补肾活血中药复方对AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响

目的:探讨补肾活血中药对体外糖基化终末产物(AGEs)条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法:体外纯化培养7天SD大鼠视网膜Müller细胞至P2代;中药血清药理学方法制备补肾活血中药含药血清;体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞置于AGEs状态下,以补肾活血中药含药血清干预,检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果:(1)低AGEs组较正常对照组LDH值有升高趋势,其差异无统计学意义(P0.05);高AGEs组较正常对照组LDH值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05)。(2)正常中药干预组与正常对照组LDH值比较,其差异无统计学意义(P0.05)。(3)AGEs中药干预组较AGEs组LDH值明显降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论:AGEs条件可导致体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞细胞膜稳定性下降,通透性增加,细胞活力降低,补肾活血中药含药血清可提高AGES条件下视网膜Müller细胞活力,这可能是补肾活血中药防治糖尿病性视网膜病变(DR)的药物干预途径之一。     

补肾活血方对AGEs条件下体外纯化培养大鼠视网膜Müller细胞HIF-1α介导缺氧信号通路的影响

目的观察在晚期糖基化终末产物(AGEs)条件下,补肾活血方含药血清对大鼠视网膜Müller细胞的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)缺氧信号通路的影响。方法采用SD大鼠制备补肾活血中药含药血清和空白血清,以终浓度50 mg/L的AGEs作为低AGEs条件,终浓度100 mg/L的AGEs作为高AGEs条件,将体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞分为6组,分别置于加入空白血清、中药含药血清、空白血清+低AGEs、空白血清+高AGEs、中药含药血清+低AGEs、中药含药血清+高AGEs的DMEM培养基中,培养48 h后酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞外液中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)含量,逆转录-聚合酶链法(RT-PCR)测定各组Müller细胞HIF-1αm RNA、VEGFm RNA表达量,比较差异。结果 1.低AGEs组较正常对照组HIF-1α值有升高趋势,但差异无统计学意义(P0.05),HIF-1αm RNA值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05),高AGEs组较正常对照组HIF-1α、HIF-1αm RNA值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05);低、高AGEs组较正常对照组VEGF、VEGFm RNA值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05)。2.正常中药干预组HIF-1α、VEGF、HIF-1αm RNA、VEGFm RNA值接近正常对照组,差异无统计学意义(P0.05)。3.低、高AGEs中药干预组HIF-1α、VEGF、HIF-1αm RNA、VEGFm RNA值均较对应的低、高AGEs组明显降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论补肾活血方含药血清可抑制视网膜Müller细胞在AGEs条件下HIF-1α介导缺氧信号通路的高表达,这可能是补肾活血方防治DR的机制之一。     

通窍活血方对体外培养的视网膜Müller细胞缺氧状态下谷氨酸摄取功能的影响

目的:观察在缺氧条件下视网膜Müller细胞谷氨酸(Glu)摄取功能的改变,以及通窍活血中药复方对这种改变的影响。方法:体外纯化培养SD大鼠视网膜Müller细胞7d至P2代,分6组,分别采用空白血清、含药血清、空白血清与不同剂量连二亚硫酸钠、含药血清与不同剂量连二亚硫酸处理,测定视网膜Müller细胞在各实验条件下谷氨酸(Glu)摄取功能。结果 :缺氧条件下Müller细胞Glu摄取功能较正常状态下明显下降(P0.05);与缺氧组比较,经通窍活血中药复方含药血清干预后缺氧条件下Müller细胞Glu摄取功能明显升高(P0.05)。结论:通窍活血中药复方含药血清可明显改善缺氧条件下Müller细胞Glu摄取功能,这可能是通窍活血复方对青光眼患者视神经保护的药物干预途径之一。     

