肺癌胸水中肿瘤浸润淋巴细胞的生物学活性研究

目的 :探讨肺癌胸水中肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)的生物学活性 ,便于更好地应用于临床。方法 :用白细胞介素2 (IL 2 )诱导培养肺癌胸水TIL ,按常规法计数TIL细胞增殖量 ,采用流式细胞仪分析TIL细胞表型及MTT法检测其杀瘤活性。结果 :经IL 2诱导培养TIL 2 1天后 :TIL增殖大于 10 0 0倍的患者有 17例占 77%。CD3差异无显著性 (P >0 0 5 ) ,CD4、CD8差异有显著性 (P <0 0 1) ,而CD4 /CD8比值高达 3 5 3± 0 82 ,并且在 2 1天时TIL具有较高的细胞毒性。结论 :肺癌胸水中的TIL体外诱导培养 2 1天时TIL具有较强的生物活性 ,此时用于胸水治疗可取得可靠的疗效     

PJ-CW对细胞因子活化的杀伤细胞表型及细胞毒活性的影响

本文介绍我室有关LAK、TIL的体外诱导与活性调节研究及脐血CIK细胞诱导的初步研究.制备LAK-CM与PHA-CM(略)将TIL细胞(2×10~5/ml)分悬于含IL-2(500μ/ml)和/或PJ-CW(25μg/ml)的培液中置37℃,5%CO_2环境中培养,于培养后不同时间测定细胞扩增速度,并于第9天测定TIL细胞表型的变化(采用APAAP法与荧光检测法)及对自体肿瘤细胞与瘤靶细胞的杀伤活性(MIT显色法).将脐血淋巴细胞(1×10~6/ml)分别置含IL-2(2000μ/ml)和/或PJ-CW(25μg/ml)的环境中常规孵育,并于孵育后第5天进行表型分析(方法同前)及细胞毒活性测定.分离脐血淋巴细胞,于培养的不同时间分别加入rIFN-γ(1000U/ml),CD3MAB(20μl/ml),IL-2(300U/ml)及IL-1(100U/ml),测定其表型(方法同前).     

血清IL-2水平对胸水TIL细胞体外扩增及活性的影响

目的通过对血清白介素-2(interleukine-2,IL-2)水平的检测,了解内源性IL-2水平对胸水TIL细胞体外扩增及抗肿瘤活性的影响.方法对54例有恶性胸水患者,第一次抽胸水时无菌收集胸水,进行TIL细胞培养,并同时进行血清IL-2水平检测.TIL细胞体外杀瘤活性用MTT法检测,血清IL-2的水平用ELISA法检测.将IL-2水平较高的27例患者分为1组,IL-2水平较低的27例患者分为另1组,比较两组患者胸水TIL细胞体外增殖速度及杀瘤活性.结果血清IL-2水平较低组,TIL细胞体外培养8天后扩增59.3±20.9倍,培养12天后扩增112.5±32.9倍,明显高于IL-2水平较高组的24.0±11.0倍和62.5±21.9倍.IL-2水平较低组TIL细胞体外杀瘤率为45.3±9.5%,明显高于IL-2水平较高组的26.7±7.3%,P＜0.05.结论血清IL-2水平高低与TIL细胞体外增殖的速度及其杀瘤活性明显相关,IL-2水平较低的患者胸水中TIL细胞体外增殖的速度较快,杀瘤活性较强.血清IL-2水平可望作为恶性胸水IL-2/TIL治疗选择的指标.     

