人肺腺癌细胞株A549中HIF-1α对survivin的表达调控

背景与目的:survivin是一种重要的抗凋亡基因,在肿瘤组织中特异性高表达,并参与调控细胞周期和细胞凋亡,其高表达与肿瘤进展、药物抵抗以及预后关系密切。但survivin在肺癌中高表达的转录调控机制研究甚少。课题组前期研究成功构建含有survivin核心启动子的荧光报告载体pGL3-SVP230-luc,并发现核心启动子区存在缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的潜在位点。本研究拟通过免疫荧光双标记法、电泳迁移率实验(EMSA)、共转染等方法探讨缺氧条件下人肺腺癌细胞株A549中HIF-1α调控survivin转录的确切机制。方法:⑴运用免疫荧光双标记检测缺氧A549细胞中HIF-1α与survivin的表达;⑵HIF-1α表达质粒和HIF-1αsiRNA分别转染A549细胞,30 h后RT-PCR、Western blot和免疫荧光双标法检测survivin mRNA和蛋白表达;⑶pGL3-SVP230-luc(含有survivin核心启动子的荧光报告载体)与HIF-1α表达质粒和HIF-1αsiRNA分别共转染A549细胞,测定萤光素酶的表达活性;⑷...     

雷帕霉素对人宫颈癌HeLa细胞增殖和HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨不同浓度雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用及对HIF-1α、VEGF表达的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测分别以不同浓度雷帕霉素处理的体外培养人宫颈癌HeLa细胞的抑制率,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测各组细胞HIF-1 α、VEGF mRNA和蛋白的表达.结果 不同浓度雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞的生长有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性;随雷帕霉素浓度增加细胞内HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达均呈下调趋势.结论 雷帕霉素对宫颈癌HeLa细胞的生长有抑制作用并呈剂量依赖性,雷帕霉素具有明显下调HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达的作用.     

雷帕霉素联合多西紫杉醇诱导肺癌95D细胞凋亡的机制研究

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa)联合多西紫杉醇( docetaxel,DTX)对肺癌95D细胞系凋亡的影响.方法:流式细胞仪检测雷帕霉素及联合多西紫杉醇对95D细胞凋亡的影响,RT-PCR方法和Western blot检测凋亡基因survivin mRNA和蛋白的表达.结果:mTOR抑制剂雷帕霉素和多西紫杉醇单独处理组均能促进肺癌细胞的凋亡,下调凋亡基因survivin mRNA和蛋白的表达;联合应用雷帕霉素和多西紫杉醇促凋亡作用更强,survivin mRNA和蛋白的表达下降更明显.结论:雷帕霉素联合多西紫杉可以降低survivin的表达,从而起到促进肿瘤细胞凋亡的作用,为临床寻找新型抗肿瘤药物及治疗肺癌的新化学治疗方案提供了理论和实践基础.     

雷帕霉素联合顺铂对宫颈癌Hela细胞生长和对HIF-1α与VEGF表达影响的观察

目的:探讨mTOR抑制剂雷帕霉素与顺铂联合应用对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对HIF-1α和VEGF表达的影响。方法:分别以雷帕霉素、顺铂及雷帕霉素联合顺铂处理体外培养人宫颈癌Hela细胞,采用MTT比色法检测人宫颈癌Hela细胞的抑制率,金氏公式评价两药联合用药的效果,采用RT-PCR法、蛋白质印迹法检测各组细胞HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的表达。结果:雷帕霉素和顺铂对宫颈癌Hela细胞的生长有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性,分别联合应用2种浓度雷帕霉素(10和20nmol/mL)与顺铂(0.25和0.5mg/mL)协同治疗指数q值均>1.15,两者有协同作用。雷帕霉素与顺铂联合用药HIF-1αmRNA的表达为0.242±0.048,单独用药雷帕霉素组为0.428±0.068,顺铂组为0.357±0.051;雷帕霉素与顺铂联合用药组VEGF mRNA的表达为0.498±0.093,单独用药雷帕霉素组为0.651±0.112,顺铂组为0.623±0.125,联合用药组与单独用药组比较表达量明显降低,P<0.05;雷帕霉素与顺铂联合用药组HIF-1α蛋白的表达为0.514±0.092,单独用药雷帕霉素组为0.625±0.132,顺铂组为0.635±0.120;雷帕霉素与顺铂联合用药组VEGF蛋白的表达为0.409±0.082,单独用药雷帕霉素组为0.650±0.114,顺铂组为0.623±0.102,联合用药组与单独用药组比较表达量明显降低,P<0.05。结论:单独及联合应用雷帕霉素与顺铂对宫颈癌Hela细胞的生长均有抑制作用,两药联合应用有明显的协同作用,雷帕霉素联合顺铂具有明显下调HIF-1α、VEGF基因和蛋白表达的作用。     