补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF及VEGF的影响

目的观察补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法应用改进的酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将其分为正常对照组(NC组)、正常中药干预组(NCM组)、低AGEs组(LA组)、高AGEs组(HA组)、低AGEs中药干预组(LAM组)、高AGEs中药干预组(HAM组)、模拟缺氧组(SH组)、模拟缺氧中药干预组(SHM组),用酶联免疫吸附法(ELISA)对相关干预条件下体外培养视网膜Müller细胞上清液进行VEGF及PEDF含量的测定。结果 (1)VEGF表达量:(1)24、48、72 h时,SH组、LA组、HA组视网膜Müller细胞VEGF表达量均高于NC组,差异均有统计学意义(P0.05);HA组、SH组表达量均高于LA组,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)24 h时,SH组表达量高于HA组;48 h时,SH组表达量低于HA组,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)除72 h NCM组VEGF表达量与NC组相比,差异无统计学意义(P0.05)外,其余时段有中药干预组的表达量均较对应无中药干预组降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(4)SH组、LA组、HA组、LAM组、HAM组、SHM组细胞48、72 h时VEGF表达量均较前一时段增高,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)PEDF表达量:(1)SH组、LA组、HA组各个时段视网膜Müller细胞PEDF表达量较NC组降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)24、72 h时,HA组、SH组PEDF表达量较LA组降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)24h时,SH组PEDF表达量较HA组降低,差异有统计学意义(P0.05)。(4)24、72 h NCM组、LAM组,24、48、72 h HAM组,24 h SHM组视网膜Müller细胞PEDF表达量均较对应无中药干预组增高,差异有统计学意义(P0.05)。(5)LA组、HA组、SH组、LAM组、HAM组、SHM组48、72 h时细胞PEDF表达量均较前一时段降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)VEGF/PEDF比值:(1)NC组、NCM组各时段其比值几乎相同,表明视网膜Müller细胞VEGF与PEDF的量处于相对平衡的状态。(2)LA组、HA组、SH组、各时间点其比值较NC组均有不同程度的升高。(3)LA组、HA组、SH组比值均随着时间的延长而升高;LAM组、HAM组、SHM组比值均随着时间的延长而升高,但较之LA组、HA组、SH组,其升高幅度降低。结论 (1)AGEs以及缺氧均可导致视网膜Müller细胞分泌VEGF增加、PEDF减少,并且这种改变在HA组比LA组更明显。(2)在AGEs以及缺氧条件下,补肾活血中药复方含药血清可降低视网膜Müller细胞VEGF的表达,提高PEDF蛋白的表达,这可能是补肾活血法防治糖尿病视网膜病变(DR)的药物干预途径之一。(3)正常状态下视网膜Müller细胞的VEGF与PEDF呈动态平衡;AGEs以及缺氧条件下不仅使视网膜Müller细胞VEGF与PEDF的动态平衡均被打破,并且AGEs对视网膜Müller细胞VEGF与PEDF动态平衡的损害程度与AGEs浓度有关。(4)补肾活血中药含药血清可减轻在AGEs以及缺氧条件下VEGF与PEDF的不平衡,这可能是其防治DR的一个重要作用机制。     

补肾活血法对Müller细胞谷氨酸摄取功能的影响

目的 探讨补肾活血中药含药血清对高糖条件下Müller细胞谷氨酸(Glutamate,Glu)摄取功能的影响.方法 以改良酶消化法体外培养大鼠Müller细胞;根据[3H]标记的D,L- Glu摄入量判断Müller细胞的Glu摄取功能.结果 在高糖条件下Müller细胞的Glu摄取功能一过性提高,随时间推移其对Glu的摄取功能又明显下降;中药含药血清对正常条件下Müller细胞Glu摄取功能的提高在用药后24小时时段最为明显,对高糖条件下Müller细胞Glu摄取功能的提高在用药后48小时时段最为明显.结论 高糖条件所引起的Müller细胞糖酵解在短时间内旺盛可能是Müller细胞Glu摄取功能一过性提高的原因之一;Müller细胞对短期高糖条件可能有一定耐受性,持续的高糖最终会导致Müller细胞的损伤;中药含药血清可减轻高糖条件下Müller细胞Glu摄取功能的下降,这可能是补肾活血法防治糖尿病视网膜病变的干预途径之一.     