IL-2胸腔内输入治疗恶性胸水的临床观察

癌性胸水的控制与否,对于肿瘤愈后影响较大,我们应用IL-2胸腔内注入治疗癌性购水,前瞻性的进行了临床观察.结果表明:IL-2胸腔内注入治疗癌性胸水56例,胸水的控制率在80.3%,与田口等报道的结果基本相同.其机理可能为IL-2直接诱导活化NK以及LAK细胞、TIL细胞,它们直接杀伤胸膜表面的肿瘤细胞,并促使胸膜纤维化、胸膜粘连,     

自体癌性胸腹腔积液蛋白质回输临床疗效观察

目的观察浓缩分离的癌性胸腹腔积液蛋白质自体静脉回输的临床疗效.方法采用透析、冷凝、变速离心和抽滤等技术对癌性积液中的蛋白质进行分离提取,将可溶性蛋白稀释在盐水中用于静脉回输.结果该方法提取的蛋白质可浓缩9.78倍,蛋白质浓度可达(262.32±52.36)g/L,其中IL-2、IL-4、IFN 和TNF的浓度(pg/L)分别达到53.34±9.67,47.55±9.25,57.43±15.75和73.50±15.17,提取后浓度明显增加(P<0.05).自体蛋白液回输后无一例发生发热、过敏等副反应,同时水肿也得到一定程度的控制.CD3 、CD8 细胞百分率,总蛋白及IgG浓度均无明显改变(P>0.05),但CD4 细胞百分率和CD4 /CD8 比值明显增加(P<0.05 ).结论通过透析、变速离心及抽滤等技术,可从癌性胸、腹腔积液中浓缩分离出适于静脉输注的蛋白质提取液.自体蛋白质回输以后,水肿得到一定程度的控制,并使CD4 细胞百分率和CD4 /CD8 比值提高.     

NDV/β-榄香烯自体瘤苗对消化道肿瘤患者T细胞不同亚群平衡的影响

目的:探讨新城鸡疫病毒及β-榄香烯联合处理的自体瘤苗对消化道肿瘤患者T细胞不同亚群免疫平衡的影响.方法:对80例消化道肿瘤患者术后进行自体瘤苗治疗,检测患者手术前、免疫治疗结束后外周血中CD4 、CD8 、CD4 /CD8 比值变化,以及Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2类细胞因子(IL-4、IL-10)的变化.结果:瘤苗治疗后,患者外周血T细胞亚群CD4 、CD8 、CD4 /CD8 比值均发生了较明显变化,与治疗前比较差异有显著性(P＜0.05), 与正常对照组比较差异无显著性 ;治疗后IL-2 、IFN-γ水平上升,而IL-4 和IL-10水平下降,与治疗前比较差异有显著性,与正常对照组比较差异无显著性.结论:自体肿瘤疫苗免疫疗法有助于恢复免疫系统平衡,增强机体抗肿瘤免疫能力;纠正肿瘤患者Th1/Th2偏离状态.     

肿瘤患者自体抗CD3抗体 IL-2诱导LAK与LAK的比较及在生物治疗中的意义

本研究旨在观察抗CD3抗体联合IL-2诱导LAK在肿瘤生物治疗中的应用前景.效应细胞的制备:本院实体瘤患者外周血PBLC,选用RPMI 1640、15%人 AB血清,分别经(1)IL-2 1000U/ml:(2)CD3抗体300μg/ml IL-2 1000U/ml诱导培养2周.免疫表型分析:采用DAKO公司荧光抗体CD3.CD4、CD8、CD56、CD25、CD45RO/CD8对培养2周的CD3LAK与LAK细胞进行直接免疫荧光方法流式细胞仪检测.靶细胞抑制力:采用细胞增殖检测试剂盒I Cat No.1465007(MTT),Raji、K562为靶细胞,LAK、CD3LAK为效应细胞,效靶比例为10、5、1:1.     

树突状细胞体外高效诱导白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞生成

[目的]研究体外诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及其抗白血病反应.[方法]应用mGM-CSF及mIL-4细胞因子从小鼠骨髓细胞扩增出成熟树突状细胞(DC),使其负载冻融法制备的白血病细胞相关抗原(TAA),通过观察DC诱导的白血病特异性CTL的免疫表型,MTT分析其对于L7212细胞的抑制率,利用ELISA评价IL-2和IL-4水平.[结果]骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4的联合作用7天后光镜及扫描电镜下观察到大量成熟DC生成.经负载TAA的DC活化后T细胞中CD3 、CD8 、CD25 细胞明显增多.FCM显示CD3 、CD8 、CD25 T细胞显著增多,CD8 细胞多于CD4 细胞.活化后T细胞对L7212细胞有特异性杀伤活性,在效靶比为50:1培养72 h后杀伤率达90.1%±2.7%.DC与T细胞共培养上清中IL-2的分泌水平为4.656±0.62pg/ml,明显高于普通T细胞培养组的1.436±0.11pg/ml(P=0.011),IL-4水平则无明显变化(P＞0.05).[结论] mGM-CSF及mIL-4配伍诱导生成的DCs经L7212冻融抗原负载后可在体外高效诱导白血病特异性CTL生成.     

