幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信息学特征预测

目的:构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)NCTC 11637 IV型分泌系统cagX(HP0528)全长编码基因的原核表达载体。方法:用PCR方法从H.pylori基因组DNA中扩增cagX编码基因片段,将cagX克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,再将其定向插入pET32a( )载体中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,并进行序列测定和生物信息学预测。结果:克隆幽门螺杆菌NCTC 11637cagX基因全长1569 bp(基因库登录号为EF608160),编码522个氨基酸,融合蛋白的相对分子质量约为80.5 kD。与基因库公布的其他H. pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为96%~99%。预测结果显示H. pylori11637,26695,J99间二级结构有一定差异,但抗原性相同。结论:成功克隆并表达了H. pyloriNCTC 11637cagX基因,并对其生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

胃癌及癌前病变患者幽门螺杆菌的sabA基因多态性的研究

目的 对癌症和癌前病变患者幽门螺杆菌进行sabA基因遗传信息多态性的研究.方法 采用特异引物聚合酶链反应(PCR)及测序和比较基因组方法分析42株国内癌症及癌前病变患者幽门螺杆菌的sabA基因CT双核苷酸重复序列调节区多态性.结果 sabA基因调节区的阳性检测率为85%,功能性sabA基因占所有测序菌株的55%.对随机挑选的18株检测阳性菌株进行测序分析,结果显示在碱基水平及氨基酸水平存在显著的遗传多态性.对sabA基因调节区的氨基酸序列聚类分析中发现,本研究菌株与国际已经完成测序的7株幽门螺杆菌可以明显的分为两个组,即中国组与西方组.结论 sabA基因CT双核苷酸重复序列调节区在中国菌株中普遍存在,且在翻译水平有很显著的多态性.聚类分析发现含有功能性sabA基因的幽门螺杆菌菌株多态性存在明显的地域性分布差异.     

幽门螺杆菌的细胞毒素分析

目的 探讨幽门螺杆菌临床分离株的毒素鉴定方法。方法:临床分离幽门螺杆菌HP1菌株,以国际标准株NCTC11637(VacA~+CagA~+)和NCTC11639(VacA~- CagA~+)为参照,运用细胞培养、PCR、Westernblot等技术对HP1进行细胞毒素鉴定。结果:HP1菌株可诱导Hela细胞发生空泡变性,经PCR检测含cagA基因,Western blot显示87kD及130kD处有蛋白条带。结论:HP1菌株为VacA~+ CagA~+菌株。     

球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定

目的：克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段，并进行序列分析。方法：采用亚抑菌浓度的抗生素作用，使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异，收集球形Hp。从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段，扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中，转化人大肠杆菌JM109。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定，并进行序列测定。结果：从HpC基因组DNA中扩增出3888bp的vacA基因，构建重组质粒pMD-18T-vacA，酶切产物的大小与预期相符。测序结果显示，HpC与已公布的HpvacA基因序列的同源性达99.8％。结论：成功地对HpC vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA，并经酶切及序列分析所验证，证明HpC含有完整的vacA基因，其可能与Hp的致病性有关。     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因.方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA,构建PMD18-T载体,采用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果RT-PCR扩增长度为968 bp的基因片段,BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段,测序结果显示编码区无基因突变.结论人FS全长cDNA基因克隆成功,并构建了重组PMD18-T载体.     

幽门螺杆菌Cag-PAI hp0523基因的克隆及功能预测

目的:明确幽门螺杆菌Cag-PAI hp0523基因的功能,探讨其在幽门螺杆菌致病中的作用.方法:设计引物,以幽门螺杆菌NCTC11637为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得目的片段;将其进行T-A克隆后,进行测序.将该基因序列与其他菌株做BLAST比对分析,并结合生物信息学数据库和软件,分析其序列特征和理化特性.结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为510 bp,与基因库公布的幽门螺杆菌 26695及J99序列相比较,同源性高达 94%;软件预测其编码的蛋白为169个氨基酸,其相对分子质量约为19.7 kDa,等电点约为9.53;基序分析表明,在33～165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序,可能是溶菌糖基转移酶;对其催化能力进行预测,结果表明,HP0523(33.7%)催化能力可能较T4溶菌酶(32.3%)和溶菌酶SLT70(28.6%)的活性高.结论:成功克隆了幽门螺杆菌Cag-PAI的hp0523基因,对其序列进行了深入分析,为进一步研究其功能,阐明幽门螺杆菌Cag-PAI的致病机制奠定了基础.     