补肾活血中药对TGF-β_2及高糖状态下体外培养的视网膜Müller细胞活力的影响

目的探讨高糖及转化生长因子-β2（Transforming growth factor,TGF-β2）和高糖同时存在条件对体外培养的Müller细胞活力的影响,以及补肾活血中药的干预作用。方法以改良酶消化法体外培养大鼠Müller细胞,将P3细胞分别置于模拟正常、高糖、TGF-β2及TGF-β2和高糖同时存在条件下进行培养,并以补肾活血中药复方含药血清进行干预。实验分为正常对照组、TGF-β2组、高糖组、TGF-β2＋高糖组、正常中药干预组、TGF-β2＋高糖中药干预组;分别在试验干预12h、24h及48h后,以490型酶标仪测定各组细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出量。结果 TGF-β2组和高糖组12h和24h的LDH漏出量与正常对照组比较均无明显差异（P〉0.05）,但48h的LDH漏出量均较正常对照组增多（P〈0.05）;TGF-β2组24h的LDH漏出量较高糖组增多（P〈0.05）;TGF-β2＋高糖组24h和48h的LDH漏出量均较TGF-β2组减少（P〈0.05）;TGF-β2＋高糖组48h的LDH漏出量较高糖组减少（P〈0.05）;补肾活血中药血清能降低24h时TGF-β2和高糖同时存在条件下LDH的漏出量,降低各时段正常条件下的LDH漏出量（P〈0.05）。结论 Müller细胞对短期高糖状态以及浓度为150pg/ml的TGF-β2短期干预可能有一定的耐受性,但当高糖（50mol/l）以及TGF-β2（150pg/ml）干预48h后Müller细胞活力明显降低;补肾活血中药复方含药血清能提高正常及高糖和TGF-β2同时存在条件下视网膜Müller细胞膜的稳定性、增强Müller细胞活力可能是补肾活血中药复方防治糖尿病性视网膜病变的另一药物干预途径。     

丹参脂溶性成分对AGEs条件下视网膜Müller细胞HIF-1及谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的:研究丹参脂溶性成分对体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞在糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)条件下乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的漏出量、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)及谷氨酰胺合成酶表达的影响。方法:以5μg/ml的丹参脂溶性成分及5μg/ml丹参酮IIA分别干预视网膜Müller细胞,以ELISA法分别测定在正常及高、低浓度AGEs(150μg/ml、75μg/ml)条件下LDH漏出量以及HIF-1、谷氨酰胺合成酶的表达情况。结果:在正常及AGEs条件下,各组Müller细胞LDH的漏出量48 h较24 h明显减少,72 h较48 h明显增多,丹参脂溶性成分及丹参酮IIA组LDH漏出量较空白对照组小;在AGEs条件下,空白对照组HIF-1表达量较正常条件下显著增高;谷氨酰胺合成酶的表达量显著低于正常条件。丹参酮IIA、丹参脂溶性成分组与空白对照组相比,均能显著抑制HIF-1表达,增加谷氨酰胺合成酶的表达。结论:各实验组Müller细胞活力均呈现先升高、后降低,在48 h时Müller细胞膜活力最高。因此选择48 h作为最佳干预时间。AGEs能明显提高大鼠视网膜Müller细胞HIF-1的表达,抑制谷氨酰胺合成酶的表达。丹参脂溶性成分及丹参酮IIA均能抑制AGEs条件下大鼠视网膜Müller细胞HIF-1的表达,增强谷氨酰胺合成酶的表达,从而降低血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的生成量以及谷氨酸(Glutamate,Glu)的浓度,研究结果为进一步探讨丹参脂溶性成分治疗糖尿病性视网膜病变作用机制提供了一定的实验依据。     

活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸环境下 对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶蛋白表达及活性的影响

