用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究：Ⅰ.球形芽孢 …

为了提高球形芽孢杆菌对中华按蚊的毒效,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术成功扩增了Ｂ．ｓ．中有毒效作用的基因片估,通过Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰,使目的基因片段得以成功克隆,借助光微生物素核酸标记探针,原位杂交筛选出目的基因阳性克隆。本实验中Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰是ＰＣＲ产物克隆成功的关键。     

球形芽孢杆菌2362株杀蚊幼虫蛋白基因的克隆

利用合成的寡核苷酸探针从球形芽孢杆菌2362株基因文库中筛选了四个杂交阳性克隆,它们分别携带质粒 pDC4(7.8kb)、pDC5(7.8kb)、pDC6(8.4kb)和 pDC7(6.4kb)。斑点杂交结果显示,探针与pDC7结合能力明显比与 pDC4和 pDC6结合能力弱。四个杂合质粒 EcoRI 酶切图谱不同,但插入片段中都含有一个3.3kb 片段。Southern 印迹杂交实验进一步揭示该3.3kb 带可为探针识别;pDC24除此之外还有-1.4kb 杂交带,表明该质粒中携有两个与探针同源的序列。在以上四个克隆中,E.coli HB101(pDC4)对淡色库蚊幼虫有显著毒性,因而携有完整的基因51和基因42序列。     

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究Ⅱ.蚊幼虫肠壁细胞膜抗体基因的克隆

为了提高 Ｂ．ｓ．对蚊幼虫肠壁细胞膜的识别与结合力从而提高其杀蚊活性，本实验解剖了万余只中华按蚊幼虫肠道，制备了按蚊幼虫肠壁膜泡抗原及其鼠抗血清。抗原蛋白组分分析表明膜泡的纯度较高，而抗血清实验则显示出抗体组分与肠壁的结合作用。利用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术成功扩增了小鼠抗体重链区基因，借助 Ｔ４ Ｄ Ｎ Ａ 聚合酶的修饰，使抗体基因得以成功克隆，为研制抗体基因与毒蛋白基因融合编码的“生物导弹”打下了基础。     

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究：Ⅱ.蚊幼 …

为了提高Ｂ．ｓ．对蚊幼虫肠壁细胞膜的识别和从而提高其杀蚊活性，本实验解剖了万余中华按蚊幼虫肠道，制备了按蚊幼虫肠壁膜泡抗原及其鼠抗血清。抗原蛋白组分分析表明膜泡的纯度较高，而抗血清实验则显示抗体组分与肠壁的结合作用。利用ＰＣＲ技术成功扩增了小鼠抗体重链区基因，借助Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰，使抗体基因得以成功克隆，为研制抗体基因与毒蛋白基因融合编码的“生物导弹”打下了基础。     

苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌杀蚊作用以及工程菌改造研究进展

苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌是应用最广泛的杀蚊幼虫的细菌,但还存在很多不足.苏云金芽孢杆菌产生两类杀蚊幼虫晶体蛋白,即内毒素晶体蛋白和溶细胞毒素,球形芽孢杆菌产生二元毒素和杀蚊毒素.研究不同毒素的不同杀蚊作用,以及通过DNA重组技术改造原有的菌种,扩大其杀蚊幼虫的活性和范围,有助于更有效地杀火媒介蚊虫和防治疟疾.     

球形芽孢杆菌缓释块剂对蚊幼的毒效试验

本文报道了一种浮于水面，不断释放杀虫剂，适合特殊蚊虫孳生地的球形芽孢杆菌漂浮缓释剂（代号：ＢｓＣ３－４１）．在试验中取得良好杀蚊效果．生物测定结果：ＢｓＣ３－４１块剂对Ⅲ龄致乏库蚊幼虫的ＬＣ５０为０．０１７０ｍｇ／Ｌ。野外试验对三带喙库蚊幼虫最佳剂量为４ｇ／ｍ２，持效期一个月以上。     

水蚤对球形芽孢杆菌灭蚊幼效果的影响

本文结果证明,在蚊虫孳生地中,与蚊幼共存的水蚤是影响B.S灭蚊效果的极为重要的生态限制因子,它可使B.S对蚊幼虫的杀灭率下降30％～50％,使B.S持效明显缩短或消失。细菌学观察证实,水蚤对B.S具有快速的清除作用,B.S暴露于水蚤的生境中,于12hB.S菌数下降86％。这一生态限制因子给B.S的杀虫效果带来严重影响,是B.S应用中亟待解决的问题。     

