间日疟原虫重组蛋白用于检测间日疟患者抗体水平的观察

目的观察间日疟原虫重组蛋白PvMSP1-19用于检测间日疟患者抗体水平的效果。方法采用His-tag亲和层析柱对间日疟原虫PvMSP1-19重组蛋白初步分离,再经快速蛋白液相色谱仪（FPLC）XK16/70 Superdex75预装柱进一步纯化和Western blot分析。用纯化后的PvMSP1-19重组蛋白包被ELISA板,检测间日疟现症患者、既往感染者和正常人血浆IgG1、IgG4、IgM、IgD、IgE抗体水平。结果间日疟现症患者血浆中抗PvMSP1-19 IgG1抗体水平明显高于间日疟既往感染者和正常人（t=5.535,P〈0.05）。结论间日疟现症患者血浆中含有高水平的抗PvMSP1-19抗体IgG1。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的 在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性.方法 将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性.结果 重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应.结论 PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

动物疟原虫与人疟原虫的交叉反应抗原

目的分析5种疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫,食蟹猴疟原虫、伯氏症原虫,约氏疟原虫）中,可被间日疟、恶性疟病人血清识别的交及反应抗原。方法用50％、60％Percoll不连续梯度分离疟原虫感染红细胞,20mmolPBS被红细胞后,收集红内期原虫,以1％NP—40提取可溶性抗原。各种抗原经SDS—PAGE电泳后,转移至硝酸纤维膜上,分别用间日疟、恶性疾病人血清进行免疫识别。结果3神动物疟原虫红内期抗原中有多条蛋白区带可被间日疟或恶性疟病人血清识别。其中合蟹报疟原虫有14条蛋白带被间日疟病人血清识别,伯氏疟原虫有16条蛋白区带被恶性疟病人血清识别,分别多于其它疟原虫。间日疟病人血清可识别5种疟原虫共有的72kD蛋白,而恶性疟病人血清不识别该蛋白。结论人疟原虫和动物疟原虫之间有一系列支又反应抗原。会压滤疟原虫与间日疟原虫,伯氏疟原虫与恶性疟原虫之间抗原相似程度高于其它疟原虫。72kD．蛋白在间日疟无疾学诊断方面可能有实用价值。     

人微小病毒B19VP1基因原核表达克隆的构建

目的：构建人微小病毒B19 VP1基因的原核高效表达系统。方法：通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇VP1区段基因，将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，IPTG诱导表达融合蛋白，产物经亲和层析初步纯化，以Western-Blot进行鉴定，并包被ELISA板，对临床血清进行检测。结果：pGEX-4T-2-VP1可在大肠杆菌中高效表达，表达产物经纯化后可得单一目的蛋白条带。ELISA结果表明，其灵敏度、特异度等指标与德国Virion试剂盒有较好的符合率。结论：该重组蛋白具有良好的抗原性，为研制和开发具有我国独立知识产权的B19病毒基因工程抗原ELISA诊断试剂盒提供了有价值的资料。     

恶性疟的两种重组复合抗原的纯化与鉴定

用我们构建的高效表达恶性疟原虫复合抗原融合蛋白的工程菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９进行发酵培养，收集菌体经超声波破菌、硫酸铵分级沉淀、分子筛层析、离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８２．０％。纯化后的融合蛋白保持β－半乳糖苷酶的活性。用等电聚焦技术测定纯化蛋白等电点分别为８．４０和８．２５．用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体及疟区病人血清发生特异性免疫反应。重组蛋白加弗氏佐剂免疫家兔制备的抗血清可与４种工程菌表达产物发生特异免疫反应，并可识别恶性疟原虫海南株和云南株红内期抗原。说明纯化的重组融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复会抗原。     

间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达与初步鉴定

目的:克隆间日疟原虫醛缩酶(Plasmodium vivax aldolase,PvALD)基因,体外表达和鉴定重组PvALD蛋白。方法:PCR法从间日疟患者血液DNA样品中扩增PvALD基因,构建pET32c-PvALD重组表达质粒,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),诱导表达带有His标签的重组蛋白,并对PvALD在E.coli中表达进行优化,观察诱导时间、诱导剂浓度、培养基种类对该蛋白原核表达的影响。采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,相应表达物分别采用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。结果:PvALD的PCR产物分子量为1.1 kb,重组质粒pET32c-PvALD经测序验证,其插入片段序列与GenBank参考序列相似性为100%,转化E.coli所表达的重组蛋白分子量约为60 kD。PvALD在LB中1 mmol/L IPTG诱导6 h条件下获得最佳的表达效果。亲和层析纯化后的PvALD经SDS-PAGE电泳检测,呈现单一条带,Western blot分析结果显示,该重组蛋白只能被间日疟患者血清特异性识别,而不能被恶性疟患者血清识别。结论:成功克隆了PvALD基因,表达了重组PvALD蛋白,为以PvALD作为靶标的间日疟快速诊断方法提供了基础。     