HP450基因的克隆及其重组载体pMD18-HP450的构建与鉴定

目的构建HP450基因的克隆载体。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体。以菌液为模板做PCR、酶切和测序鉴定pMD18-HP450重组质粒载体。结果菌液PCR扩增出目的条带、重组体的酶切产物合理,测序显示目的基因与基因库中的H1基因100%同源。结论实现了HP450基因的克隆及其重组质粒载体pMD18-HP450的构建。     

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）Cag致病岛（Cag—pathogenicity island,Cag—PAI）编码的hp0540基因的原核表达系统,并制备其多克隆抗体。方法：应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段,克隆至pMD18-2T载体后,进行序列测定,并对其序列进行生物信息学分析;构建pET-28a—hp0540原核表达载体,转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后,SDS—PAGE法鉴定目的蛋白的表达,并以Ni^2＋-NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果：成功克隆了hp0540基因,全长1086bp,编码361个氨基酸,与基因库公布的其他坳菌株基因序列的核苷酸同源性为98％。工程菌诱导后SDS—PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为39000,经Ni^2＋NTA柱纯化后可获得重组蛋白,重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1：160000的多克隆抗体。结论：成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。     

人NKG2D基因重组质粒的构建及鉴定

目的 构建人NKG2D重组质粒。方法 应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PB-MC)中获取NKG2D cDNA，克隆于pMDl8-T载体中，并经酶切和测序鉴定。结果 重组载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。结论 成功地构建了重组载体pMDl8T-NKG2D，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)原核表达载体pQE31-MIF的构建

目的 :获得小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)全长基因克隆 ,并构建重组表达载体pQE3 1 MIF。方法 :用RT PCR技术 ,以特异性寡核苷酸为引物 ,从小鼠脾脏总RNA中扩增MIF基因 ,插入pMD1 8 T载体 ,用限制性核酸内切酶和DNA序列分析鉴定重组克隆。构建并鉴定原核表达载体pQE3 1 MIF。结果 :成功克隆了小鼠MIF基因 ,构建了重组质粒pMD1 8 MIF及重组原核表达质粒。序列分析显示获得的MIF基因cD NA序列与文献报导一致。结论 :成功构建了重组表达质粒pQE3 1 MIF ,为进一步深入研究MIF蛋白的生物学活性奠定了基础     

人神经营养素-3全长基因克隆及序列分析

目的: 扩增人神经营养素-3(human neurotrophin-3,hNT-3)全长基因并进行序列分析。方法: 应用聚合酶链反应技术,以一个健康成人基因组DNA为模板,扩增出编码hNT-3的全长基因,并克隆至pMD18-T载体中进行基因测序。结果: 所得序列与Genbank提供的序列(M61180)对比显示,除hNT-3中第555位碱基由C→T外,余序列同已知序列完全一致,改变的碱基并不影响基因编码的氨基酸序列。结论: 成功地获得了hNT-3的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

Cloning of Integral Mature Peptide Gene of Human GDF-5

The integral mature peptide gene of human growth differentiation factor-5 (GDF-5) was出人物cloned to provide the essential foundation for study on the biological characteristics of GDF-5 at gene and protein levels. Two primers were chemosynthesized according to the hGDF-5 sequence reported in Genbank. The hGDF-5 gene was gained by RT-PCR methods from the total RNA extracted from human fetus cartilage tissue, and was cloned into vector pMD18-T. The sequence of recombinant plasmid pMD18-T-hGDF-5 was analyzed by sequence analysis. DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 380bp, and double enzyme digestion of the recombinant plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hGDF-5 sequence in Genbank. Our results showed that the integral mature peptide gene of human GDF-5 was cloned successfully from human fetal cartilage tissue, and totally identified with the seouence of human GDF-5 in Genhank.     

高温致神经管畸形相关基因片段N32的克隆和测序

目的：对高温致神经管畸形相关基因片段N32进行克隆和测序分析。方法：利用T－A克隆方法，将高温致神经管畸形相关基因片段N32克隆入pMD 18-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，少量抽提质粒，酶切鉴定并测序，测序结果与GenBank中已知序列进行同源性比较并进行功能分析。结果：N32片段的序列与家鼠剪接因子3bl(Sf3bl)基因的3‘端序列同源性为93％。结论：N32片段所在基因的低表达在高温致神经管畸形中可能发挥重要作用。     

重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染

目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。