肿瘤坏死因子-α对乳腺癌细胞CD44表达调控及其影响细胞迁徙机制的探讨

目的:检测肿瘤坏死因子(TNF-α)对乳腺癌细胞株MDA-MB-231中CD44s、CD44V3和CD44V6表达的调控及其对细胞迁徒力的影响,并探讨TNF-α调节CD44可能存在的信号途径.方法:用RT-PCR和蛋白质印迹法检测TNF-α(0、2、20和200 ng/mL)作用乳腺癌细胞后其CD44 mRNA和蛋白的表达情况,Transwell方法检测TNF-α作用后细胞迁徒能力的改变;以浓度为20 ng/mL的TNF-α处理MCF-7和MDA-MB-231后,用蛋白质印迹法检测MAPK(JNK、p38和ERK)信号通路中蛋白磷酸化水平变化,对磷酸化水平增加的蛋白用特异性抑制剂预处理后检测CD44的表达及细胞迁徙能力的改变.结果:TNF-α作用后MDA-MB-231细胞CD44s、CD44V3、CD44V6mRNA和蛋白表达水平均上调;迁徙力增加了22%～90%;TNF-α作用MDA-MB-231细胞后p38磷酸化水平升高;用p38的特异性抑制剂预处理后可以逆转CD44表达和细胞迁徒力的改变.结论:TNF-α通过p38途径对MDA-MB-231细胞CD44表达进行调控,CD44的表达可以增强肿瘤细胞的迁徙力.     

CD44基因变异体对人乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭作用

目的 探讨一种新的CD44基因变异体(CD44v17)对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响及其机制.方法 以人乳腺癌耐阿霉素细胞株(MCF-7/ADR)cDNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,将其T-A克隆后,进行测序;构建CD44v17质粒真核表达载体(pcDNA3.1-CD44v17);应用脂质体转染法将pcDNA3.1-CD44v17转染入MCF-7细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及明胶酶谱法测定转染细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达;Transwell法检测CD44v17对MCF-7细胞的侵袭力;Western blot检测胞外信号调节蛋白激酶(ERK)及磷酸化蛋白激酶(p-ERK)变化.结果 限制性内切酶消化证实,重组载体已正确克隆;DNA序列分析显示,CD44v17包含CD44基因1～4号外显子、16～17号外显子、18号外显子1～205位碱基(GeneBank NO.FJ216964).MCF-7细胞转染peDNA3.1-CD44v17后,CD44 mRNA表达量和蛋白表达率分别为0.92±0.22和(70.0±2.5)%;透明质酸(HA)处理后,MMP-2 mRNA表达量和蛋白活性分别为0.72±0.22和1.14.4-0.12,MMP-9 mRNA表达量和蛋白活性分别为0.85±0.19和1.23±0.25,细胞侵袭能力明显增加,侵袭细胞数目为352±33个/视野,而CD44单抗可以阻断这种作用;CD44单抗和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂预处理转染细胞后,显著阻断了P-ERK的表达.结论 在MCF-7/ADR细胞中发现CD44v17,并成功克隆和建立pcDNA3.1-CDd4v17;HA与CD44v17受体结合,通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2和MMP-9的表达,从而增加MCF-7细胞的侵袭力.     

HA-CD44st-TGF-β信号通路对乳腺癌MCF-7细胞HER2表达及侵袭能力的影响

目的探讨HA-CD44st-TGF-β信号通路对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞HER2表达及侵袭能力的影响。方法应用脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3.1-CD44st转染入MCF-7细胞中,以该转染细胞株(MCF-7/CD44st)为基础,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术及Western blot检测mRNA及相关蛋白的表达,电泳迁移率变动分析(EMSA)检测激活蛋白-1(AP-1)的活性,Transwell法检测HA-CD44st→TGF-β信号通路对MCF-7细胞侵袭能力的影响。结果 MCF-7细胞转染pcDNA3.1-CD44st后,CD44 mRNA和CD44蛋白的表达水平升高;透明质酸(HA)处理后,MCF-7/CD44st细胞中人表皮生长因子受体2(HER2)、转化生长因子-β(TGF-β)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表达水平明显升高,转录因子AP-1活性增强,侵袭细胞数量增多。结论 HA与CD44st受体结合后,可以通过HA-CD44st→TGF-β信号转导通路调节HER2基因表达并增强MCF-7细胞的侵袭能力。     