人BLyS基因克隆，表达和抗人BLyS单克隆抗体的制备

目的 研制抗人BLyS单克隆抗体，以进一步探人BLyS与自身免疫性疾病的关系。方法 将人BLyS基因克隆到融合蛋白原核表达载体pEGX-4T-1中，构建重组质凿pGEX-4T-1/hBLyS,用此重组质粒转化大肠杆菌BL21，加IPTG诱导大肠杆菌表达GST－hBLyS融合蛋白，用此融合蛋白免疫BALB/c鼠，聚鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用ELISA法筛选阳性克隆，用免疫印迹和流式细胞仪进一步鉴定抗体的特异性。结果 重组质粒双酶切结果和DNA序列测定以及表达蛋白SDS－PAGE电泳结果表明，pGEX-4T-1/hBLyS重组质粒可以正确表达GST－hBLyS融合蛋白；ELISA，免疫印迹和流式细胞仪检测结果表明，1c6杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合人T淋巴细胞膜表面BLyS的膜外区，属于IgG2b亚类。结论 所获得的单克隆抗体具有能够结合人工T淋巴细胞上的BLyS特异性，可用于研究BLyS与自身免疫性疾病的关系。     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

铜绿假单胞菌Quorum-Sensing系统中rhlR基因的克隆表达及其免疫保护性研究

目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

人疱疹病毒8型感染的间接ELISA检测方法的建立

目的〓〖HTK〗建立人疱疹病毒8型（HHV-8）感染的间接ELISA检测方法，并初步探讨其应用价值。〖HTW〗方法〓〖HTK〗利用PCR技术获得HHV-8 ORF73C基因，插入到原核表达载体pGEX-6P-1中，在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导蛋白表达；以纯化的GST-ORF73C融合蛋白为包被抗原，利用方阵滴定法确定包被抗原和抗血清的最适工作浓度，并通过阻断试验、交叉试验、特异性试验、重复性试验及与Chou等建立的K8.1合成多肽-ELISA检测方法进行试验比较等评价其效果。〖HTW〗结果〓〖HTK〗SDS-PAGE及Western-blot检测结果显示，目的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，且表达产物能被KS阳性血清［HIV(+)/KS(+)血清］特异性识别；方阵滴定试验显示：包被抗原的最佳浓度为1.5μg/mL，血清抗体的最佳稀释度为1∶80；阻断试验、交叉试验、特异性试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性好；对86份HIV（+）/KS（-）血清样品进行检测的结果显示，该方法与Chou等建立的K8.1合成多肽-ELISA检测方法的符合率为98.8％。〖HTW〗结论〓〖HTK〗GST-ORF73C-ELISA检测方法具有良好的特异性和重复性，可用于HHV-8感染的血清学检测及流行病学调查。     

高危HPV16 E4基因的表达纯化及临床应用

目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)16 E4重组表达体并表达纯化获得HPV16 E4重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16 E4血清抗体反应与宫颈癌的相关性.方法:将HPV16 E4基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E4表达重组体,转化大肠杆茵BL21(DE3)并用IPTG诱导表达.表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被酶联免疫吸附实验(ELISA)板,检测正常女性、慢性宫颈炎和宫颈癌患者血清抗体.结果:pRSET-16E4表达重组体的工程茵经IPTG诱导后可表达M15×103的HPV16 E4组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的30%.表达形式为包涵体,重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实.80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者中,其血清抗体阳性率分别为10.00%,39.13%和28.13%,宫颈癌患者HPV16 E4血清抗体阳性率显著高于正常人,且慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率也显著高于正常人,但宫颈癌组HPV16 E4血清抗体阳性率与慢性宫颈炎组间的差异无统计学意义.结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16 E4融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌和慢性宫颈炎患者HPV16 E4血清抗体阳性率均明显高于正常人.     

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的 获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白.方法 以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a( )并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达.用Ni2 NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2 -NTA琼脂糖柱分离目的 蛋白.SDS-PAGE和免疫印迹分析目的 蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性.结果 获得1373 bp的TrC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a( )-TTC并在大肠杆菌中表达.TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22％,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5％的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1:25 600.结论 所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原.     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

结核分枝杆菌蛋白Rv0315的克隆表达及其抗原性研究

目的评价结核分枝杆菌重组蛋白Rv0315在结核病血清学诊断中的价值。方法采用常规分子克隆方法获得重组Rv0315蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测84份确诊结核病人血清和48份健康人血清中相应的抗结核抗体水平,并与结核分泌蛋白ESAT-6的检测结果进行比较。结果成功构建了重组蛋白Rv0315,其在E.coli BL21plysS（DE3）中主要以可溶性形式表达,分子量（30.3kDa）与预期相符,ELISA血清学活性评估显示其特异性和敏感性分别为94.0%（45/48）和35.7%（30/84）。结论重组蛋白Rv0315有望成为新的结核病血清学诊断候选抗原。