目的 研究活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸(GLU)环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)、谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达及活性的影响。方法 将40只健康SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,每组10只。银杏叶组予银杏叶片水溶剂5. 2 mg/kg灌胃,活血通络利水方低剂量组予活血通络利水方合剂20 g/kg灌胃,活血通络利水方高剂量组予活血通络利水方合剂40 g/kg灌胃,正常组予等容积0. 9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃7 d后,腹主动脉取血后离心收集血清备用。培养Müller细胞,分别用不同浓度的GLU(0、0. 1、0. 5、1、10、20、25、30 mmol/L)干预24 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测Müller细胞存活率。Müller细胞分为正常组、模型组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,正常组和模型组每孔加入正常血清0. 5 m L、培养基2 m L,银杏叶组每孔加入银杏叶含药血清0. 5 m L、培养基2 m L,活血通络利水方低、高剂量组每孔分别加入活血通络利水方20、40 g/kg含药血清0. 5 m L、培养基2 m L。除正常组外,其余4组均加入GLU 25 mmol/L。相同条件下培养24 h后提取总蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot)检测各组Müller细胞中GLAST、GS蛋白表达水平;用高效液相色谱法(HPLC)检测各组细胞培养液中GLU含量。结果 MTT实验结果显示,GLU干预24 h后,与0 mmol/L浓度GLU比较,10 mmol/L及以下低浓度GLU细胞存活率升高(P 0. 05); 20、25、30 mmol/L浓度GLU细胞存活率逐渐降低(P 0. 05),其中25 mmol/L浓度GLU细胞存活率下降至约0. 67。Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组GLAST、GS蛋白表达水平均降低(P 0. 05);与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组GLAST、GS蛋白表达水平均升高(P 0. 05),且活血通络利水方高剂量组的上调高于银杏叶组(P 0. 05),与正常组比较差异无统计学意义(P0. 05)。高效液相色谱(HPLC)检测结果显示,与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组的胞外GLU含量均降低(P 0. 05);与银杏叶组比较,活血通络利水方低、高剂量组Müller细胞胞外GLU含量比较差异无统计学意义(P0. 05)。结论 在25 mmol/L GLU浓度环境下,活血通络利水方能够上调Müller细胞GLAST、GS蛋白表达和活性,促进细胞摄取胞外GLU,以维持GLU代谢平衡。     

补肾活血中药对体外培养成骨细胞活性的影响

目的研究补肾活血中药对体外培养成骨细胞活性的影响.方法取二次酶消化法培养的胎鼠颅骨第三代成骨细胞,随机分为5组,即:细胞对照组、空白血清组、含药血清组、原药组、阳性对照药α D3组,分别加入普通细胞培养液、含空白血清及不同浓度补肾活血中药含药血清、补肾活血中药原药液、阳性对照药(αD3)的条件培养液,分别在培养第3天和第6天进行各试验组成骨细胞碱性磷酸酶及骨钙蛋白分泌量测定,观察补肾活血中药含药血清及原药液对成骨细胞活性的影响.结果含药血清组成骨细胞活性指标碱性磷酸酶(ALP)值在培养第3天均低于空白血清组,且与含药血清浓度呈负相关关系;第6天,含药血清组各浓度组ALP值明显升高,均显著高于空白血清组,ALP值与含药血清浓度存在正相关关系;空白血清组ALP值在培养第6天时下降,其均值低于培养第3天ALP值.培养第3天及第6天,各浓度原药组ALP值均高于细胞对照组及αD3组;ALP值与原药浓度呈正相关关系.含药血清组及中药原药组骨钙素(OC)含量显著高于空白血清及其他各对照组.结论补肾活血中药含药血清及原药能够直接作用于体外培养的成骨细胞,促进成骨细胞增殖,增强其分泌活性;可延长成骨细胞活性分泌期,使其活性分泌高峰后移而峰值升高,增加其活性分泌总量.     

丹参提取物对糖基化终末产物/缺氧条件下视网膜Müller细胞低氧诱导因子-1α作用的谱效关系研究

目的探讨丹参提取物对糖基化终末产物(AGEs)/缺氧条件下视网膜Müller细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的药理作用与化学成分之间的关系,并以丹参酮IIA为对照,初步探索丹参治疗糖尿病性视网膜病变(DR)的药效物质基础。方法采用HPLC法建立10批丹参提取物的指纹图谱,获得各特征峰的峰面积。在AGEs/缺氧条件下培养视网膜Müller细胞,并测定丹参提取物给药组及丹参酮IIA对照组HIF-1α的表达量。结合灰色关联分析法与偏最小二乘法回归分析成分与药效之间的谱效相关性。结果根据10批样品指纹图谱共标示出17个特征峰。与模型组相比,10批样品及丹参酮IIA对照组均能降低视网膜Müller细胞HIF-1α的表达量。谱效相关性研究显示峰1、5、6、9、10、11、12、14、15、16代表的化学成分对抑制HIF-1α表达具有较大的贡献。结论初步确定15,16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA及6个尚未确定结构的成分(峰1、5、6、9、14、15)为丹参治疗DR的可能药效物质。     

