铜绿假单胞菌中群体感应系统的研究进展

群体感应系统(quorum sensing)是一种细菌细胞与细胞间的信号传递系统。细菌通过可扩散的小分子信号分子感知细胞群体的密度,从而引起一些特定基因在细菌群体中的协调表达。铜绿假单胞菌中的QS系统包括LasI/LasR和RhlI/RhlR两条主要的信号系统和喹诺酮信号系统。本文系统地介绍了铜绿假单胞菌中QS系统的研究现状和相关应用。     

群体感应系统对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的:研究群体感应系统对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.方法:采用生理盐水-吸痰管系统进行生物膜的培养,3天后用扫描电镜观察PAO1、PAO1 lasI rhlI、PAO1 lasR rhlR形成生物膜的情况.结果:PAO1野型可形成较厚、有孔状通道的生物膜,而PAO1 lasI rhlI基因缺陷型和PAO1 lasR rhlR基因缺陷型形成的生物膜明显稀薄,未能形成成熟的生物膜结构.结论:表明PAO1野型与lsaI rhlI和lasR rhlR基因缺陷型铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力差异有显著性.     

铜绿假单胞菌的群体感应系统及其抑制剂研究进展

群体感应系统(quorum sensing system, QS)是一种微生物细胞与细胞间的交流系统。铜绿假单胞菌是该系统的典型代表,可调控细菌产生对抗生素的耐药、形成生物膜、产生毒力因子,并且减弱宿主的免疫应答。群体感应系统抑制剂(quorum sensing inhibitors, QSIs)在不影响细菌生长的前提下可降低细菌的毒性,且增强细菌生物膜对抗生素治疗的敏感性,这些特点使QSIs成为目前抗感染领域的研发热点。本文就铜绿假单胞菌的群体感应系统及QSIs的研究进展进行了综述。     

黄连解毒汤干预铜绿假单胞菌密度感应系统调控毒力因子和生物膜的作用初探

摘要：目的:探索黄连解毒汤铜对绿假单胞菌生长与毒力因子的干预作用。方法:将铜绿假单胞菌分别与不同浓度梯度的黄连解毒汤、黄连、黄柏、黄芩、栀子共同培养,观察对细菌生长、毒力因子、生物膜的影响。倍比稀释法观察黄连解毒汤对细菌生长的影响。刚果红弹性蛋白降解试验检测弹性蛋白酶活性,氯仿盐酸法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜起始量,荧光定量PCR检测细菌密度感应（QS）基因转录水平。结果:黄连解毒汤最低抑菌浓度（MIC）为12.5 mg·ml-1,黄连、黄芩、黄柏均为25 mg·ml-1,栀子为50 mg·ml-1。黄连解毒汤和黄连抑制绿脓菌素最低浓度均为6.25 mg·ml-1,黄芩与黄柏为12.5 mg·ml-1,栀子为50 mg·ml-1。黄连解毒汤抑制弹性蛋白酶最低浓度为6.25 mg·ml-1,黄连与黄柏均为12.5 mg·ml-1,黄芩和栀子均为25 mg·ml-1。黄连解毒汤抑制生物被膜的最低浓度为6.25 mg·ml-1,黄连和黄芩均为12.5 mg·ml-1,黄柏和栀子均为25mg·ml-1。在低于最小抑菌浓度梯度之下,6.25 mg·ml-1黄连解毒汤和12.5 mg·ml-1黄连抑制las B、las I、lasR、rhl I、rhlR基因转录,12.5 mg·ml-1黄岑和25.0 mg·ml-1栀子抑制las B和las I基因转录,12.5 mg·ml-1黄柏抑制las B和rhl I基因转录。结论:黄连解毒汤4种组分通过协同作用对细菌生长和密度感应系统调控的毒力因子发挥抑制作用。     

氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜群体感应系统的影响

目的探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物膜群体感应(QS)系统的影响。方法平板法培养成熟的铜绿假单胞菌PAO1野生型菌株和QS系统缺陷株△lasR△rhlR基因缺陷型、△lasI△rhlI基因缺陷型菌株生物膜,分别予生理盐水和氨溴索1.875 g·L~(-1)、3.75 g·L~(-1)作用8 h。通过荧光探针SYTO9/PI标记,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察不同浓度氧溴索作用前后不同菌株生物膜的结构变化,利用生物膜图象结构分析软件(ISA)对氨溴索作用前后的生物膜结构参数进行定量分析。结果 PAO1野生型菌株可见大片状生物膜,细菌密集。2个基因缺陷型菌株的生物膜菌落较稀疏,氨溴索作用后不同菌株生物膜厚度、平均扩散距离和结构熵均显著减少,区域孔率增加,有剂量相关性(P<0.05),PAO1野生型菌株生物膜的变化幅度比QS系统缺陷株更大(P<0.05)。结论氨溴索破坏铜绿假单胞菌生物膜的结构,具有拮抗QS系统的特性,高浓度氨溴索(3.75 g·L~(-1))效果更显著。     

左氧氟沙星对铜绿假单胞菌密度感应系统及毒力因子的调控

目的：评价铜绿假单胞菌在亚抑制浓度（ SIC）的左氧氟沙星作用下毒力因子表型及基因表达的变化并探索其可能的调控途径。方法用临床标准菌株PAO1及其密度感应系统（ QS）的基因突变株,测定不同浓度下菌株生长曲线,以不影响细菌生长的最高抗菌素浓度为亚抑制浓度。分别测定各菌株在SIC的抗菌素作用下生物膜形成、绿脓菌素和鼠李糖脂的变化。用实时定量聚合酶链式反应（ RT－PCR）测定菌株毒力蛋白编码基因以及QS基因在SIC的左氧氟沙星作用下表达的变化。用生物发光法测定QS信号分子在SIC的抗菌素作用下的变化。结果在SIC的左氧氟沙星作用下,PAO1的毒力因子编码基因和QS调控基因（lasR、rhlR）表达均显著增加,PAO1野生株的毒力因子也增加,但lasR、rhlR突变株无此变化,同时QS信号分子水平也无显著变化。结论亚抑制浓度的左氧氟沙星促进铜绿假单胞菌毒力因子的产生,这一效应是通过lasR和rhlR调节实现的,但这一调控作用可能并不是直接通过AHL信号分子完成。     

群体感应系统对大鼠腹腔铜绿假单胞菌生物被膜感染的影响

目的探讨群体感应(quorum sensing,QS)系统对腹腔植入物铜绿假单胞菌(PA)生物被膜(biofim,BF)感染致病性的影响。方法以输液管为载体,PAO1、PAO1-JP2为实验菌株,建立大鼠腹腔移植物PA BF感染动物模型,采用连续稀释法进行载体表面活菌计数。扫描电镜(SEM)观察载体BF的形态变化。结果组织病理学可见PAO1组炎性反应较PAO1-JP2组更严重。SEM观察发现PAO1组载体表面细菌黏附和形成的BF较PAO1-JP2组稠厚。载体表面BF内活菌计数PAO1组显著高于PAO1-JP2组(P<0.01),并且在第7天后有增多趋势(P<0.05)。结论在体内移植物PA感染过程中,BF形成及感染的程度受QS系统调节,其在PA BF相关感染中起着重要作用。     

原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌(PA)的生长及群体感应系统(QS系统)调控的毒力因子表达的影响.方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素(40、80μmol/L)对铜绿假单胞菌标准株PA01生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子(绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶)表达量的影响.结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PA01的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性.结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于 铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力.     

铜绿假单胞菌的群体感应系统与其致病及耐药机制

群体感应(QS)系统作为依赖细胞密度的胞间信号传递系统,在细胞生长、发育和分化中起重要作用.铜绿假单胞菌是院内常见的条件致病菌,对多种抗生素耐药.本文概述QS系统在铜绿假单胞菌致病机制及生物被膜介导的耐药机制中的作用,同时介绍基于铜绿假单胞菌QS系统的药物开发进展.     

