上调LRIG1对胶质瘤U251细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨上调LRIG1表达对胶质瘤U251细胞侵袭及迁移的影响。方法 体外培养U251细胞，应用LipofectamineTM 2000试剂盒将质粒pLRIG1-GFP（pLRIG1-GFP组）及其空载pEGFP-N1质粒（pEGFP-N1组）转染U251细胞，G418挑选具有抗性的细胞并扩增，以供进一步实验。另选择不转染任何质粒U251细胞作为空白对照组。qRT-PCR、免疫印迹法检测LRIG1及细胞上皮-间充质转化（EMT）标志蛋白SNAI2、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表达；应用Transwell小室实验检测U251细胞侵袭和迁移能力。结果 成功构建高表达LRIG1的胶质瘤U251细胞，荧光显微镜下可见细胞散发绿色荧光。pLRIG1-GFP组LRIG1 mRNA及蛋白表达水平明显高于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05），而后两组之间均无统计学差异（P>0.05）。pLRIG1-GFP组侵袭和迁移细胞数明显低于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05），而后两组之间均无统计学差异（P>0.05）。pLRIG1-GFP组SNAI2、N-cadherin、vimentin mRNA及蛋白表达水平明显低于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05），而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平明显高于pEGFP-N1组和空白对照组（P<0.05）；后两组之间均无统计学差异（P>0.05）。结论 上调LRIG1，抑制U251细胞侵袭和迁移，其机制可能与调控细胞EMT过程有关。     

RNAi对U251细胞c-Met基因表达水平的影响

目的 探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤U251细胞c-Met基因表达的影响。方法 设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,pGenesil-1质粒为载体,构建pGenesil-1/c-Met-shRNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤U251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建pGenesil-1-c-Met shRNA重组质粒,并转染至U251细胞。转染重组质粒的U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 RNA干扰能明显降低U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。     

CXCR4在胶质瘤细胞中的表达及对迁移的影响

目的 检测趋化因子受体CXCR4在胶质瘤细胞的表达。建立侵袭迁移模型,分析CXCR4在CXCL12作用下对U251细胞迁移的影响机制。方法 间接免疫荧光法检测CXCR4在U251的表达。流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测不同病理级别胶质瘤CXCR4的表达。建立琼脂糖下细胞迁移（Under-agarose cell migration assay）模型,研究U251在不同浓度CXCL12下的侵袭能力。设空白组与实验组,实验组以CXCL12浓度分5组。计算趋化系数（chemotaxis coefficient,cc）。结果 ①CXCR4表达于U251细胞。②Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级别胶质瘤CXCR4表达率分别为21.36±2.70%、26.39±4.27%、52.59±2.37%、56.23±1.24%。四个级别胶质瘤CXCR4的阳性率均有显著差异（P<0.05）。③对照组细胞迁移距离为40.85±5.16μm,实验组细胞迁移距离分别为49±2.26μm、105.6±3.82μm、165.3±3.89μm、245.4±5.94μm、161.45±3.18μm。因子浓度为200~500ng/ml时与阴性组相比细胞发生明显迁移（P<0.05）。结论 ①胶质瘤细胞U251表达CXCR4。②胶质瘤的病理级别越高CXCR4的阳性率越大。③成功建立了胶质瘤细胞琼脂糖下侵袭模型,为研究肿瘤细胞迁移提供新的方法;CXCL12对胶质瘤有明显的趋化作用,肿瘤细胞顺因子浓度梯度定向迁移。     

miR-23c靶向调控MTDH抑制胶质瘤U87细胞增殖迁移与侵袭

目的 探讨miR-23c对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响及初步机制。方法 将miR-23c mimics转染于U87细胞中,用miR-无关序列转染于U87细胞做为Control组,采用MTT法、细胞划痕、Transwell侵袭实验观察miR-23c对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用生物信息学软件分析miR-23c潜在的靶基因;采用Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测miR-23c对靶基因的调控作用;在转染miR-23c mimics的基础上同时转染MTDH质粒,通过MTT法、细胞划痕、transwell侵袭实验观察转染MTDH对miR-23c抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 MTT实验显示,miR-23c组U87细胞的OD值为（0.668±0.032）,明显低于Control组的（1.031±0.060）（P<0.01）;细胞划痕实验显示,miR-23c组细胞划痕愈合率（0.35±0.02）明显低于对照组的（0.59±0.03）（P<0.01）;Transwell侵袭实验显示,miR-23c组U87细胞穿过基质胶的细胞数（153.2±8.30）明显低于与对照组的（348.4±12.12）（P<0.01）;Western blot、RT-PCR和萤光素酶报告基因检测表明MTDH是miR-23c直接调控的靶基因;MTT实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞的OD值为（1.025±0.059）,明显高于miR-23c组的（0.672±0.024）（P<0.01）;细胞划痕实验显示,miR-23c+MTDH组细胞划痕愈合率为（0.45±0.04）,明显高于miR-23c组的（0.31±0.03）（P<0.05）;Transwell侵袭实验显示,miR-23c+MTDH组U87细胞穿过基质胶的细胞数（260.9±10.23）,明显高于miR-23c组的（148.4±9.4）（P<0.01）。结论 上调miR-23c能明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与其下调MTDH表达有关。     