补肾复脉液对缺氧内皮细胞一氧化氮和内皮素合成与释放影响的研究

目的探讨中药补肾复脉液对缺氧内皮细胞一氧化氮(NO)和内皮素(ET)的合成与释放的影响.方法取培养的胎儿脐静脉内皮细胞,随机分为空白组、缺氧组、西药组(缺氧+Vit-C)、中药组(缺氧+补肾复脉液),上述各组分别给予10%的空白兔血清、10%的空白兔血清、10%的含Vit-C兔血清、10%的含补肾复脉液兔血清,除空白组外,同时通人95%高纯氮气+5%CO2混合气孵育(缺氧)4小时,测定各组一氧化氮和内皮素的释放水平及一氧化氮合酶活性.结果1)NO、NOS缺氧组与空白组比较,NO释放和NOS活性水平显著下调(P＜0.01),中药组、西药组与缺氧组比较NO释放水平和NOS活性明显上调(P＜0.01,P＜0.05),但中药组与西药组之间比较没有显著差异(P＞0.05).2)ET缺氧组与空白组比较,ET释放水平显著上调(P＜0.01),而西药组与缺氧组比较没有显著差异(P＞0.05),但中药组比缺氧组ET水平显著下调(P＜0.01),中药组明显优于西药组(P＜0.01).结论中药补肾复脉液能阻抑缺氧内皮细胞NO和ET之间合成与释放的平衡向ET倾斜,使内皮源ET的合成与释放显著减少,而NO的合成与释放明显增加,或相对增加,说明该方药对缺氧内皮细胞有明显的保护作用.     

补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

目的观察补肾活血中药含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养,建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系;收集补肾活血中药的含药血清,用10%含药血清代替10%的血清,绘制生长曲线,观察补肾活血中药含药血清促进骨髓间充质干细胞体外增殖的作用。结果所培养的大鼠骨髓细胞在表型表达和细胞形态上具备MSC特征,补肾活血中药含药血清组增长速度比空白对照组明显加快,并与剂量呈正比。结论补肾活血中药含药血清能促进干细胞在体外增殖。     

补肾活血法调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性的实验研究

目的:探讨补肾活血汤及其拆方含药血清调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖活性的作用。方法:体外骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,取第3代细胞,免疫荧光法鉴定细胞表面抗原,成骨及成脂诱导证实其多向分化潜能;实验分为补肾活血汤全方组、补肾组、活血组及空白对照组,运用补肾活血汤及其拆方含药血清干预第3代BMSCs 48h,并用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期。结果:MTT结果显示:体积分数5%及10%补肾活血汤全方含药血清均有促进大鼠BMSCs增殖的作用;流式细胞仪检测细胞周期显示:运用补肾活血汤含药血清干预后,处于增值分裂期(S+G2+M期)的BMSCs百分率增多,与其他3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾活血汤全方含药血清有促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用。     

补肾活血汤对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化影响的研究

目的 研究补肾活血汤对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成骨分化的影响,并探讨Wnt/β-catenin信号通路在其中的调控作用。方法 将20只6周龄SD大鼠随机分为对照组和补肾活血汤组,分别给予生理盐水和补肾活血汤灌胃7 d后取血制备空白血清和含药血清。采用全骨髓培养法获取8周龄SD大鼠BMSCs,传至第3代用于实验研究。流式细胞仪检测BMSCs表型、纯度。实验分为3组：空白对照组细胞加入空白血清培养,补肾活血汤含药血清组细胞加入含药血清培养,经典成骨诱导剂组细胞加入含经典成骨诱导剂的空白血清培养。CCK-8法检测3组细胞干预1～4 d的增殖率,酶标仪检测3组细胞干预14 d后碱性磷酸酶活性,茜素红染色观察3组细胞干预21 d后成骨情况,RT-PCR法检测3组细胞干预21 d后Wnt/β-catenin信号通路相关因子(Wnt3a、β-catenin、CyclinD1、Runx2)mRNA表达情况。结果 第3代BMSCs纯度高。补肾活血方含药血清组干预3 d和4 d的细胞增殖率均明显高于同期空白对照组和经典成骨诱导剂组(P均<0.05);补肾活血方含药血清组和经典成骨诱导剂...     