沉默CD44表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与侵袭的影响

目的:探索乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7中CD44分子的表达水平差异及沉默CD44对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移的影响。方法:利用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平;设计并合成CD44的siRNA片段(CD44-siRNA)转染乳腺癌细胞,利用qRT-PCR、Western blot技术检测细胞中CD44基因表达水平的变化;MTT检测MDA-MB-231细胞增殖;Transwell侵袭实验检测MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力变化。结果:CD44在侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达高于非侵袭性乳腺癌细胞MCF-7,CD44-siRNA下调了 MDA-MB-231细胞中CD44 mRNA与蛋白水平的表达,并抑制了细胞的增殖和侵袭转移能力。结论:CD44-siRNA能够下调CD44的表达,并有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖及其侵袭迁移力。     

粘附因子CD44_S、CD44_V3、CD44_V6在乳腺癌中的表达及临床意义

目的：研究粘附因子CD44s、CD44v3、CD44v6蛋白在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法：收集60例经根治性切除的乳腺癌标本，应用免疫组化S-P法检测CD44s、CD44v3、CD44v6。蛋白的表达，并分析与临床病理因素之间的相关性。结果：CD44s、CD44v3、CD44v6在乳腺癌中的阳性率分别为78．3％、75．0％、78．3％。CD44s、CD44v6的表达程度与淋巴结转移、临床分期、肿块的大小密切相关（P〈0．05）。CD44v3与乳腺癌的转移、临床分期无明显相关性。三者与患者的年龄均无明显相关性。结论：CD44s和CD44v6蛋白表达与乳腺癌转移、侵袭明显相关，而CD44v3则与之无明显相关性。     

人乳腺癌细胞RECK基因的表达及检测

目的:研究人乳腺癌细胞株RECK基因的表达,阐明RECK基因表达水平与乳腺癌细胞侵袭力的关系。方法:采用transwell法,测定HBL-100,MCF-7和MDA-MB-435S三株人乳腺(癌)细胞的体外侵袭能力,同时应用免疫细胞化学技术,Westernblotting和RT-PCR技术分别检测三株细胞株MMP-2,MMP-9和RECK基因蛋白表达水平,及RECK基因mRNA转录丰度。结果:三株细胞中,MDA-MB-435S侵袭力最高(425.20±54.09),HBL-100最低(101.00±63.88),MCF-7居中,为(239.00±91.39),三组细胞的侵袭力比较差异均有显著性(P<0.01)。RECK基因在HBL-100细胞株中蛋白表达水平最高(免疫细胞化学值:3188.24±894.86;Westernblotting值:3.32±0.25),在MDA-MB-435S细胞株中不表达,MCF-7为(免疫细胞化学值:1058.92±336.53,P<0.01;Westernblotting值:2.23±0.59,P<0.05)。且在免疫细胞化学中,RECK基因的蛋白表达与MMP-2,MMP-9的表达水平成负相关。RECK基因在HBL-100细胞株中mRNA水平最高(2.32±0.02),在MDA-MB-435S细胞株中不表达(P<0.001)。结论:RECK基因表达水平与乳腺癌细胞体外侵袭力及MMP-2,MMP-9的表达水平成明显负相关。     

TNF-ɑ调控LRG1促进乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移

目的:研究TNF-α对乳腺癌MCF-7细胞中LRG1蛋白表达的调控及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及相关分子机制。方法:MTT实验检测不同浓度TNF-α处理后MCF-7细胞活力;EdU实验、Transwell实验和划痕实验分别检测抑制LRG1表达后细胞增殖、侵袭以及迁移能力;Western blot检测细胞内MAPK信号通路中p-p38蛋白表达。结果:低浓度TNF-α处理乳腺癌MCF-7细胞,细胞活力增强;抑制LRG1表达后细胞增殖能力下降,侵袭细胞数、细胞迁移率以及p-p38蛋白表达均下降。结论:TNF-ɑ通过调控LRG1的表达促进乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移,这一过程可能通过激活p38MAPK信号通路来实现。     

CD44v3短发夹RNA对透明质酸诱导人结肠癌SW480细胞体外粘附和侵袭的抑制作用

目的:研究CD44v3的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对体外培养的人结肠癌SW480细胞CD44v3表达及透明质酸诱导的粘附侵袭行为的抑制作用。方法:设计和构建带有U6启动子的CD44v3基因特异性的shRNA干扰表达质粒,转染至SW480细胞,以RT-PCR和Western blot检测SW480细胞转染前后CD44v3表达,以平板粘附模型和Boyden小室模型检测SW480细胞转染前后粘附和侵袭能力。结果:和转染前相比,转染了RNA干扰表达质粒的SW480细胞CD44v3mRNA和蛋白表达、以及受透明质酸诱导而粘附于平板和穿过Boyden小室隔膜的细胞数皆显著减少(P<0.01)。结论:针对CD44v3的短发夹RNA能显著抑制透明质酸诱导人结肠癌SW480细胞体外粘附和侵袭行为。     

