靶向纳米脂质超声造影剂制备及其体外寻靶能力实验研究

目的 制备一种靶向乳腺癌的纳米脂质超声造影剂,并观察其体外寻靶能力.方法 制备生物素化抗人乳腺癌细胞单克隆抗体Neu(F-11),并检测其生物素化程度和活性;通过生物素-亲和素系统制备靶向纳米脂质超声造影剂,用免疫荧光染色定性检测造影剂与抗体的连接情况,通过靶向造影剂与不同细胞的结合实验检测其寻靶能力.结果 每分子抗体可结合的生物素数目平均为7个,生物素化抗体的活性与游离单抗相比未见明显降低;免疫荧光染色显示靶向纳米脂质超声造影剂表面可见明亮的红色环状荧光,细胞结合实验显示其可与乳腺癌细胞特异性牢固结合.结论 生物素-亲和素系统可使造影剂与抗体牢固结合,所制得的靶向纳米脂质超声造影剂在体外具有较强的寻靶能力.     

靶向高分子造影剂的制备及其体外寻靶实验

目的制备一种特异性靶向肝癌细胞的高分子超声造影剂,并考察其体外寻靶能力。方法采用双乳化法制备高分子材料PLGA-COOH造影剂;并用碳二亚胺法将造影剂与抗体偶联制备出靶向高分子造影剂。检测该造影剂一般特性及体外寻靶能力,并与普通高分子造影剂做比较。结果高分子造影剂的平均粒径600.5 nm,体外寻靶试验显示,该靶向高分子造影剂较多并牢固的聚集到肝癌细胞表面;普通高分子造影剂对照组末见造影剂和细胞的结合。结论成功制备出特异性结合人肝癌抗体的靶向高分子超声造影剂。该造影剂在体外对肝癌细胞具有较强的特异性亲合力。     

携Herceptin靶向高分子造影剂的制备及体外寻靶能力研究

目的 制备一种携Herceptin的靶向高分子造影剂,并研究其体外寻靶能力.方法 通过双乳化法制备出高分子PLGA-COOH造影剂,采用碳二亚胺法将高分子PLGA-COOH造影剂与Herceptin相连制备出靶向高分子造影剂,检测其一般性质,然后通过免疫荧光法检测其与抗体的连接情况,用光镜及激光共聚焦显微镜观察其与细胞的结合能力,并与普通高分子造影剂做比较.结果 靶向高分子造影剂的粒径范围为466.8～857.6 nm,平均粒径为(662.2±69.7)nm,有85.9%的微球粒径落于该范围内,通过免疫荧光法可在荧光显微镜下观察到许多绿色点状荧光,体外寻靶能力实验显示靶向高分子造影剂能与乳腺癌细胞较好的结合.结论 成功制备出的携Herceptin的靶向高分子造影剂在体外与人乳腺癌细胞有较好的结合能力.     

以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂的制备及实验研究

目的 制备以HER2受体为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,并观察其体外寻靶能力及体外超声显像效果.方法 制备生物素化Herceptin单抗,检测其生物素化程度及生物学活性;薄膜水化-声振法制备生物素化纳米微泡,以生物素-亲和素为桥梁制备HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,观察其对SKOV3卵巢癌细胞的体外寻靶能力及靶向结合的体外超声显像.结果 平均每分子Herceptin单抗可与16个生物素分子结合;与游离单抗相比,生物素化抗体的活性未见明显降低(P＞0.05).体外寻靶实验观察:靶向纳米微泡组SKOV3细胞表面有明显的红染纳米微泡与其牢固结合,沿细胞表面排列较规则;非靶向组SKOV3细胞表面未结合红染的纳米微泡.靶向纳米微泡体外超声显像:细胞爬片与靶向纳米微泡孵育后可明显增强超声显像效果,对照组均未见明显超声显像.结论 应用生物素-亲和素系统成功构建了以HER2为靶点的纳米级超声造影剂,与SKOV3细胞结合后有明显超声显像效果.     

靶向包载经PEG修饰的重组腺病毒PLGA造影剂的制备及其体外寻靶实验

目的采用共价结合的方法制备靶向包载经PEG修饰的重组腺病毒PLGA-COOH造影剂,并考察其体外寻靶能力。方法采用碳二亚胺法将包载经PEG修饰的重组腺病毒PLGA-COOH造影剂与抗体共价结合,制备靶向高分子超声造影剂,检测该造影剂一般特性及体外寻靶能力。结果体外寻靶实验显示,该靶向超声造影剂与普通包载经PEG修饰的重组腺病毒PLGA COOH造影剂对照能聚集并牢固结合到人脐静脉血管内皮细胞表面。结论成功制备出靶向包载经PEG修饰的重组腺病毒PLGA-COOH造影剂,该靶向造影剂在体外具有较强的特异性寻靶结合能力。     