多尼培南对铜绿假单胞菌生物被膜形成和群体感应系统的影响

目的：探究新型碳青霉烯类抗生素多尼培南（doripenem,DOR）对临床分离铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制作用,及对其群体感应系统相关基因LasR、RhlR、PqsA、PqsE、PqsR表达量的影响。方法：用结晶紫染色法测定30株临床分离铜绿假单胞菌形成生物被膜能力和多尼培南对生物被膜形成的抑制作用;微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）和最低抑制生物被膜浓度（minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC）;活菌计数法绘制多尼培南对生物被膜内细菌的杀菌曲线;采用实时定量荧光PCR （real-time PCR）法测定多尼培南对群体感应（quorum-sensing,QS）系统相关基因表达量的影响。结果：30株铜绿假单胞菌中的29株（97%）形成生物被膜;多尼培南具有较强的抗铜绿假单胞菌浮游菌和生物被膜抑制活性,MICR为0.5～1μg·mL-1,MBICR为1～4μg·mL-1;显著下调LasR、RhlR、PqsA、PqsE、PqsR的表达量。结论：临床分离铜绿假单胞菌具有高生物被膜形成率,多尼培南对铜绿假单胞菌生物被膜具有抑制作用,可能与其下调QS系统相关基因有关。     

RNA干扰铜绿假单胞菌群体感应系统对生物膜影响的研究

目的 观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)分子干扰铜绿假单胞菌群体感应系统后,对铜绿假单胞菌生物膜的影响.方法 首先针对lasR、rhlR和rhlI基因设计4条siRNA分子,分别是si-asr1、si-hlr1、si-hlr2和si-hli1,体外转录法制备上述siRNA分子.将50nmol/L siRNA分子与4μl脂质体混合,然后转染铜绿假单胞菌成熟期生物膜,应用平板菌落计数法检测siRNA转染后96h内生物膜活细菌数目;siRNA转染生物膜48h后,应用1%复红染色法光学显微镜观察生物膜形态改变,同时应用RT-PCR法检测生物膜弹性蛋白酶B基因lasB表达量.结果 si-hlr1、si-hlr2和si-hli1分别转染铜绿假单胞菌生物膜48h,生物膜出现解体,生物膜内活细菌数目无明显改变.si-asr1转染铜绿假单胞菌生物膜48h后,生物膜形态及生物膜内活细菌数目无明显改变.si-asr1、si-hlr2和si-hli1分别转染铜绿假单胞菌生物膜48h,生物膜lasB基因表达量分别下调了49%、21%和18%.si-hlr1转染生物膜48h后,lasB基因表达量无明显改变.结论 应用siRNA分子干扰铜绿假单胞菌群体感应系统的lasR、rhlR和rhlI三个关键性基因,可以促进生物膜解体,同时能部分抑制生物膜lasB基因表达,但是不能减少生物膜内活细菌数.     

铜绿假单胞菌群体感应系统研究进展

目的:综述铜绿假单胞菌群体感应系统研究进展,从而寻找铜绿假单胞菌治疗的新方向。方法:查阅近年来国内外相关文献并对其进行总结。结果:群体感应系统是细菌依赖细胞密度,通过自诱导分子进行细胞间交流的信号传递系统。当自诱导分子达到阈值时启动群体感应系统从而调节基因表达。结论:群体感应系统参与细菌毒素的释放和生物膜的形成,因此通过抑制群体感应系统降低铜绿假单胞菌的致病性和耐药性成为抗感染治疗药物新靶点。     