抑癌基因RSK4的表达与乳腺癌细胞体外侵袭力的相关性研究

目的:探讨RSK4 mRNA在4株乳腺癌细胞MDA-MB-231、T47D、Bcap-37、MCF-7中的表达,分析RSK4 mRNA表达情况与4组细胞侵袭力之间的关系,进而探讨RSK4的抑癌机制.方法:通过RT-PCR方法检测4组乳腺癌细胞MDA-MB-231、T47D、Bcap-37、MCF-7中RSK4 mRNA的表达情况,用Transwell小室法检测4组细胞的侵袭力、运动力,分析二者之间的关系.结果:4组乳腺癌细胞株体外侵袭力、迁移力高低顺序依次为:MDA-MB-231＞T47D＞Bcap-37＞MCF-7(P＜0.001),4组细胞两两之间比较,有显著性差异;相关性分析显示,其侵袭力与迁移力呈显著性正相关(r=0.822,P＜0.001＝.RSK4 mRNA表达水平的顺序依次为:MDA-MB-231＜T47D＜Bcap-37＜MCF-7(P＜0.001),4组细胞两两之间比较,有显著性差异.RSK4 mRNA相关表达与乳腺癌细胞体外侵袭能力呈负相关(r=-0.948,P＜0.001),RSK4 mRNA表达越高的细胞其体外侵袭能力越弱.结论:RSK4基因参与乳腺癌的发展过程,并与乳腺癌的生物学行为有关,RSK4 mRNA的表达水平在评价乳腺癌细胞体外侵袭力方面具有重要意义.     

CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞分选鉴定及其多药耐药性研究

目的:观察MACS免疫磁珠法分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性,并检测其与多药耐药的关系。方法:运用MACS免疫磁珠法从多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,流式细胞术测定分选前后CD44+CD24-/low细胞比例,微球体培养法检测分选细胞自我更新能力,流式检测CD44+CD24-/low细胞表面P-糖蛋白(P-gp)表达水平,Real-time PCR检测多药耐药相关基因MDR1表达水平。结果:MACS免疫磁珠法分选后,CD44+CD24-/low细胞比例为93.85%,其成球能力明显强于non-CD44+CD24-/low细胞亚群。MCF-7/ADR细胞株和CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞P-gp表达强度分别为101 177.10±2 171.86和114 906.70±2 560.19,P<0.05。CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞MDR1基因表达水平为MCF-7/ADR细胞株的(1.07±0.02)倍,P<0.05。结论:经MACS免疫磁珠法分选所得CD44+CD24-/low细胞亚群有更强的自我更新能力,高表达P-gp蛋白和MDR1基因可能是引起乳腺癌多药耐药的重要原因。     

CD44v3在透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭中的作用

目的:研究CD44v3在透明质酸诱导A549细胞体外粘附和侵袭中的作用。方法:设计和构建能产生针对CD44v3的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的RNA干扰质粒,转染A549细胞,以RT-PCR和Westernblot检测A549细胞转染前后CD44v3表达,以平板粘附模型和波登氏小室模型检测A549细胞转染前后粘附和侵袭能力。结果:和转染前相比,转染了RNA干扰质粒的A549细胞CD44v3mRNA和蛋白表达以及受透明质酸诱导而粘附于平板和穿过波登氏小室隔膜的细胞数皆明显减少(P<0.01)。结论:CD44v3介导了透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭行为。     

HIF-2α对乳腺癌MCF-7细胞生物学功能的影响

目的 探讨HIF-2α对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭及成瘤能力的影响。方法 利用HIF-2αORF/shRNA慢病毒颗粒分别感染乳腺癌MCF-7细胞,筛选构建MCF-7 HIF-2α上调或下调的稳定细胞株;利用Real-time PCR和Western blot方法分别检测HIF-2α mRNA和蛋白的表达水平;CCK-8方法检测细胞增殖活力;Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力变化;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果 HIF-2α shRNA质粒转染MCF-7细胞后HIF-2α的表达水平均显著下降;HIF-2α ORF质粒转染MCF-7细胞后HIF-2α的表达水平显著升高。CCK-8检测结果显示：HIF-2α上调后MCF-7细胞增殖活力增强;Transwell小室实验结果显示：HIF-2α上调后MCF-7细胞侵袭能力增强;平板克隆形成实验结果显示：HIF-2α上调后MCF-7细胞克隆形成能力增强。而HIF-2α下调MCF-7细胞具有相反趋势。结论 HIF-2α过表达能够增强MCF-7细胞增殖活力、促进肿瘤细胞侵袭和克隆形成。     