靶向VEGFR-3超声造影剂的制备及其体外寻靶实验研究

目的 制备一种特异性靶向淋巴管内皮细胞的高分子超声造影剂,并考察其体外寻靶能力.方法 采用双乳化法制备高分子造影剂羟基端乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH);并用碳二亚胺法将造影剂与抗体偶联制备出靶向高分子造影剂.检测该造影剂一般特性及体外寻靶能力,并与普通高分子造影剂做比较.结果 高分子造影剂平均粒径771.2 nm.体外寻靶试验显示,该靶向高分子造影剂较多并牢固的聚集到淋巴管内皮细胞表面;普通高分子造影剂对照组未见造影剂和细胞的结合.结论 成功制备出结合VEGFR-3抗体的高分子超声造影剂.该造影剂在体外对淋巴管内皮细胞有较强的特异性亲和力.     

LHRHa靶向微泡造影剂的制备及体外寻靶实验

目的 制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。方法 采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,以免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。结果 LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。结论 利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。     

超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响

目的 探讨超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响.方法 应用生物素-链霉亲和素连接系统,使注射用六氟化硫微泡(SonoVue)与特异性抗血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体相连接,用间接免疫荧光法检测抗体与微泡的连接,用马尔文激光粒径分析仪分别测定生物素化处理前后微泡的粒径,采用超声诊断仪评价微泡靶向化构建前后的显像效果.结果 SonoVue与特异性抗体成功连接,间接免疫荧光检测呈阳性.生物素修饰后的微泡粒径分布变窄,与普通微泡的超声显像效果略有差异.结论 通过生物素-链霉亲和素系统可以成功靶向化构建超声微泡,靶向化处理因素对微泡的粒径有一定影响,对微泡的超声显影效果略有影响.     

预定位技术用于超声分子成像的体外实验

目的 探讨预定位技术提高超声造影剂靶向肿瘤细胞的能力。方法 采用两步法预定位技术靶向SKOV-3卵巢癌细胞：第一步加入生物素化的CEA抗体,第二步加入结合链霉亲和素的造影剂。结果 制备的结合链霉亲和素的PLGA造影剂平均粒径为（346.20±74.49）nm。链霉亲和素与造影剂的连接效率为（95.02±0.62）%。预定位靶向组细胞结合的造影剂明显多于其余各组。结论 预定位技术能提高造影剂的靶向性,可提高超声分子成像的敏感性。     

靶向血管内皮生长因子受体2超声造影剂的制备及其体外寻靶能力实验研究

目的:制备靶向血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)超声造影剂,评价其物理性质及对肿瘤细胞的寻靶能力。方法:利用生物素-亲和素桥接法将微米级超声造影剂USphere与VEGFR2抗体结合,制备靶向VEGFR2超声造影剂,检测其粒径分布;用免疫荧光法检测不同细胞株(高转移肝肿瘤细胞MHCC-97H及正常肝细胞LO2)中VEGFR2表达强度,以及靶向与非靶向VEGFR2超声造影剂对MHCC-97H和LO2细胞的结合能力。结果:靶向VEGFR2超声造影剂微泡分布均匀,平均粒径(1 012.67±78.59)nm,免疫荧光法显示VEGFR2抗体可特异性连接于微泡表面。标记荧光的VEGFR2抗体在MHCC-97H细胞高表达,在LO2细胞低表达。免疫荧光定量显示靶向VEGFR2造影剂在MHCC-97H细胞中的荧光强度比值(微泡荧光强度/细胞荧光强度)为0.75±0.32,显著高于其他3组(P0.01)。结论:本研究成功制备靶向VEGFR2超声造影剂,其大小稳定均一,可与高表达VEGFR2的MHCC-97H细胞特异性结合。     

携Gelsolin单抗靶向超声造影剂的制备及体外靶向实验

目的 制备一种以肿瘤淋巴转移相关特异性膜抗原蛋白——凝溶胶蛋白（Gelsolin）为靶点的纳米级高分子造影剂,并观察其体外寻靶及显影能力。方法 通过改良的双乳化法制备高分子PLGA-COOH造影剂,以碳二亚胺法将造影剂与Gelsolin单抗连接,制备出GSN-PLGA靶向超声造影剂。检测该造影剂的一般性质,评估Gelsolin单抗与造影剂表面连接情况,评价其体外寻靶能力并进行体外显影实验。结果 GSN-PLGA靶向超声造影剂平均粒径为（575.67±4.71）nm,表面电位（-11.46±1.19）mV,造影剂表面GSN单抗结合率达96.93%。体外摄取实验显示细胞表面高表达Gelsolin抗体的小鼠腹水型肝癌高淋巴转移细胞株（Hca-F细胞）可较多摄取GSN-PLGA靶向造影剂。体外显像实验显示靶向超声造影剂体外显影效果较好。结论 GSN-PLGA靶向超声造影剂可与高表达Gelsolin的Hca-F细胞特异性结合,且体外显影效果较好。     