缺氧对肺腺癌细胞HIF-α1、GLUT-1、MMP-2表达影响的研究

目的探讨人肺腺癌细胞株A549在缺氧条件下HIF-1α、GLUT-1、MMP-2的表达变化情况.方法对肺腺癌细胞A549分别进行常规和氯化钴模拟缺氧培养,采用MTY法检测缺氧对A549细胞增殖的影响;Transwell侵袭小室测定法评价缺氧下A549细胞的侵袭力;分别采用RT-PCR法和western blot、免疫组化法测定缺氧不同时间HIF-1α和GLUT-1、MMP-2 mRNA和蛋白表达水平的变化.结果A549细胞在缺氧条件下增殖能力和侵袭力较正常时增强.正常氧条件下的A549细胞即有一定水平的HIF-1α、GLUT-1、MMP-2的表达,随着缺氧时间的延长,HIF-1α和、GLUT-1、MMP-2 mRNA和蛋白水平呈升高趋势,与正常对照组比较,各缺氧组差异有统计学意义(P＜0.01).结论氯化钴诱导缺氧可以上调HIF-1α、GLUT-1、MMP-2蛋白在肺腺癌细胞中的表达水平,加速肺癌细胞的生长和转移,使之进一步耐受缺氧.     

雷帕霉素对人淋巴瘤Raji细胞增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响

目的:探讨雷帕霉素对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响及其临床意义.方法:不同浓度(0、10、50、100、250、500nmol/L)雷帕霉素对Raji细胞作用不同时间(24、48、72h)后,使用CCK8法检测细胞增殖的变化;采用蛋白质印记法(Western blot,WB)检测72h组不同浓度mTOR、VEGF-A、HIF-1α蛋白变化;采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测其mRNA的变化.结果:雷帕霉素对Raji细胞增殖具有显著抑制作用(P＜0.01);雷帕霉素处理72h后的Raji细胞,随着药物浓度增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1 α蛋白明显减少(P＜0.01);雷帕霉素处理后的Raji细胞,随着药物浓度和作用时间的增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1α的mRNA明显减少(P＜0.01);mTOR、VEGF-A及HIF-1α的mR-NA表达两两之间呈正相关性.结论:雷帕霉素通过mTOR通路,能明显抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖过程,表现出明显的时间、剂量效应依赖关系;同时也可明显减少mTOR、VEGF-A、HIF-1α的mRNA的转录表达,减少p-mTOR、VEGF-A、HIF-1α等蛋白的翻译表达,从而抑制Raji细胞的生长及其血管新生.     

mTOR和survivin在他莫昔芬诱导肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

目的 探讨mTOR信号分子和凋亡抑制因子survivin在他莫昔芬处理的肝癌HepG2细胞中的表达变化.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和双荧光素酶报告基因检测方法,检测HepG2细胞在他莫昔芬处理前后survivin的表达和p70S6K的活性;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 20μmol/L的他莫昔芬在诱导HepG2细胞凋亡的同时,可使survivin在HepG2细胞中的表达减少,同时下调了 p70S6K的活性.mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素和他莫昔芬联合处理HepG2细胞后,HepG2细胞增殖率较对照组下降了 64.7%,差异有统计学意义(P＜0.05),同时survivin蛋白表达明显下降,而survivin mRNA表达无明显变化.结论 他莫昔芬和雷帕霉素能够协同下调HepG2细胞中survivin的表达,他莫昔芬下调HepG2细胞中survivin的表达可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节其转录和转录后水平,进而诱导肝癌细胞凋亡.     

