爱普列特对原代培养大鼠输精管上皮细胞及bcl-2表达的影响

目的　探讨爱普列特对原代培养SD大鼠输精管上皮细胞及原癌基因bcl 2表达的影响。方法　应用HE染色、电镜、流式细胞术和免疫组化方法研究爱普列特对输精管上皮细胞形态改变、细胞凋亡率以及bcl 2表达的影响。结果　 0 1 μmol·L- 1 爱普列特对细胞形态无显著影响 ;0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,细胞呈核固缩、深染、碎裂、染色质边集等多种形态改变 ,电镜下可见典型的凋亡细胞特征 ;流式细胞仪分析结果显示 ,溶剂对照组细胞凋亡率为 3 42 %± 1 49% ,0 1、0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,细胞凋亡率分别为 4 66 %± 2 2 3 % ,39 0 4 %± 1 0 69%和 52 74%± 8 91 % ;免疫组化结果显示输精管上皮细胞bcl 2阳性率为 76 96 %± 9 2 5 % ,0 1、0 3和 1 0 μmol·L- 1 爱普列特作用 72h后 ,Bcl 2阳性表达的百分率分别为 63 93 %± 3 40 %、52 82 %± 8 66 %和 2 9 64 %± 8 74%。结论　 0 1 μmol·L- 1 爱普列特对大鼠输精管上皮细胞无影响 ,0 3和 1 0 μmol·L- 1 可诱导大鼠输精管上皮细胞发生凋亡 ,其作用机制可能与降低bcl 2表达有关     

曲古菌素A抑制HL-60细胞端粒酶活性及亚单位hTERT的表达并诱导凋亡

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(tri-chostatin A,TSA)抑制HL-60细胞端粒酶活性及亚单位hTERT的表达并诱导凋亡的机制。方法采用MTT法和倒置相差显微镜观察不同浓度曲古菌素A对HL-60细胞的抑制作用,流式细胞仪检测600 nmol.L-1TSA作用后的细胞凋亡情况,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性变化,RT-PCR分析端粒酶三个亚单位的mRNA表达情况。结果曲古菌素A对HL-60细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性,Annex-inV/PI双染色体法检测凋亡显示,600 nmol.L-1TSA作用48h后,细胞凋亡率为42.6%。600 nmol.L-1曲古菌素A作用12、24和48 h后,端粒酶活性分别下降为1.95±0.25、1.73±0.12和1.52±0.09。RT-PCR显示,端粒酶逆转录酶hTERT表达下降,而端粒酶RNA模板(hTR)和端粒酶相关蛋白(hTP1)表达无明显改变。结论曲古菌素A(trichosta-tin,TSA)抑制HL-60细胞端粒酶活性下降,并诱导凋亡,其机制可能与曲古菌素A下调hTERT转录水平有关。     

曲古菌素A抑制HL-60细胞端粒酶活性及hTERT的表达并诱导凋亡

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A, TSA)抑制HL-60细胞端粒酶活性及亚单位hTERT的表达并诱导凋亡的机制。方法采用MTT法和倒置相差显微镜观察不同浓度曲古菌素A对HL-60细胞的抑制作用,流式细胞仪检测600 nmol·L-1TSA作用后的细胞凋亡情况,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性变化,RT-PCR分析端粒酶三个亚单位的mRNA表达情况。结果 TSA对HL-60细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性,AnnexinV/PI双染色法检测凋亡显示,600 nmol·L-1TSA作用48 h后,细胞凋亡率为42·6%。600 nmol·L-1TSA作用12、24和48 h后,端粒酶活性分别下降到1·95 ±0·25、1·73 ±0·12和1·52 ±0·09。RT-PCR显示,端粒酶逆转录酶hTERT表达下降,而端粒酶RNA模板(hTR)和端粒酶相关蛋白(hTP1)表达无明显改变。结论 TSA抑制HL-60细胞中端粒酶活性,并诱导凋亡,其机制可能与曲古菌素A下调hTERT转录水平有关。     