携抗P-selectin靶向超声造影剂犬体内超声分子成像

目的 制备携抗P-selectin靶向超声造影剂,探讨其评价心肌缺血再灌注损伤的超声分子成像效果。方法 采用“生物素-亲和素”桥接法制备携抗P-selectin靶向超声造影剂,建立犬心肌缺血再灌注模型,分别注入携抗P-selectin靶向超声造影剂（MBp）和空白超声造影剂（MBc）,行心肌声学造影检查,采图、存盘。应用DFY型超声图像定量分析诊断仪中的彩色编码技术对存储的图像进行脱机处理,观察MBp体内超声分子成像效果。结果 成功制备携抗P-selectin靶向超声造影剂及建立犬心肌缺血再灌注模型。彩色编码图像示MBp行心肌声学造影可见缺血再灌注区心肌显著增强;MBc于缺血再灌注区心肌造影无明显增强。结论 应用携抗P-selectin靶向超声造影剂行心肌声学造影检查能准确检测再灌注治疗后犬心肌缺血再灌注损伤。     

叶酸受体靶向液态氟碳纳米粒造影剂的制备及体外寻靶

目的 制备叶酸受体靶向的被脂质包裹的液态氟碳纳米粒造影剂,鉴定其基本性质,观察其体外靶向性能.方法 以氯仿将偶联叶酸的磷脂[DSPE-PEG(2000)]按照一定比例溶解在成膜材料中,用旋转蒸发仪去除有机溶剂成膜,加入磷酸盐缓冲液重新水合后,在悬液中逐滴加入适量液态氟碳,均质乳化后得到叶酸受体靶向的纳米粒造影剂.在人卵巢癌SKOV3细胞中验证该造影剂的靶向性能(靶向造影剂组),并与不带叶酸的普通造影剂组和游离叶酸干预组相比较.结果 叶酸受体靶向液态氟碳纳米粒造影剂外观与普通造影剂无明显差别.体外靶向实验发现此纳米粒造影剂聚集且牢固地黏附于SKOV3细胞,而普通造影剂组和游离叶酸干预组则未见明显特异性结合.结论 成功制备了偶联叶酸的被脂质包裹的液态氟碳纳米粒造影剂,该造影剂对高表达叶酸受体的SKOV3细胞具有较强的亲和力,有望成为卵巢癌靶向显影与治疗的理想分子探针.     

携紫杉醇和抗人表皮生长因子受体2抗体高分子造影剂的制备及体外寻靶实验研究

目的制备一种携紫杉醇和抗人表皮生长因子受体2（HER-2）抗体的高分子造影剂,并考察其体外寻靶能力及体外显像效果。 方法通过双乳化法及碳二亚胺法制备携紫杉醇和抗HER-2抗体的高分子造影剂,并对其一般性质进行检测,激光共聚焦显微镜观察制备的靶向载药造影剂与SKBR-3乳腺癌细胞的结合能力,并使用高频超声观察其体外显影效果。 结果载药靶向羧基端乳酸（PLGA）纳米粒平均粒径为（318.07±12.51）nm,表面电位（-2.16±0.31）mV,包封率为（60.00±3.40）%,载药量为（6.00±0.34）%,粒子呈规则球形,大小均一,分散性好。激光共聚焦显微镜观察到抗HER-2抗体和羧基端乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA-COOH）造影剂大量结合,流式细胞术观察到两者的结合率高达（99.59±0.42）%,体外寻靶实验示靶向载药高分子超声造影剂与SBKR-3乳腺癌细胞较强的结合在一起。体外成像实验显示,靶向载药高分子造影剂显像呈细腻均匀点状强回声。 结论成功制备了携抗HER-2抗体和紫杉醇高分子造影剂,该纳米粒相关性能良好,有较高的载药量及包封率,且与高表达HER-2受体的乳腺癌细胞有较强结合能力,有较好的体外显像效果。     

靶向BST2微泡造影剂的制备及其与肿瘤细胞的体外结合能力

目的 制备骨髓基质抗原蛋白(BST2)靶向微泡造影剂,观察其与小鼠前列腺癌细胞(RM-1)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)的体外结合能力,探讨BST2作为前列腺癌潜在靶点的可行性.方法 通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法对BST2在两种细胞中的表达进行对比分析.采用生物素-亲和素桥连技术制备BST2靶向脂质微泡,普通光镜下观察BST2靶向微泡造影剂,并采用Accu Sizer 780A粒度仪进行表征,以非靶向微泡作为对照,比较其与RM-1和4T1两种肿瘤细胞系的结合特性及结合率.结果 BST2在RM-1细胞中的表达高于在4T1细胞中的表达;BST2靶向微泡与RM-1细胞的黏附率明显高于其与4T1细胞的黏附率,并远远高于非靶向微泡的黏附率.结论 BST2靶向微泡造影剂可与RM-1细胞特异性结合,有望作为前列腺癌的特异性超声分子探针用于前列腺癌的靶向分子成像.     