两种不同成分培养基制备CIK细胞的生物学特征

目的:采用细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK cell)培养基(含低浓度IL-2、IFN-γ、IL-12和anti-CD3)和NK培养基(含高浓度IL-2和anti-CD3)体外刺激诱导CIK,分析CIK细胞的扩增、表型和细胞因子分泌情况。方法:健康自愿者来源的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别加入CIK培养基和NK培养基进行诱导培养,24 h后,换用含IL-2的1%自体血浆培养基继续诱导培养2周。在培养的第6天和第10天检测培养上清中IFN-γ的分泌情况,在培养的第10天以流式细胞术检测两组培养细胞表面CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达情况。结果:CIK培养基和NK培养基均可使培养细胞在第7天时开始明显扩增,第10天时可扩增至200倍。其中,CIK培养基获得的细胞扩增倍数明显高于NK培养基,其IFN-γ分泌明显高于NK培养基组[(724.7±434.8)vs(108.9±60.6)pg/ml,P<0.01];而以NK培养基培养的细胞,CD3-CD16+CD56+细胞比例高于CIK培养基[(6.27±3.33)%vs(2.88±1.88)%,P<0.05]。结论:不同成分的CIK培养基和NK培养基均可促进CIK细胞的扩增和成熟,但呈现不同的生物学特征。     

肿瘤浸润淋巴细胞的体外培养及临床应用研究

目的:研究肺癌患者胸腔积液中肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)对瘤细胞的杀伤活性及其表型变化,并对其回输后毒副反应及患者免疫功能进行观察。方法:应用贴壁法分离恶性胸腔积液中TIL,并经rIL2诱导培养;用间接免疫荧光法测定CD3+、CD4+和CD8+比例;应用3HTdR释放法测定TIL对自体瘤细胞和801D细胞的杀伤作用;用活化的自体TIL注入患者胸腔内,观察胸腔积液变化。结果:第21天时CD3+和CD8+比例明显提高,而CD4+比例和CD4+/CD8+比值变化不大;对自体瘤细胞和801D细胞的杀伤力明显提高;40例自体回输治疗胸腔积液的患者,有效率为72.5%,且一般状况好,毒副反应小,辅助检查无异常改变,免疫功能增强。结论:肺癌TIL过继免疫治疗对恶性胸腔积液患者是一种安全、有效的免疫治疗方法。     

CD103阳性肿瘤浸润淋巴细胞与卵巢高级别浆液性癌患者预后关系的研究

  目的  评估CD103阳性（CD103+）肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte,TIL）在实施初次肿瘤减灭术（debulking surgery,PDS）与新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy,NACT）的卵巢高级别浆液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma,HGSC）患者中分布、表达差异与临床病理特征及预后的关系。  方法  收集2018年6月至2019年6月四川大学华西第二医院收治的137例HGSC患者的临床病理资料,将患者石蜡组织标本制成组织芯片,分为 PDS组83例和NACT组54例。采用免疫组织化学法和免疫荧光共染法观察CD103+TIL与CD8阳性（CD8+）、CD4阳性（CD4+）TIL的关系,并采用相应的统计学方法分析CD103+ TIL与患者治疗、预后的关系。  结果  采用χ2检验显示,NACT组CD103+TIL、CD8+TIL表达均高于PDS组（P=0.026、P=0.029）,且CD103+TIL、CD8+TIL与化疗敏感性具有显著性相关（P=0.03、P=0.018）,两组患者CD4+TIL与所有临床病理特征均无显著性相关（P>0.05）。Spearman相关性检验显示,CD103+TIL与CD8+TIL具有显著性相关（P<0.01）。免疫组织化学法和免疫荧光共染法结果显示,CD103+TIL实际多为CD8+TIL。单因素及Cox比例风险回归模型多因素生存分析发现,仅在肿瘤上皮内CD103+TIL、CD8+TIL的表达具有预后意义,是HGSC的独立预后因素（P<0.05）。  结论  HGSC患者CD103+TIL主要分布于肿瘤上皮内,是免疫活性更高的CD8+TIL亚群,因此CD103+TIL较CD8+TIL可更好地预测患者预后。      

