-巯基乙醇等诱导剂诱导MSC分化为神经细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NF200)、神经元烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，并且用RT-PCR鉴定NF200、NSE和GFAP的mRNA表达情况。结果：胎儿骨髓MSC在体外扩增第5代以后，经诱导后，形态学上可呈现神经细胞形态特征；免疫组化显示诱导出的神经细胞NF200、NSE和GFAP均有阳性表达；RT-PCR也显示诱导后表达量明显增加。结论：胎儿骨髓MSC在体外可以分化为神经细胞。     

神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的 探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响.方法 12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液, 并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU.于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测.结果 海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无.结论 切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加 NGF可促进其增殖和分化.