迷迭香酸抗过氧化氢诱导血管平滑肌细胞凋亡作用的研究

目的探讨迷迭香酸对过氧化氢(H2O2)诱导血管平滑肌细胞凋亡的保护作用及其机制。方法流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察细胞形态学变化;MTT法检测细胞活性;Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、Fas和FasL蛋白的表达。结果经500μmol·L-1H2O2处理24h后,细胞凋亡率为34.9%±2.55%,出现核固缩、核碎裂等典型的凋亡形态学改变,所以随后实验选择500μmol·L-1H2O2为诱导血管平滑肌细胞凋亡的最佳浓度。①500μmol·L-1的H2O2处理血管平滑肌细胞24h能引起细胞活性明显降低;细胞凋亡率明显增加,达35.7%±1.33%;细胞中Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,Bcl-2/Bax蛋白比值减少,Fas和FasL蛋白表达升高。②用迷迭香酸(10、20、40μmol·L-1)预处理细胞30min,可以增加细胞活性;降低细胞凋亡率,呈浓度依赖性;细胞中Bcl-2/Bax蛋白比值升高,Fas和FasL蛋白表达降低。结论迷迭香酸能拮抗H2O2诱导血管平滑肌细胞凋亡;其作用机制可能与升高细胞中Bcl-2/Bax蛋白比值,减少Fas、FasL蛋白表达有关。     

金喜素诱导HL-60细胞凋亡依赖caspase活化

目的　探讨金喜素诱导急性白血病细胞凋亡的生化机制。方法　采用MTT法测定金喜素对HL 6 0细胞的杀伤作用 ;通过形态学、DNA凝胶电泳及AnnexinVFITC染色 ,研究金喜素对靶细胞的促凋亡活性 ;采用caspase 8、3特异性抑制剂IETD fmk、DEVD CHO ,分析金喜素介导的靶细胞凋亡与caspase活化的关系。结果　经 0 1μmol·L-1金喜素处理至 8、12及 16h时 ,HL 6 0细胞的存活率依次降至6 2 %± 12 %、、43%± 15 %及 32 %± 10 % ,低于对照 (P <0 0 5 ) ,同时 ,靶细胞逐渐出现磷脂酰丝氨酸外化 ,并产生梯状DNA及凋亡小体 ;经caspase抑制剂与金喜素联合处理12、16h时 ,HL 6 0细胞的存活率高于单用金喜素组 ,分别为77%± 14%、6 5 %± 16 % (IETD fmk组 )与 74%± 12 %、6 0 %± 11% (DEVD CHO组 ) ,同时 ,靶细胞的梯状DNA与凋亡小体的诱生也明显受抑。结论　金喜素对HL 6 0细胞具有较强的促凋亡作用 ,该过程可能依赖caspase 8、caspase 3的活化     

腺苷通过内质网应激途径诱导HepG2细胞凋亡的研究

目的探讨腺苷(ADO)诱导人类肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制。方法将不同浓度的ADO(0～6mmol.L-1)作用于HepG2细胞36h,采用MTT法测定ADO抑制细胞增殖效应。将HepG2细胞暴露于不同浓度的ADO(0～4mmol.L-1)作用36h或2mmol.L-1ADO作用不同时间(0～48h),观察细胞核的形态学改变;观察2mmol.L-1ADO处理12h和24h后细胞周期的变化;观察2mmol.L-1ADO作用前后Caspase-3和CHOP的亚细胞定位的变化;用West-ernblot检测不同浓度ADO作用后HepG2细胞Caspase-3,Caspase-4,CHOP,JNK的蛋白表达变化。结果ADO对HepG2细胞生长有明显的抑制作用,不同浓度ADO(0.5,1,2,4,6mmol.L-1)处理HepG2细胞36h后,与对照组相比,相对细胞存活数分别下降13.48%±0.12%,27.92%±0.25%,35.21%±0.42%,51.46%±0.24%,71.42%±0.58%,呈现剂量依赖性;不同浓度ADO作用36h或2mmol.L-1ADO作用不同时间(0～48h)后,随着ADO浓度的增加或作用时间的延长,HepG2细胞核发生典型核固缩、核碎裂、核分解等凋亡形态学改变;2mmol.L-1ADO作用12h或24h后,细胞周期分析出现亚二倍体峰,提示细胞发生凋亡,对照组、ADD处理12h及24h组细胞凋亡率分别为1.55%±0.12%、10.96%±0.07%和21.04%±0.26%;2mmol.L-1ADO诱导Caspase-3和CHOP表达增加,并从胞质易位进入胞核内;随着ADO浓度的升高,Caspase-4,Caspase-3,CHOP的表达均升高,均呈现剂量依赖性;而JNK的表达则没有变化。结论腺苷诱导HepG2细胞凋亡与内质网应激途径有关。     