TIL肿瘤过继细胞治疗研究进展

肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)是从肿瘤组织中分离出的CD4+、CD8+T细胞,在体外经白介素2(interleukin-2,IL-2)的刺激、活化、扩增后可应用于临床肿瘤过继细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)。为避免IL-2在扩增中的大量使用使得TIL中CD4+CD25+Treg数量增加所产生的免疫耐受现象,现在研究集中于改进TIL的体外扩增方法;研究显示,"年轻"型TIL(young TIL)靶向肿瘤的特异性更高,故其是潜在的扩增对象。临床使用TIL过继治疗前需对肿瘤患者进行全身放疗处理;TIL过继治疗联合化疗药物(如环磷酰胺,氟达拉滨等)对自体淋巴清除(lymphodepletion)的肿瘤患者疗效显著,将成为以后肿瘤免疫治疗的主要方向;除化疗药物外,还可开发肿瘤疫苗、单克隆抗体等联合TIL过继治疗。本文主要介绍TIL培养体系、功能改进的研究以及TIL过继治疗联合化疗药物在临床恶性肿瘤治疗中的应用,讨论其可能存在的问题并展望未来的发展方向。     

CD3抗体激活的杀伤细胞实验性抗喉癌作用的研究

基于CD3抗原广泛存在于成熟T细胞表面的理论基础,我们应用CD3单克隆抗体与IL-2在体外成功诱导出了具有较好增殖活性的CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞),并对其抗喉癌作用进行了观察和研究.结果表明:与常规培养的LAK细胞相比,以健康人新鲜外周静脉血单个核细胞为前体、经CD3单抗(4μg/ml)和IL-2(1000U/ml)诱导产生的CD3AK细胞具有集落形成率高、体外扩增能力强、存活时间长、抗瘤作用持久稳定等优势.在培养初期,CD3AK细胞的扩增情况与LAK细胞相似,但CD3AK细胞生长后劲明显,于培养8～10天达增殖高峰,平均扩增18.5倍,并可维持体外长期存活达两周之久,而同期培养的LAK细胞1周时平均仅增5.5倍,且多于1周后逐渐死亡,二者相比有非常显著性差异;同时,CD3AK细胞在体     

小鼠肝癌全细胞抗原致敏骨髓DC激活TIL抗癌机制的研究

目的:通过分析小鼠肝癌H22细胞全细胞性抗原致敏小鼠骨髓树突状细胞(DC)前后DC表型变化及其分泌细胞因子的变化,探讨肝癌细胞全细胞性抗原致敏DC激活肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的抗癌机制。方法:取得小鼠骨髓细胞并诱导生成DC,用冻融法制备的小鼠肝癌H22细胞全细胞抗原致敏,然后用已致敏的DC激活TILs,测定DC致敏前后DC表面抗原CD80、CD86、CD40和MHCⅡ表达变化及DC分泌细胞因子IL-12、IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平,评估激活前后TIL对H22细胞的杀伤活性,同时以小鼠脾淋巴细胞作为杀伤对照。结果:致敏后小鼠骨髓DC表面抗原CD80、CD86、CD40和MHCⅡ表达率分别为(57.55±7.32)%、(54.49±14.20)%、(46.79±8.25)%和(53.94±13.94)%,明显高于未致敏DC的(20.01±5.22)%、(24.56±9.08)%、(18.06±5.13)%和(30.24±8.39)%,P值均<0.05;DC上清液中IL-12、IL-2、IFN-γ和TNF-α浓度分别为(80.40±1.33)、(94.67±3.36)、(29.83±1.20)和(75.01±4.10)ρg/mL,明显高于未致敏DC的(19.35±0.99)、(11.25±0.50)、(1.05±0.09)和(2.02±0.27)ρg/mL,P值均为0.000。经致敏后成熟DC激活的TIL对H22细胞杀伤率为(81.80±2.90)%,明显高于未激活TIL、激活或未激活小鼠脾淋巴细胞的(62.64±3.94)%、(47.35±3.40)%和(28.45±2.56)%。结论:H22细胞全细胞抗原致敏DC后,其表型变化及细胞因子分泌增多是其诱导活化TIL抗癌活性的可能机制。     