球形芽胞杆菌S层蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆球形芽胞杆菌S层蛋白的编码基因,实现其原核表达并纯化表达产物。方法提取球形芽胞杆菌菌体基因组DNA,根据GenBank公布的核酸序列设计并合成引物,扩增S层蛋白编码基因sllB,与pMD19-T载体连接;测序验证后,构建原核表达质粒pET28a(+)-sllB并转化BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAG和Westernblot鉴定表达产物,亲和柱层析纯化重组蛋白。结果扩增获得S层蛋白编码基因sllB全长(3 306bp),与参考序列同源性为97.5%。构建的原核表达质粒pET28a(+)-sllB转化BL21(DE3)后,SDS-PAGE显示表达蛋白的分子质量为116ku,与理论值相符。Western blot显示其全蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白中均被鼠抗Penta-His抗体识别。结论获得了球形芽胞杆菌S层蛋白编码基因sllB,并实现了其原核表达。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒性蛋白基因的克隆及其原核表达

目的从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bti）以色列亚种中获得cry4B、cry11A和cyt1A3种主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行克隆和原核表达。方法根据GenBank上3种基因的已知序列设计合成引物,应用PCR技术扩增目的基因,克隆入pUC19质粒,阳性克隆质粒经酶切和测序鉴定。将测序鉴定的3种蛋白基因克隆入原核表达载体（pET32c）进行原核表达。结果PCR扩增获得特异性的基因片段,重组质粒经酶切后获得预计大小的基因片段,并测序鉴定。序列结果与已知序列一致。原核表达载体经ITPG诱导,获得预计大小的目的蛋白。结论成功克隆了苏云金芽孢杆菌以色列亚种的3个主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行原核表达。     

卡介苗菌MDP1基因敲除技术的研究

目的 在卡介苗中建立基因敲除技术。方法 通过分别设计两绔引物，将靶基因[DNA结合蛋白1(MDP1)基因]通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增得到2个片段，分别插入pKO质粒中，构建得到基因敲除质粒pKO-MDPI，电转入至卡介苗菌株细胞内并与BCG基因组中的MDP1基因同源交换，筛选出敲除菌株，并测其生长曲线。结果 通过2次PCR筛选和1次蔗糖反筛选后得到的，并在含潮霉素培养基上不能生长的菌株为MDP1基因敲除菌株，对敲除菌株与原代菌株每12h测定其菌液的60hm处吸光度(A600)值，连续16d。两者的生长速度曲线呈现“S”形，两者之间的生长速度未见明显差别。结论 pKO质粒可作为基因敲除有用的质粒载体，MDP1基因可能是影响BCG生长的因素之一，但不是惟一的因素。     

鲍曼不动杆菌耐药性与生物被膜及外膜蛋白基因ompA相关性研究

目的 对鲍曼不动杆菌耐药性与生物被膜及外膜蛋白基因ompA的相关性进行研究.方法 收集非重复鲍曼不动杆菌126株,采用琼脂扩散(K-B)法进行体外药敏实验;改良平板法测定生物被膜形成能力;采用聚合酶链反应(PCR)法扩增外膜蛋白基因ompA;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法测定生物被膜形成的不同阶段外膜蛋白基因ompA表达水平的变化.结果 126株鲍曼不动杆菌中,多重耐药菌分离率为62.70％ (79/126);PCR检测到多重耐药鲍曼不动杆菌中ompA基因的检出率为87.34％ (69/79);RT-PCR检测到浮游菌、生物被膜3d、生物被膜5d外膜蛋白基因表达的相对灰度值分别为0.557 3±0.305 3、0.820 8±0.095 7、1.097 5±0.208 6,统计学分析显示,外膜蛋白基因ompA在生物被膜生长的不同时期其表达水平的差异有统计学意义.结论 鲍曼不动杆菌耐药情况严峻,多重耐药菌分离率呈升高趋势;多重耐药性可能与生物被膜形成及外膜蛋白基因ompA高表达有关.     