长链非编码RNA PVT1对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响

目的 探讨长链非编码RNA PVT1（lncRNA-PVT1）对人脑胶质瘤U251细胞增殖能力的影响。方法 体外培养胶质瘤细胞系U251细胞,分别转染PVT1 siRNA（PVT1组）和negative control siRNA（对照组）。PCR法检测lncRNA-PVT1及C-MYC mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot检测C-MYC蛋白表达水平。结果 PVT1组lncRNA-PVT1 mRNA表达水平（0.27±0.08）较对照组（1.0±0.30）明显降低（P<0.05）;PVT1组C-MYC mRNA表达水平（0.87±0.19）与对照组（1.0±0.15）无明显差异（P>0.05）。转染siRNA后1、2、3 d,PVT1组U251细胞活力较对照组均明显降低（P<0.05）。PTV1组C-MYC蛋白表达水平（0.29±0.12）较对照组（0.85±0.27）明显降低（P<0.05）。结论 降低lncRNA-PVT1表达水平能够抑制U251细胞增殖,其机制可能与lncRNA-PVT1够影响C-MYC蛋白的表达水平有关。     

sLRIG1与胶质瘤耐药细胞株化疗敏感性的关系

目的 探讨可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（sLRIG1）与胶质瘤耐药细胞株化疗敏感性之间的关系。方法 浓度梯度递增法建立多药耐药细胞株U251/VP16;CCK-8法检测sLRIG1对U251细胞的抑制率,确定sLRIG1对U251细胞的最佳作用时间及适宜浓度;CCK-8法检测加入sLRIG1前后三种化疗药（依托泊苷、硫酸长春新碱、替莫唑胺）作用于U251/VP16的抑制率变化。结果 成功建立多药耐药细胞株U251/VP16;sLRIG1对U251细胞的最佳作用时间为30 min,适宜浓度范围为100~200 ng/ml;sLRIG1对U251/VP16的抑制率为（23.76±0.02）%;依托泊苷、硫酸长春新碱、替莫唑胺对U251/VP16的抑制率分别为（9.79±0.08）%、（16.71±0.06）%、（27.14±0.09）%;而在加入sLRIG1后抑制率则分别为（20.34±0.03）%、（31.52±0.07）%、（35.21±0.05）%,加入sLRIG1前后三种化疗药的抑制率差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 sLRIG1不仅自身能抑制胶质瘤细胞生长,对耐药胶质瘤细胞的化疗也有增敏作用。     

头孢曲松钠对大鼠蛛网膜下腔出血后认知功能的影响

目的 探讨头孢曲松钠（CEF）对大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）后的认知功能的影响及其机制。方法 将68只成年SD大鼠随机分为4组:正常组（n=12）、对照组（n=24）、CEF低剂量治疗组（n=8）和CEF高剂量治疗组（n=24）。采用枕大池双次注血方法建立大鼠SAH模型。SAH后3 h经小脑延髓池缓慢注射100 μl CEF（高剂量组浓度为100 μmol/L,低剂量组浓度为50 μmol/L）,对照治疗组注射等体积生理盐水。采用Morris水迷宫检测各组动物学习记忆能力;Western blot检测各组大鼠海马 Caspase-3和兴奋性氨基酸转运体2（EAAT2）的表达水平。结果 与对照组相比,CEF治疗组SAH后动物的水迷宫实验中的逃逸时间显著减少（P<0.05）,大鼠海马组织中EAAT2的表达增加（P<0.05）,Caspase-3的表达减少（P<0.05）。结论 CEF对SAH后具有显著的神经保护作用,CEF治疗可能通过上调星形胶质细胞EAAT2的表达逆转SAH诱导的神经损伤。     