双特异抗体对肿瘤浸润淋巴细胞细胞毒性增强效应

近年来研究表明,部分肿瘤组织中分离TIL细胞.单用IL-2难以诱导出高的抗癌活性.双特异性抗体中能识别T细胞抗原受体复合物的抗CD3单抗不仅能促进TIL细胞增殖,而且能增强其抗瘤活性;而识别肿瘤细胞表面抗原的抗肿瘤单抗,则引导TIL定向杀伤肿瘤靶细胞.本文选择了抗CD3单克隆抗体和抗肺癌单克隆抗体制成双特异性抗体,探索其对TIL细胞杀伤肺癌细胞增强效应,现报告如下:首先采用SPDP化学偶联法将纯化后抗CD3单抗和抗肺癌单抗ALTO4以二硫键连接成ALTO4-CD3双特异性抗体.再分离得到TIL细胞,并经间接免疫荧光法证实制得TILCD3~ 细胞占65%.采用间接免疫荧光法检测显示AL-TO4-CD3能同时与A549和TIL细胞特异地结合,而且通过其桥梁作用,显著增加TIL和A549细胞结合率;通过MTT比色     

用活化B细胞、CD3mAb、IL-2共刺激诱导人膀胱癌特异性抗瘤活性

我们采用活化异基因B细胞、CD3mAb、IL-2共刺激诱导膀胱TIL,对其增殖特性、免疫表型、杀瘤活性及IEN-γ分泌进行了初步研究.B淋巴细胞来自成人外伤切除脾细胞,用LPS、IL-4培养     

IFN-β临床应用研究进展

利用脂质体包被IL-2理论上能达到IL-2用量小、副作用少、疗效提高等效果.们前期应用脂质体IL-2联合CD3AK细胞治疗鼠肝黑色素转移瘤,取得了满意的实验结果.在此基础上,再探讨脂质体IL-2联合TIL、CY抗鼠肝癌的作用,旨在证明脂质体IL-2的优越性.1 材料与方法制备鼠H22肝癌皮下荷瘤模型,然后采用机械、酶消化和不连续密度梯度离心分离获得TIL,体外掺入rIL-2(1000U/ml)后培养、扩增.参照Konno及我所建立的制备脂质体方法制备复层大囊泡rIL-2脂质体(MLV-rIL-2).取昆明鼠40只随机分4组(即对照组、TIL CY组、TIL CY rIL-2组、TIL CY MLV-rIL-2组),每组10只进行体内治疗.后3组治疗开始前3天均用环磷酰胺(CY)腹腔注射,每日1次CY50mg/kg,然后尾静脉注射TIL,每次每只     

结肠癌瘤细胞对不同来源自体淋巴细胞的影响

[目的]研究结肠癌瘤细胞对自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞(LNL)、外周血淋巴细胞(PBL)的影响。[方法]比较结肠癌患者自体肿瘤细胞对体外培养TIL、PBL、LNL，细胞增殖、诱生细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平的影响。[结果]结肠癌患者的TIL和PBL、LNL相比，CD8^ 细胞增加，CD4^ 细胞数减少。PBL和LNL对PHA、rhIL-2刺激产生的细胞增殖能力比TIL强。PBL能产生较高水平的TNF-α和IFN-γ，而IL-2产生水平较低；LNL产生高水平的TNF-α和IL-2，但仅产生低水平的IFN-γ。TIL产生的TNF-α、IFN-γ水平较PBL、LNL低。[结论]结肠癌患者自体肿瘤细胞对不同来源淋巴细胞的细胞因子分泌有不同影响，PBL可能是结肠癌过继性细胞免疫治疗较为理想的CTL前体细胞来源。     