CD44v6在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其对卵巢癌细胞株侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨CD44v6(CD44 variant domain 6,CD44v6)在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其对卵巢癌细胞株SKOV3侵袭和迁移能力的影响.方法:收集东莞市人民医院妇产科2002年至2010年间手术切除的卵巢上皮性肿瘤标本185例,采用RT-PCR和EnVision-免疫组化染色技术检测卵巢上皮性肿瘤组织中CD44v6的表达.构建CD44v6表达质粒转染SKOV3细胞,分别加入不同浓度anti-CD44v6中和抗体,应用Transwell小室实验检测各组SKOV3细胞侵袭和迁移能力的变化.结果:CD44v6 mRNA和蛋白在卵巢上皮性癌组织中的表达高于卵巢良性上皮性肿瘤组织和正常卵巢组织(P＜0.05).CD44v6的表达与卵巢上皮性癌的病理组织学分级、预后相关(P＜0.05).体外实验显示,上调CD44v6的表达可以促进SKOV3细胞的迁移能力,而加入anti-CD44v6中和抗体后,可消除CD44v6对SKOV3细胞迁移的促进作用.结论:CD44v6表达上调参与卵巢上皮性肿瘤的发生、发展.     

β-榄香烯对MCF-7／ADM细胞株中乳腺癌干细胞作用的初步研究

目的探讨乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADM与阿霉素敏感细胞株MCF-7／S中乳腺癌干细胞（BCSCs）含量及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和P-糖蛋白（P-gp）表达的差异,观察中药β-榄香烯（β-ELE）对BCSCs及BCRP和P-gp表达的影响。方法 应用无血清细胞培养法培养MCF-7／ADM和MCF-7／S细胞株,形态学观察不同细胞株无血清细胞球培养的成球率,RT PCR检测两种细胞株中BCRP和P-gp的mRNA水平,流式细胞仪检测BCRP和P-gp的阳性表达率及CD44+CD24^-／low细胞比例。应用15μg/ml β-ELE作用MCF-7/ADM细胞株48h后,检测细胞成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白表达的变化。结果 与MCF-7／S细胞比较,MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp mRNA水平较高。MCF-7／ADM细胞中BCRP和P-gp蛋白的阳性表达率分别为（77.78±9.55）％和（32.33±5.12）％,CD44+CD24-／low细胞比例为（64.79±11.78）％,均高于MCF-7／S细胞的（3.97±1.51）％、（14.26±2.51）％和（18.79±3.28）％,差异均有统计学意义（P＜0.01）。β-ELE能明显抑制MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白的表达（P＜0.01）。结论 MCF-7／ADM是BCSCs相对富集的一种耐药细胞株且高表达BCRP和P gp,β-ELE能够抑制MCF-7／ADM细胞中BCSCs比例及其成球率,并降低耐药蛋白的表达。     

CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗对乳腺癌细胞miRNA表达水平的影响

目的:分析CDK4/6抑制剂联合内分泌药物对人乳腺癌细胞中相关miRNA表达水平的影响。方法:培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF-7株,使用CDK4/6抑制剂帕布昔利布和内分泌药物阿那曲唑作用于人乳腺癌细胞,MTT法检测细胞增殖情况,BD流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期情况,采用RT-PCR检测相关miRNA表达情况,Western blot 检测TNF-α、Survivin蛋白表达。结果:在药物作用12 h、24 h、48 h和72 h后的MDA-MB-231研究组、SK-BR-3研究组、MCF-7研究组细胞中miRNA-1321、miRNA-574-5p、miRNA-24-3p的表达水平均较对照组有所下降,而miRNA-1246、miRNA-494-3p、miRNA-29b-3p的表达水平有所升高;MDA-MB-231研究组、SK-BR-3研究组、MCF-7研究组细胞G0/G1期、S期的比例均较对照组细胞均有所升高,而G2/M期比例与对照组相比较均有所下降;MDA-MB-231研究组、SK-BR-3研究组、MCF-7研究组细胞中TNF-α及Survivin的表达水平均较对照组有所上升。结论:CDK4/6抑制剂联合内分泌药物可以调节人乳腺癌细胞中相关miRNA表达水平,从而抑制人乳腺癌细胞增殖。     