FAK siRNA重组质粒的构建及其对胶质瘤U251细胞 增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 探讨应用RNA干扰技术沉默黏着斑激酶（FAK）基因表达对人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 将构建成功的FAK siRNA重组质粒转染至U251细胞,合成与FAK基因序列无关的siRNA作为阴性对照,以野生型U251细胞作为空白对照组。运用PCR和免疫印迹法观察FAK mRNA和蛋白表达情况,实时细胞分析仪检测观察细胞增殖情况,Transwell小室侵袭模型研究细胞侵袭能力。结果 重组质粒pBSilence1.1-FAK构建成功;与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组细胞增殖减慢（P <0.05）;Transwell小室体外侵袭结果 显示,干扰组穿膜细胞数仅为（17.1±1.0）,明显低于空白对照组（68.2±4.5;P <0.05）和阴性对照组（67.0±2.3;P <0.05）。结论 沉默FAK基因表达可有效抑制人胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。     

葛根素对大鼠颅脑损伤的保护作用

目的 探讨葛根素对大鼠颅脑损伤（TBI）的保护作用及其机制。方法 将45只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量葛根素组、中剂量葛根素组和高剂量葛根素组,每组9只。采用Feeney氏自由落体法制备TBI大鼠模型。低、中、高剂量葛根素组腹腔注射葛根素,剂量分别为10、25、50 mg/kg。造模后1、3、7 d采用改良神经功能缺损评分（mNSS）评价神经功能。造模后7 d,干湿法测定脑组织含水量;ELISA法检测脑组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、核因子κB （NF-κB）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、caspase-3水平;免疫印迹法检测Bax、Bcl-2的表达。结果 葛根素能显著降低TBI大鼠mNSS（P<0.05）,显著减轻脑组织水肿（P<0.05）,显著降低脑组织MDA、SOD、GSH、CAT、NF-κB、ICAM-1、IL-6、TNF-α、caspase-3水平（P<0.05）,显著下调Bax表达而上调Bcl-2表达（P<0.05）。结论 葛根素可通过减轻颅脑水肿、抑制氧化应激及炎性反应以及调节Bax/Bcl-2表达从而发挥神经保护作用。     

氟西汀对癫痫合并抑郁大鼠模型海马自噬的作用

目的 探讨氟西汀对癫痫合并抑郁大鼠海马齿状回自噬的影响。方法 将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、氟西汀组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组。采用体重、摄食量、旷场试验评定大鼠抑郁水平;采用免疫组化测定大鼠海马齿状回beclin1、LC3-I、mToR蛋白表达水平,荧光实时定量RT-PCR测定大鼠海马齿状回beclin1、LC3-I、mToR基因表达水平。结果 药物干预后,模型组体重、摄食量、垂直运动次数和水平运动次数明显低于对照组（P<0.01）;氟西汀组、3-MA组经药物治疗后以上指标高于模型组（P<0.01,P<0.05）。模型组海马齿状回beclin1、LC3-I表达显著升高,mToR表达下降,与对照组相比有统计学意义（P<0.01）;氟西汀组、3-MA组大鼠海马齿状回beclin1、LC3-I表达下降,mToR表达升高,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01）。结论 氟西汀可能通过改善癫痫合并抑郁大鼠海马齿状回区beclin1、LC3-I、mToR表达,抑制细胞自噬。     

LRIG3基因对脑胶质瘤细胞系U87和U251的细胞周期、侵袭性和凋亡的影响

目的探讨过表达的富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白3(LRIG3)基因对脑胶质瘤细胞系U251和U87的细胞周期、侵袭能力和凋亡的影响。方法将过表达的LRIG3质粒(实验组)和空白质粒(对照组)经慢病毒法感染胶质瘤细胞系U251和U87,筛选稳定细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测LRIG3表达的变化,碘化丙啶染色后用流式细胞仪测定细胞周期的变化,TransWell小室法检测细胞的侵袭能力,用免疫组化原位末端标记法(TUNEL)检测各组凋亡细胞。结果与对照组相比,实验组U251与U87细胞中LRIG3mRNA水平分别上升67.6%和79.9%,蛋白表达水平分别升高62.3%和91.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组U251细胞中S期与G2/M期细胞数之和低于对照组,有统计学意义(P<0.05);但U87细胞与对照组比无明显差异。实验组U251细胞中穿出细胞数量均明显少于对照组(P<0.05),TUNEL染色结果显示对照组U251细胞凋亡率为23.4%,实验组为35.7%;对照组U87细胞凋亡率为20.2%,实验组为39.5%;对照组与实验组间凋亡率均有明显差异(P<0.05)。结论 LRIG3基因过表达能阻断细胞周期于S期和G2/M期,降低胶质瘤细胞的侵袭能力,加速细胞凋亡。     