不同浓度IL-2对体外诱导肽特异性细胞毒性T淋巴细胞培养体系的影响

背景与目的：细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介导的特异性细胞免疫在抗肿瘤免疫过程中发挥着主要作用。该研究探讨不同浓度IL-2(50、200和1000 U/mL)对体外诱导表位肽特异性CTL培养体系培养的细胞亚群比例和功能的影响,以及高剂量IL-2是否会诱导该体系中的调节性T细胞(regulatory cell,Treg)的富集。方法：选取HLA-A2超型的肿瘤患者和健康供者各10例,取外周血分离外周血单核细胞,使用环氧合酶-2(Cox-2)来源的CTL表位肽P321(ILIGETIKI)与不同浓度IL-2体外诱导肽特异性CTL。运用流式细胞仪检测细胞的增殖能力、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞亚群的比例、Treg细胞亚群的比例,以及CD8+T淋巴细胞分泌穿孔素(perforin)、颗粒酶B(granzyme-B)、干扰素IFN-γ的能力。使用Elispot实验检测实验组细胞分泌IFN-γ的能力。结果：高浓度的IL-2有利于细胞的增殖。肿瘤患者组的CD4+T淋巴细胞比例高于健康供者组,而CD8+T淋巴细胞比例较健康供者组低;不同浓度IL-2对CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Treg细胞亚群比例以及CD8+T淋巴细胞分泌穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ的能力没有影响。随着IL-2浓度的增高,Elispot实验出现的阳性斑点数越多。结论：不同浓度IL-2条件对体外诱导表位肽特异性CTL培养体系培养出的细胞亚群比例和功能没有影响,在50~1000 U/mL IL-2浓度范围内,高剂量的IL-2不会诱导该体系中的Treg的富集。但高浓度的IL-2可以提高细胞的增殖能力,并且促进细胞分泌IFN-γ,而高浓度的IL-2可以使培养体系中存在的NK细胞或NKT细胞能够非特异性产生IFN-γ,从而对Elispot实验产生干扰。因此,在体外诱导肽特异性CTL时选用50 U/mL的IL-2浓度可以很好地维持T细胞的增殖和存活,并且最大程度地降低对Elispot实验的干扰。     

骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及研究

本研究探讨骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(OSS-CTL)的诱导方法及其抗瘤特性和杀伤机制.通过生化方法从HOS-8603人骨肉瘤细胞系中提取、纯化、鉴定骨肉瘤相关抗原(OSAA66),然后与低剂量IL-2(100U/ml),CD3(10μg/ml)单折协同刺激骨肉瘤致敏的外周血淋巴细胞,诱导产生OSS-CTL.检测其细胞表型、杀伤机制、体内外的增值能力及抗瘤活性,并与骨肉瘤TIL进行了比较.①流式细胞仪检测OSS-CTL的表型特征为CD3~ (87.6±6.3)%,CD4~ (21.7±4.1)%,CD8~ (94.7±5.3)%,CD11b~ (1.9±0.9)%,HLA-DR~ (79.3±8.7)%,即以CD3~ CD8~ CTL为主异质细胞群.②[3~H]-TdR释放法测定细胞毒性,结果OSS-CTL对HOS-8603和自体骨肉瘤细胞的杀伤活性分别为97.3%和95.2%,而对K562和SHG-44细胞仅为11.2%和9.6%,两组差异显著(P<0.05).提示,OSS-CTL对OSAA66有关的骨肉瘤细胞具有高效的特异杀伤活性.杀伤机制研究表明,在光镜和电镜下观察到OSS-CTL通过接触溶解和诱导凋亡途径杀伤靶细胞.通过流式细胞仪检测发现,效靶比为1:1,50:1,