可溶性FasL联合survivin RNA干扰诱导肺腺癌细胞凋亡

目的：探讨可溶性FasL（sFasL）联合survivin RNA干扰对肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法：构建survivin特异RNA小干扰表达载体，DNA测序，转染A549细胞。G418（geneticin）筛选稳定表达survivin RNA小干扰细胞株，荧光实时定量RT-PCR、免疫印迹（Western blot）和免疫组化法检测survivinm RNA和蛋白表达。sFasL作用于转染后细胞，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测细胞活性和凋亡率。结果：成功构建survivin-siRNA表达载体，筛选出稳定表达单克隆细胞。SurvivinmRNA和蛋白表达分别下降76．4％（P〈0．01）和84．5％，免疫组化也显示survivin下调。sFasL联合survivinRNA干扰细胞，光密度值在各时间点较siRNA组、sFasL组和对照组均明显降低（P〈0．01），抑制率增加；凋亡率较siRNA组、sFasL组和对照组明显增加（P〈0．01）。结论：SurvivinRNA干扰表达载体可降低survivin的表达。sFasL联合survivinRNA干扰较单用sFasL或survivin RNA干扰能更有效地抑制肺腺癌细胞A549增殖，促进凋亡。     

全反式维A酸联合c-myc RNA干扰抑制肺腺癌细胞增殖并诱导凋亡

目的 探讨全反式维A酸(ATRA)联合c-myc RNA干扰后肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的改变及对survivin 基因表达的影响.方法 构建c-myc特异RNA小干扰(siRNA)的表达载体,转染A549细胞后G418(Geneticin)筛选出稳定表达c-myc特异siRNA的细胞株,荧光实时定量RT-PCR和免疫印迹 (Western blot)检测c-myc基因表达水平.ATRA作用于c-myc RNA干扰细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测吸光度值,流式细胞仪测凋亡率,定量RT-PCR和免疫印迹检测survivin基因表达.结果 成功构建c-myc-siRNA表达载体.c-myc基因mRNA和蛋白表达下降71.9%和85.6%.ATRA联合c-myc-siRNA细胞组吸光度值在各时间点较单用ATRA组,单用c-myc-siRNA组以及对照组均下降,差异有显著性(P＜0.01),凋亡率增加,差异有显著性(P＜0.01).ATRA联合c-myc-siRNA细胞, survivin表达下降49.2%,差异有显著性(P＜0.01).结论 ATRA联合c-myc-siRNA较单用ATRA或c-myc siRNA能更有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞的凋亡.survivin基因表达降低.     

HIF-1α基因沉默对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤生长及survivin表达的影响

目的观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因沉默对肺癌的抑瘤效应和survivin表达的影响。方法将实验用肺腺癌A549细胞分为空白对照组、无意义序列转染组和实验组,接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型,观测HIF-1α-MiRNA对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用和对survivin表达的影响。采用免疫组化SP法,检测HIF-1α和survivin蛋白在裸鼠移植瘤中的表达。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HIF-1α和survivin mRNA的表达。采用原位末端标记（TUNEL）法检测肿瘤组织中细胞凋亡。结果实验组裸鼠肿瘤的生长速度较空白对照组、无意义序列转染组明显减慢（P〈0.05）。接种60 d后处死裸鼠,实验组裸鼠的肿瘤重量为（0.59±0.28）g,明显轻于空白对照组[（1.90±0.18）g]和无意义序列转染组[（1.66±0.24）g,P〈0.01]。实验组肿瘤组织中HIF-1αmRNA和蛋白的相对表达量分别为（0.45±0.04）%和（24.56±5.83）%,survivin mRNA和蛋白的相对表达量分别为（0.32±0.02）%和（29.08±3.99）%,均明显低于空白对照组、无意义序列转染组（P均〈0.05）。但实验组肿瘤组织中凋亡细胞的数量显著高于对照组。结论以HIF-1α为靶点的基因治疗,可能通过下调靶基因survivin的表达促进肺癌细胞凋亡,发挥抑制肿瘤生长的作用。     