马鹿布氏杆菌25kDa外膜蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆马鹿布氏杆菌ML分离株25kDa外膜蛋白(Omp25)基因,并在大肠杆菌中表达。方法运用RT-PCR技术从马鹿布氏杆菌分离株中扩增出Omp25基因,将其克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定和遗传变异分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。结果该基因全长642bp,编码213个氨基酸;其中前23个氨基酸残基构成信号肽。在推导的氨基酸序列中,存在两个跨膜区,但没有潜在的N-联糖基化位点。与GenBank中已经登录的布氏杆菌其他11个分离株相比,马鹿布氏杆菌分离株Omp25基因变异较小,以散在的点突变为主,Omp25基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.1%-99.4%和99.2%-99.5%之间。转化重组质粒pETOMP25的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出具有反应原性的目的蛋白,表达量占菌体蛋白的18.6%。结论马鹿布氏杆菌分离株与流产型布氏杆菌其它分离株Omp25基因同源性很高,可能是一个毒力较强的野毒株。     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3' 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3 端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3’ 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。     

细胞毒素相关蛋白基因A与胃粘膜组织恶变的研究

目的:研究细胞毒素相关蛋白基因A(cagA)阳性幽门螺杆菌(Hp)在胃粘膜组织恶性化转变中的作用。方法:以含Hp细胞毒素相关蛋白基因A的质粒(P~(MC3))为外参照品,在微孔板上对PCR扩增cagA的产物作探针杂交及辣根过氧化物酶酶促显色分析,定量榆测不同组织中cagA阳性Hp。结果:往50份Hp尿素酶B基因阳性的临床标本中检测到28份cagA亦阳性(56％),其中5份浅表性胃炎组织,12份癌前病变组织及11份胃癌组织。浅表性胃炎组织cagA阳性的Hp感染率(31％)及每毫克组织感染的平均拷贝数(12.8)均显著低于(P<0.01或P<0.05)癌前病变组织(60％;77.1)或胃癌组织(79％;57.6),二者在后两种组织间均无显著性差别(P>O.05)。结论:cagA阳性的Hp感染可能有助于胃粘膜组织的恶性化转变,这种转变与cagA阳性Hp的感染量有关。     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

基因重组融合蛋白hNPY对小鼠前脂肪细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞,如能找到可促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物,并在脂肪组织移植的同时使用,则有希望提高脂肪组织的移植效果,本实验探索一种新的人体肥胖关联基因和外周脂肪细胞激动剂一基因重组融合蛋白hNPY对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响及其分子调控机制。方法：采用基因工程技术设计hNPY基因上下游序列,经过PCR反应合成hNPY的cDNA后与pET28a＋载体重组,再将已构建好、并经测序确认无误的重组质粒pET28a—NPY转导至大肠杆菌BL21（DE3）,再由IPTG诱导表达hNPY融合蛋白、并进行纯化;然后,将体外培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞经由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和地塞米松进行联合诱导;诱导2d后,再将此细胞分为三组,即空白对照组（未加任何诱导剂组）、经典诱导组（胰岛素诱导）和实验干预组（hNPY融合蛋白干预）,其中,实验干预组再按照hNPY融合蛋白浓度不同又分为高、中、低三个浓度组（10^-8mol／L、10^-19mol／L和10^-9 mol／L）。分别于细胞培养的第7d和第12d用相差显微镜观察各组细胞的形态学变化,再于细胞培养的第12d用油红O染色观察脂肪细胞的分化程度;同时,采用MTT法检测该细胞的增殖状况;采用Westernblot法检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ（PPAR-γ）、CAAT／增强子结合蛋白-a（C／EBP-a）蛋白的表达水平。结果：低浓度（10^-10 mol／L）的hNPY融合蛋白,无明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的作用效果;中浓度（10^-9 mol／L）的hNPY融合蛋白,可有效促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖及细胞数量增多;而高浓度（10^-8 mol／L）的hNPY融合蛋白,不仅能明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的细胞增殖和分化,且能显著提高该细胞C／EBPa和PPARγ的表达水平、而明显降低INSIG-2的表达。结论：高浓度（10^-8mol／L）的基因重组融合蛋白hNPY能够明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化,其促进3T3-L1细胞增殖和分化的分子调控机制很可能与上调PPARγ、C／EBPa表达和降低INSIG-2表达水平有关,这提示：hNPY作为脂肪细胞膜上受体NPYR的有效促进剂或激动剂,未来很可能成为人体外周脂肪细胞一个新的作用靶点。     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的：构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外（结构）域基因片段和人IgG1Fc基因片段。并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外（结构）域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgG1Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1（＋）上;并通过PCR及双酶切进行鉴定。应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外（结构）域基因和人IgG1Fc基因;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础。