益气养阴祛瘀方含药血清对干燥综合征人颌下腺细胞AQP5和M3R表达的影响

目的观察益气养阴祛瘀方含药血清对干燥综合征(■;gren′s syndrome, SS)人颌下腺细胞(human submandibular gland cells, HSG cells)中水通道蛋白5(aquaporin protein-5, AQP5)和毒蕈碱样胆碱能受体3(type 3 muscarinic acetylcholine receptors, M3R)表达的影响。方法制备益气养阴祛瘀方含药血清,将对数生长期的HSG细胞随机分为空白组(RPMI 1640培养液)、空白血清组(10%的空白血清+RPMI 1640培养液)、含药血清组(10%的益气养阴祛瘀方含药血清+RPMI 1640培养液)、IFN-γ组(IFN-γ+RPMI 1640培养液)、IFN-γ+IFN-γ拮抗剂组(IFN-γ+IFN-γ拮抗剂+RPMI 1640培养液)、IFN-γ+含药血清组(IFN-γ+10%益气养阴祛瘀方含药血清+RPMI 1640培养液),共6组。培养24 h后,Western blot法检测HSG细胞中AQP5和M3R蛋白表达;RT-PCR法检测HSG细胞AQP5 mRNA和M3R mRNA表达;免疫荧光法观察HSG细胞AQP5蛋白通道表达变化。结果与空白血清组比较,含药血清组AQP5、M3R蛋白及AQP5 mRNA和M3R mRNA表达升高(P0.05)。与IFN-γ组比较,空白组、空白血清组、含药血清组、IFN-γ+IFN-γ拮抗剂组AQP5、M3R蛋白及mRNA表达均升高(P0.05)。结论益气养阴祛瘀方具有与IFN-γ拮抗剂类似功效,能上调主管水运的AQP5、M3R表达,增加唾液量的分泌。     

加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表达的影响

目的探讨加味丹参饮治疗心肌缺血再灌注损伤的可能作用机制。方法将体外培养的H9C2心肌细胞随机分为6组,每组6个复孔。空白血清组在含15%空白血清培养液中常规培养29 h;缺氧预处理组更换缺氧培养液缺氧20 min,复氧20 min,再缺氧20 min后换为空白血清培养液常规培养24 h,缺氧2 h,再给氧3 h;缺氧/复氧组在含15%空白血清培养液中常规培养24 h,更换缺氧培养液,缺氧2 h,再给氧3 h;含药血清组在含15%药物血清中常规培养24 h,缺氧2 h,再给氧3 h;含药血清+自噬抑制剂组用3-甲基腺嘌呤10 mmol/L预处理30 min,余同含药血清组;含药血清+自噬激动剂组用雷帕霉素100 nmol/L预处理30 min,余同含药血清组。倒置显微镜观察各组心肌细胞生长及形态变化,比色法检测定各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,透射电子显微镜观察心肌细胞自噬体形态及数量变化,Western blot法检测各组自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表达。结果与空白血清组比较,缺氧/复氧组镜下心肌细胞变性坏死程度增加,电镜下有少量自噬体,培养液中LDH漏出率增加,Beclin1蛋白水平增加(P0.05或P0.01);与缺氧/复氧组比较,含药血清组及含药血清+自噬激动剂组镜下心肌细胞变性坏死程度减轻,电镜下自噬体数量增多,培养液中LDH漏出率显著降低,LC3Ⅱ及Beclin1蛋白表达上升(P0.05)。结论加味丹参饮可能通过上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表达,增强细胞自噬,从而保护损伤的心肌细胞。     