硝苯地平调控铜绿假单胞菌群体感应系统的初步研究

摘要：目的:探讨硝苯地平调控铜绿假单胞菌（PA）群体感应（QS）系统抑制毒力因子的表达。方法:应用倍比稀释法测定硝苯地平对PA的体外最低抑菌浓度（MIC）;设置空白对照组和实验组,体外构建适宜环境,培养菌株24 h,测定600 nm处硝苯地平对PA增殖的影响,并绘制生长曲线;蛋白水解酶实验测定硝苯地平对PA蛋白水解酶的抑制作用;弹性蛋白酶实验测定硝苯地平对PA弹性蛋白酶的抑制作用;绿脓毒素实验测定硝苯地平对PA绿脓毒素的抑制作用。结果:硝苯地平在体外对PA表现出良好的抗菌活性:硝苯地平抗PA的MIC为256μg·ml-1;生长曲线显示,加样4 h时后,硝苯地平浓度为256,128,64,32μg·ml-1时可明显抑制PA生长（P<0.05或P<0.01）;毒力因子表达实验中,硝苯地平浓度为512,256,128,64,32,16,8μg·ml-1时可明显抑制蛋白水解酶和弹性蛋白酶的活性（P<0.05或P<0.01）,硝苯地平浓度为512,256,128,64,32,16μg·ml-1时可明显抑制绿脓毒素的表达（P<0.05或P<0.01）;且硝苯地平对PA毒力因子表达的抑制作用表现出浓度依赖性。结论:硝苯地平可调控QS系统抑制PA毒力因子表达的作用,在体外可有效抑制PA的生长,有望成为一种新型抗菌增效药物。     

环丙沙星体外诱导铜绿假单胞菌对群体感应系统正常与缺陷最低抑菌浓度的影响

目的：探究群体密度（QS）系统正常与缺陷的铜绿假单胞菌（PA）通过环丙沙星诱导后对其最低抑菌浓度（MIC）影响的区别。方法：将PA按照前期研究的基因测序方法分成正常组和缺陷组。采用琼脂倍比稀释法测定对环丙沙星的MIC值,用1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC的环丙沙星各诱导5代,保存1代、3代和5代的菌株。诱导浓度和诱导代数对MIC值的影响采用重复测量方差分析方法,正常组与缺陷组的比较采用秩和检验。结果：两组组内比较：在同一浓度下,2组各随着诱导代数增加MIC值均增加（P均<0.05）;在同一代数下随着诱导浓度的增加,正常组第3代和第5代的MIC值也增加（P均<0.05）,缺陷组第3代和第5代的MIC值差异有统计学意义（P均<0.05）。2组组间比较：QS系统分组与诱导代数无交互效应（P>0.05）,且缺陷菌株MIC值都低于正常菌株;与诱导浓度存在交互效应（P<0.05）。固定代数固定浓度两组MIC值比较：在1MIC诱导的第3代和第5代,2组之间有统计学差异（P<0.05）。结论：不同诱导浓度对QS系统正常组和缺陷组MIC值的影响有区别。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

铜绿假单胞菌lasR/rhlR基因缺陷对小鼠腹腔生物被膜感染的影响

目的 探讨铜绿假单胞菌(PA)群体感应(QS)系统的lasR/rhlR基因缺陷对小鼠腹腔PA生物被膜(BF)感染的影响.方法 体外利用无菌引流管切片建立铜绿假单胞菌PAO1野生型和PAO1 lasR/rhlR基因缺陷型菌株生物被膜感染的载体,将两种感染载体和无菌载体分别移植至正常小鼠腹腔构建生物被膜感染模型,术后3d检...     

铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展

铜绿假单胞菌耐药严重,形成的感染严重威胁患者健康.群体感应是细菌密度依赖的群体调控行为.细菌利用可扩散的信号分子监控周围同种或异种细菌的密度,调控特定基因的适时、协同表达.群体感应系统参与调控铜绿假单胞菌的致病性和耐药性,备受关注.深入研究铜绿假单胞菌的群体感应系统,可阐明该菌的群体行为调控机制及致病机制,由此研发铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制剂,对缓解该菌的耐药并根除其感染具有重要意义.本文就铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展做一综述.     

566株铜绿假单胞菌耐药性分析

目的:了解铜绿假单胞菌的耐药现状。方法:药敏试验用K-B法。结果:铜绿假单胞菌对多种抗生素的耐药率不断上升。结论:临床医生应根据实验室的试验结果合理、有效用药,减少、减缓耐药株的产生。