Upregulation of HIF-1α by Hypoxia Protect Neuroblastoma Cells from Apoptosis by Promoting Survivin Expression

Apoptosis is one of main types of neural cell death and is reversible and is a major target of therapeuticinterventions. However, detailed apoptotic cascades still need to be recognized. In present study, we determined thepromotion of HIF-1α and survivin in brain samples of a mouse model of hypoxic-ischemia and in neuroblastomaSH-SY5Y cells post hypoxia treatment. Then gain-of-function and loss-of-function strategies were adopted tomanipulate the HIF-1α in SH-SY5Y cells, and hypoxia-induced survivin upregulation and cell apoptosis weredetermined. Results demonstrated that the HIF-1α and survivin were significantly promoted in a mouse modelof hypoxic-ischemia or in SH-SY5Y cells post hypoxia in vitro. Manually upregulated HIF-1α could promote thehypoxia-induced survivin upregulation and improve the hypoxia-induced SH-SY5Y cell apoptosis. On the otherhand, the HIF-1α knockdown by RNAi reduced the hypoxia-induced survivin upregulation and cell apoptosis.Therefore, the present study confirmed the protective role of HIF-1α and survivin in the hypoxia-induced SHSY5Ycell apoptosis, and the survivin upregulation by hypoxia is HIF-1α-dependent. Promotion of HIF-1α andsurvivin might be a valuable stragegy for therapeutic intervention for hypoxic-ischemic encephalopathy.     

Survivin-siRNA抑制肺癌A549细胞的增殖并增强其对顺铂的敏感性

目的：构建靶向存活素（survivin）的干扰RNA（siRNA）质粒,观察其对A549细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响。方法：应用pSilencerU6质粒构建survivinsiRNA干扰质粒,RTPCR和Western blotting检测survivin mRNA和蛋白的表达,DAPI染色法检测细胞的凋亡,MTT法检测细胞的增殖。结果：成功构建了survivinsiRNA干扰质粒。SurvivinsiRNA质粒转染可明显下调A549细胞中survivin mRNA和蛋白的表达、抑制A549细胞的增殖、促进细胞的凋亡、增强A549细胞对顺铂的敏感性。结论：SurvivinsiRNA沉默survivin在肺癌细胞中的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡,并能增强肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性,survivin 可作为肺癌治疗的潜在靶点。     

雷帕霉素联合紫杉醇对SGC-7901增殖影响的研究

目的：研究雷帕霉素联合紫杉醇对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法：MTT法检测经雷帕霉素、紫杉醇和雷帕霉素＋紫杉醇作用后人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测缺氧诱导因子-la（hypoxia-inducible{actor-1alpha,HIF-1α）及血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）蛋白表达,两因素析因设计方差分析法进行统计分析。结果：雷帕霉素、紫杉醇及雷帕霉素联合紫杉醇处理SGC-7901细胞后细胞增殖抑制率分别为（25．43±1．98）％、（27．28±3．34）％和（53．64±1．99）％,雷帕霉素或紫杉醇单独作用均可抑制细胞增殖,联合作用对细胞增殖抑制率影响极显著,F-57．471,P〈0．001;两药联合指数〉1．15,雷帕霉素和紫杉醇具有协同作用。雷帕霉素、紫杉醇及雷帕霉素联合紫杉醇处理SGC-7901细胞后细胞凋亡率分别为（16．25±1．86）％、（21．80±3．12）％和（38．60±3．78）％,雷帕霉素或紫杉醇单独作用均可诱导细胞凋亡,两药联用细胞凋亡率显著增加,P=O．0163;雷帕霉素和紫杉醇具有协同诱导SGC-7901细胞凋亡作用。紫杉醇处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达量分别为0．598±0．089和0．4204±0．091,VEGF蛋白表达下降,P=0．001;而HIF_1a蛋白表达无明显变化,P=0．434。雷帕霉素处理细胞后,HIF-1d及VEGF蛋白相对表达量分别为0．416±0．034和0．376土0．022,表达均显著下降,P值分别为0．016和0．001;而两药联合处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达分别为0．209±0．027和0．156±0．015,均显著降低,F值分别为18．322和25．525,P值均为0．001。2种药物对SGC-7901细胞HIF-1aTYcVEGF蛋白表达抑制起到了显著的协同作用。结论：雷帕霉素联合紫杉醇可显著抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导凋亡,2种药物具有协同抗肿瘤作用。     