LRIG2基因全长及胞外段对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2（LRIG2）基因全长及胞外段对脑胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法将LRIG2全长,LRIG2胞外段（LRIG2_ecto）及空白质粒（对照）经慢病毒法分别转染胶质瘤细胞系U251细胞,筛选稳定细胞株,实时PCR及免疫印迹法检测mRNA及蛋白表达,细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖,流式细胞分析检测细胞周期及细胞凋亡。结果两转染组Flag标签蛋白表达成功;两转染组LRIG2全长及LRIG2_ectomRNA表达较对照组明显升高（氏0．01）;两转染组细胞增殖率均明显高于对照组（P〈0．01）;两转染组s期与G2/M期细胞数之和（即细胞增殖指数）均明显高于对照组（P〈0．01）,而细胞凋亡率均明显低于对照组（P〈0．05）。结论LRIG2基因全长及LRIG2_ecto促进胶质瘤细胞增殖,并将细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞凋亡。     

胶质瘤细胞GDNF基因启动子Ⅰ区甲基化水平对其基因转录的影响

目的 探讨胶质瘤细胞胶质细胞原性神经营养因子（GDNF）基因启动子Ⅰ区甲基化水平对其基因转录的影响。方法 体外培养胶质瘤U251细胞,加入不同浓度5-氮杂胞苷（浓度分别为1、5、10和20 μmol/L）干预,以加入PBS为对照。采用重亚硫酸盐测序法测定GDNF基因启动子Ⅰ区甲基化水平,RT-PCR检测GDNF mRNA的表达。结果 与PBS组相比,1 μmol/L 5-氮杂胞苷对GDNF基因启动子Ⅰ区甲基化水平无显著影响（P>0.05）,5、10和20 μmol/L 5-氮杂胞苷均显著降低其甲基化水平（P<0.05）。与PBS组相比,1 μmol/L 5-氮杂胞苷对GDNF mRNA表达水平无显著影响（P>0.05）,5 μmol/L 5-氮杂胞苷显著增加其表达水平（P<0.05）,但随着浓度进一步增加（10、20 μmol/L）,其表达水平逐渐降低。结论 5-氮杂胞苷对GDNF基因具有去甲基化作用;GDNF启动子Ⅰ区去甲基化能够增加GDNF基因的转录水平。     

CXCR4表达上调对U251细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 探讨CXC趋化因子-4受体（CXCR4）表达上调对U251细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及其作用机制。方法 构建携带CXCR4基因的质粒,采用电转染法将携带CXCR4基因的质粒整合到胶质瘤U251细胞的基因组中,然后将细胞分为空白对照组、阴性对照组和CXCR4上调组,分别从mRNA水平和蛋白水平检测CXCR4及其他相关基因的表达;MTT试验检测细胞增殖能力的改变;划痕试验检测细胞的迁移能力;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭性的变化。结果 与空白对照组和阴性对照组相比,CXCR4上调组U251细胞CXCR4在mRNA和蛋白水平上表达都增强,细胞增殖、侵袭和迁移能力均显著增强;而空白对照组和阴性对照组之间并无明显变化。结论 CXCR4在胶质瘤的增殖、侵袭、迁移行为中发挥着重要的作用,可以被视为胶质瘤治疗的靶向基因。     

miR-370-3p对胶质母细胞瘤U87-MG细胞株增殖能力的影响

目的 探讨微小RNA-370-3p（miR-370-3p）对人脑胶质瘤细胞系U87-MG增殖能力的影响及其机制。方法 将常规培养的U87-MG细胞分为空白组、无义序列转染组和模拟物转染组,后两组分别转染miRNA无义序列及miR-370-3p模拟物,qRT-PCR法检测其转染效率,免疫印迹法检测转染细胞叉头框蛋白M1（FoxM1）的表达;采用EdU法评估细胞的增殖能力,采用平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。结果 与空白组和无义序列转染组比较,模拟物转染组细胞miR-370-3p表达显著增加（P<0.05）,而FoxM1的蛋白表达显著减少（P<0.05）;而且模拟物转染组U87-MG细胞增殖能力及克隆形成率均明显减少（P<0.05）。结论 miR-370-3p能够抑制U87-MG细胞的增殖能力,可能与减少FoxM1的表达有关。