"适配子-PLGA纳米粒"靶向超声/光声相变造影剂的制备

目的 研制一种适配子偶联的包裹纳米金棒和液态氟碳的PLGA纳米粒。方法 采用双乳化法制备包裹纳米金棒及全氟己烷(PFH)的PLGA纳米粒(GNP);用碳二亚胺法将适配子与PLGA纳米粒连接获得"适配子-PLGA纳米粒"靶向相变造影剂(AP-GNP)。光镜、激光共聚焦显微镜及电镜下观察及检测AP-GNP基本性质;激光共聚焦显微镜下及流式细胞术观察及检测适配子与纳米粒连接情况;以激光仪辐照AP-GNP观察其光致相变情况;观察AP-GNP与乳腺癌细胞MCF-7特异性结合情况。结果 成功制备适配子修饰的包裹纳米金棒和PFH的PLGA纳米粒, 其平均粒径为(472.43±25.82)nm, 适配子与纳米粒的连接率为达97.98%;激光辐照AP-GNP后, 光致相变效果明显;AP-GNP粘附于MCF-7细胞周围, 未修饰适配子GNP未见明显特异性结合。结论 成功制备偶联的包裹纳米金棒和PFH的PLGA纳米粒, 其光致相变效果明显, 靶向性能良好。     

载印度墨水相变型光声/超声双模态造影剂的制备及体外显影

目的 制备一种新型的光声/超声双模态造影剂,观察其体外光致相变作用以及光声/超声显影效果。方法 采用多步乳化法 合成载印度墨水及全氟己烷(PFH)的高分子微球(i-PFH-PLGA),检测其基本理化性质、光致相变作用及体外增强光声及超声成像的显像效果。结果 制备的i-PFH-PLGA呈球型,平均粒径为(542.1±68.91)nm。经激光辐照后,显微镜下可观察到较多的i-PFH-PLGA纳米粒发生液气相转变产生微泡;体外光声成像实验显示,i-PFH-PLGA纳米粒可检测到明显的光声信号,且光声信号的强度随纳米粒浓度的增加而增强;体外超声成像实验显示,经激光照射后,i-PFH-PLGA纳米粒组回声强度较辐照前明显增强(P<0.05),而单纯的液态氟碳和印度墨水辐照前后回声强度未见明显改变。结论 成功制备出的载印度墨水和液态氟碳的双模态造影剂可用于体外光声/超声成像研究。     

The potential of a new stable ultrasound contrast agent for site-specific targeting. An in vitro experiment

Microbubble-based ultrasound contrast agents can be used for specific site targeting, but demonstrate time-limited opacification. We have previously demonstrated the potential of gold-bound microtubules to provide a stable ultrasound contrast effect. Aim of the present study was to test the feasibility of gold-bound microtubules specifically to bind to human thrombi and to inflammatory activated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vitro. HUVEC were incubated with tumor necrosis factor, to induce expression of adhesion molecules. Human clots and HUVEC were incubated with biotinylated monoclonal antifibrin and anti-E-selectin antibodies, respectively. Probes were incubated with excess avidin followed by biotinylated gold-bound microtubules and by secondary Cy3-anti-beta-tubulin antibody and processed for immune fluorescence microscopy. Clots were transferred in copolymer foils filled with buffer and were ultrasonographically imaged before and after their treatment with the antifibrin antibody and with biotinylated microtubules, using a broadband harmonic transducer, transmitting and receiving at a mean frequency of 1.7 MHz and 3.2 MHz. The feasibility of specific gold-bound microtubules conjugation to antibody treated clots and HUVEC was confirmed using immune fluorescence analysis. Contrast intensities of the clots significantly increased after their treatment with antifibrin antibody and incubation with gold-bound microtubules (39 +/- 2 dB versus 26 +/- 2 dB, p < 0.001) and remained high after 20 min of ultrasound exposure (37 +/- 2 dB versus 39 +/- 2 dB, p = NS). Thus, gold-bound microtubules can specifically bind to human thrombi and to endothelial cells, providing a significant contrast effect which remains stable in the ultrasound field. This may be a promising approach to target thrombi and inflammatory active atherosclerotic plaques.