人参皂苷对糖基化终末产物条件下视网膜Müller细胞活力的影响

目的：探讨人参皂苷对糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法：以改良酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将纯化培养的视网膜Müller细胞分别置于低剂量AGEs（终质量浓度为75 mg·L^-1）及高剂量AGEs（终质量浓度为150 mg·L^-1）下进行培养,并分别以人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁及人参皂苷提取物干预。在干预24,48,72 h后以酶联免疫吸附法测定各组细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出量,以推测Müller细胞活力。结果：低AGEs组24,48 h的LDH漏出量较正常对照组均无明显差异,但72 h的LDH漏出量较正常对照组增多（P<0.05）;高AGEs组各时段LDH漏出量均较正常对照组以及低AGEs组增多（P<0.05）;人参皂苷Rg₁,Re,Rb₁及人参皂苷提取物均能减少低AGEs组48,72 h的LDH漏出量（P<0.05）,减少高AGEs组各时段的LDH漏出量（P<0.05）。结论：AGEs能明显增加视网膜Müller细胞膜的通透性,降低细胞活力,并且与干预的时间、浓度有关;人参皂苷Rg₁,Re,Rb₁及人参皂苷提取物能降低本实验中AGEs条件下Müller细胞膜的通透性、提高Müller细胞膜稳定性,增强细胞活力,尤其以人参皂苷提取物效果显著。     

益肾活血饮逆转骨髓瘤凋亡抵抗的研究

目的:探讨中药益肾活血饮对骨髓瘤凋亡的影响及其机理。方法:以阿霉素共培养的骨髓瘤细胞上清作为条件培养液诱发凋亡抵抗(化疗后组),再加入益肾活血饮含药血清(中药+化疗后组),观察其对骨髓瘤细胞HIF-1α表达(免疫印迹法)及继发凋亡抵抗(流式细胞术)的影响。结果:化疗后组骨髓瘤细胞HIF-1α表达上升,凋亡率下降。中药+化疗后组HIF-1α表达低于化疗后组,但较中药组及空白组高;其凋亡率则高于化疗后组,但较中药组及空白组低。结论:益肾活血饮可能通过下调HIF-1,部分逆转骨髓瘤细胞的继发凋亡抵抗。     

活血解毒方对糖尿病视网膜病变细胞凋亡及相关细胞因子的影响

目的观察中药复方活血解毒方(HXJD)对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡及凋亡相关因子NF-κB和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响。方法采用链脲佐菌素(65 mg/kg)一次性腹腔注射的方法,建立糖尿病大鼠模型,将50只SD大鼠随机分为模型组和HXJD高剂量组(15.4 g/kg)、中剂量组(7.70 g/kg)、低剂量组(3.85 g/kg)及导升明组(0.167 g/kg),每组10只,另设10只正常对照组。造模成功后,灌胃给药,20周后处死动物。应用TUNEL法检测细胞凋亡程度,免疫组化和蛋白印迹技术检测视网膜全层中NF-κB和Caspase-3的表达;采用Real-time PCR法检测视网膜NF-κB和Caspase-3 mRNA的表达。同时,体外培养大鼠视网膜神经节细胞株(RGC-5),制备HXJD含药血清。利用55.5 mmol/L葡萄糖浓度模拟高糖环境诱导,将细胞分为5组:空白组、高糖组、含药血清低剂量组、含药血清中剂量组、含药血清高剂量组。采用CCK-8和AnnexinⅤ-FITC法检测不同血清干预高糖诱导下RGC细胞24 h增殖活性及细胞凋亡的影响。结果与正常对照组比较,模型组凋亡细胞增加,大鼠视网膜组织NF-κB和Caspase-3蛋白及mRNA的表达明显升高(P0.05);与模型组比较,活血解毒方各剂量组和导升明组视网膜细胞凋亡的程度、视网膜NF-κB和Caspase-3蛋白和mRNA的表达量均降低(P0.05)。与空白组比较,高糖组细胞活性降低,细胞凋亡比例增加(P0.05)。与高糖组比较,含药血清高、中剂量组细胞活性增高(P0.05),含药血清各剂量组细胞凋亡比例减少(P0.05,P0.01)。结论活血解毒方可能通过改善糖尿病大鼠视网膜中细胞凋亡的相关细胞因子NF-κB和Caspase-3的表达,同时调节视网膜神经节细胞活力,改善高糖条件下RGC细胞的凋亡程度。