高与低表达RSK4基因人乳腺癌细胞株的筛选及鉴定

目的:探讨核糖体S6激酶4(RSK4)抑癌基因在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D、Bcap37和MCF-7中的表达,并筛选出高和低表达RSK4基因的乳腺癌细胞。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法从mRNA和蛋白水平检测RSK4在MDA-MB-231、T47D、Bcap-37和MCF-7 4种乳腺癌细胞株中的表达。结果:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D、Bcap37和MCF-7中均有RSK4基因表达,其中,MCF-7细胞RSK4表达水平最高,为表达量最低的MDA-MB-231细胞的2.9倍,MCF-7细胞RSK4蛋白表达水平也最高,与其他3种细胞株相比,差异有统计学意义,P<0.001。RT-PCR法和蛋白质印迹法检测结果一致,具有高度相关性,r=0.766,P<0.001。结论:人乳腺癌细胞株MCF-7为高表达RSK4基因的细胞,MDA-MB-231细胞为低表达RSK4基因的细胞,两者均可作为人乳腺癌细胞中研究RSK4基因的实验材料。     

姜黄素对乳腺癌细胞VEGF-C表达及增殖、侵袭性的影响

 目的探讨姜黄素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭性及VEGF-C表达的影响。方法MTT法,Transwell小室检测 姜黄素对MCF-7细胞增殖和侵袭性的影响;RT-PCR、Western blot方法检测姜黄素作用MCF-7细胞前后VEGF-C mRNA 及蛋白水平表达的变化。结果姜黄素能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,其IC50为37μmol/L,随浓度增高其抑制作 用增强（P＜0.05）,同时降低乳腺癌MCF-7细胞的侵袭性（P＜0.001）。不同浓度姜黄素可降低MCF-7细胞VEGF-C mRNA及蛋白水平的表达（P＜0.05）,40 μmol/L组比20 μmol/L组下降明显（P＜0.05）。结论姜黄素可以抑制乳 腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭性,其机制可能是通过下调VEGF-C的表达。     

LOXL2促进乳腺癌MCF-7细胞侵袭研究

目的:研究赖氨酰氧化酶样蛋白-2(lysyl oxidase like-2 protein,LOXL2)对乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移的影响。方法:利用脂质体法将构建好的Flag-LOXL2质粒转染到乳腺癌MCF-7细胞中,应用Western blot检测转染效率,Transwell侵袭实验检测乳腺癌MCF-7细胞的体外侵袭力,并进一步使用Western blot检测LOXL2蛋白对金属蛋白酶MMP2/MMP9表达的影响。结果:在乳腺癌MCF-7细胞中瞬时转染FlagLOXL2,LOXL2蛋白表达明显增加,并促进MCF-7细胞的侵袭能力,上调金属蛋白酶MMP2和MMP9蛋白的表达。结论:LOXL2促进MCF-7细胞的侵袭能力,并影响金属蛋白酶MMP2以及MMP9的表达。     

乳腺

大黄素对乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7／Adr的耐药逆转作用//植物相关人肿瘤抗原在乳腺癌中表达的研究//同源异型盒基因BPl在乳腺癌组织中的表达及其临床意义//乳腺癌前哨淋巴结状态与CD44v6相关研究//放射性^131I在荷乳腺癌裸鼠体内分布与显像的实验研究//乳腺增生症增殖细胞核抗原表达的定量研究     

RNAi沉默CD133基因表达对结肠癌细胞株HT-29影响的研究

目的:探讨通过RNA干扰沉默CD133基因对结肠癌细胞株HT-29的增殖和侵袭力的影响。方法:将CD133siRNA用脂质体转染入HT-29细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133mRNA的变化,蛋白质印迹法检测转染前后蛋白的表达水平,用MTT比色法和Transwell小孔实验分别检测癌细胞的增殖及侵袭力变化。结果:CD133siRNA转染成功,与正常对照组相比,转染组CD133mRNA及蛋白的表达水平均有明显的抑制,并呈现浓度时间依赖性。MTT实验证明转染组细胞随时间延长,增殖逐渐受到抑制,P<0.05。Tran-swell小孔实验中经转染处理的穿膜细胞数明显减少(P<0.05),RNA干扰降低了细胞的侵袭性。结论:CD133在HT-29癌细胞增殖及侵袭过程中起重要作用,RNA干扰可以有效抑制其CD133的表达,并能有效降低癌细胞的增殖及侵袭力。