胃癌细胞SGC7901凋亡的PI3K/Akt通路介导作用及雷帕霉素的作用机制分析

目的：分析雷帕霉素对胃癌细胞中PI3K/Akt蛋白表达的影响作用,以为临床治疗提供参考。方法将生长状态良好的胃癌细胞SGC7901随机分为4组：对照组,雷帕霉素低剂量组、中剂量、高剂量组（n=8）。采用DAPI染色法分析各组细胞的凋亡情况;采用免疫印迹法和Real-time PCR检测PI3K/AKT信号通路中相关蛋白PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表达。结果雷帕霉素低、中、高剂量组均可抑制细胞的增殖,差异具有统计学意义（P﹤0.05）;雷帕霉素下调了胃癌细胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表达,且与对照组比较,差异均有统计学意义（P﹤0.05）。结论雷帕霉素主要通过抑制PI3K、AKT及mTOR的过表达发挥肿瘤抑制作用。     

Hypoxia Induced Multidrug Resistance of Laryngeal Cancer Cells via Hypoxia-inducible Factor-1α

Objectives: To investigate whether hypoxia has an effect on regulation of multidrug resistance (MDR) tochemotherapeutic drugs in laryngeal carcinoma cells and explore the role of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α). Methods: Laryngeal cancer cells were cultured under normoxic and hypoxic conditions. The sensitivityof the cells to multiple drugs and levels of apoptosis induced by paclitaxel were determined by MTT assay andannexin-V/propidium iodide staining analysis, respectively. HIF-1α expression was blocked by RNA interference.The expression of HIF-1α gene was detected by real-time quantitative RT-PCR and Western blotting. The valueof fluorescence intensity of intracellular adriamycin accumulation and retention in cells was evaluated by flowcytometry. Results: The sensitivity to multiple chemotherapy agents and induction of apoptosis by paclitaxelcould be reduced by hypoxia (P<0.05). A the same time, the adriamycin releasing index of cells was increased(P<0.05). However, resistance acquisition subject to hypoxia in vitro was suppressed by down-regulating HIF-1αexpression. Conclusion: HIF-1α could be considered as a key regulator for mediating hypoxia-induced MDR inlaryngeal cancer cells via inhibition of drug-induced apoptosis and decrease in intracellular drug accumulation.     

下调CK2α基因表达抑制肺腺癌A549细胞的增殖和凋亡

目的:探讨下调CK2α基因表达后对肺腺癌A549细胞的影响.方法:构建pSilencerTM4.1-shCK2α-eGFP慢病毒表达载体,建立稳定干扰CK2α表达的A549细胞株.利用MTT、克隆形成、凋亡实验检测干扰CK2α基因表达后,A549细胞的增殖和凋亡的能力.利用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-xl、Bcl-2的表达.结果:下调CK2α基因表达后肺腺癌A549细胞增殖能力减低,促进细胞凋亡.细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8上调,但Bcl-xl、Bcl-2蛋白明显下调.结论:下调CK2α基因表达后抑制肺腺癌A549细胞增殖、促进凋亡.