蛋白酪氨酸激酶抑制剂对脑血管平滑肌细胞Ca~(2+)池操纵性Ca~(2+)内流的影响

目的　研究蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂对牛脑血管平滑肌细胞 (CSMC)Ca2 + 池操纵性Ca2 + 内流的影响。方法　采用培养的CSMC ,在生物荧光双波长影像分析系统用Fura 2 /Am荧光探针测定单个细胞内游离Ca2 + 浓度。结果　 (1)蛋白酪氨酸激酶抑制剂 (genistein ,2 5 ,5 ,10 μmol·L-1)能浓度依赖性降低内皮素 1(ET 1,10 -7mol·L-1)刺激引起的CSMCCa2 + 内流 ,抑制率分别为5 6%± 2 .9%、2 5 6%± 3 9%、48 9%± 3 7% ;蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂 (vanadate ,2 ,4,8μmol·L-1)能浓度依赖性升高CPA刺激引起的CSMCCa2 + 内流 ,增加比率分别为8 2 %± 3 9%、18 8%± 4 9%、46 6%± 6 9% ;(2 ) genistein(2 5 ,5 ,10 μmol·L-1)能浓度依赖性降低ATP(10 μmol·L-1)刺激引起的CSMCCa2 + 内流 ,抑制率分别为 6 7%±2 6%、2 4 6%± 6 5 %、5 1 3 %± 6 9% ;vanadate (2 ,4,8μmol·L-1)能浓度依赖性升高ATP刺激引起的CSMCCa2 +内流 ,增加比率分别为 4 8%± 2 0 %、2 8 5 %± 4 6%、49 6%± 3 3 % ;(3 ) genistein (2 5 ,5 ,10 μmol·L-1)能浓度依赖性降低环匹阿尼酸 (Cyclopiazonicacid ,CPA ,10 μmol·L-1)刺激引起的CSMCCa2 + 内流 ,抑制率分别为 6 5 %± 3 0 %、2 2 5 %± 5 2 %、     

拓扑替康对肺癌细胞生长周期的影响及诱导凋亡的作用机制

目的　研究拓扑替康 (topotecan ,TPT)对人肺癌SPC A 1细胞生长周期的影响及诱导凋亡的作用 ,并探讨Caspase 3及Bcl 2在此过程中的作用。 方法　体外培养肺癌细胞 ,分为对照组 (未处理组 )、TPT(5、10、15和 2 0mg·L-1)组、半胱天冬酶 3 (Caspase 3 )特异性拮抗剂Ac DEVD CHO +TPT组 ,加药后培养 2 4h ,TUNEL法观察肺癌细胞凋亡形态学特征 ;流式细胞仪观察细胞生长周期变化并检测凋亡率和肺癌细胞Bcl 2蛋白的表达。结果　TPT (5mg·L-1)处理细胞 2 4h ,流式细胞仪未检测到凋亡峰 ,随着TPT浓度增大 ,凋亡率显著增高 ,各浓度组间差异具有显著性 (P<0 0 1) ;TUNEL及透射电镜检测到典型的凋亡细胞形态学特征 ,凋亡细胞DNA呈梯状电泳 ;流式细胞仪检测到细胞周期发生改变 ,G1期细胞较对照组增多 (P <0 0 1) ,S期细胞减少 (P <0 0 1) ;TPT(2 0mg·L-1)处理细胞后肺癌细胞凋亡率为 11 9%± 2 6% ,高于对照组细胞 (P <0 0 1) ;Bcl 2蛋白阳性表达细胞率为 7 9%± 1 2 % ,较对照组 (44 7%±7 1% )降低 (P <0 0 1) ;Ac EDVD CHO (5 0 μmol·L-1)和TPT(2 0mg·L-1)共同处理细胞 2 4h其凋亡率为 6 1%±1 8% ,较单纯TPT作用组降低 (P <0 0 1) ;Bcl 2蛋白阳性表达率为 3 3 4%± 5 2 % ,较单纯TPT作用组增高     

2,3-吲哚醌对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡和端粒酶表达的影响

目的研究2,3-吲哚醌(2,3-dioxoindoline,ISA)对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡和端粒酶表达的影响。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞,将SH-SY5Y细胞随机分为对照组和ISA不同浓度(0、100、200、400μmol·L-1)处理组,采用Hochest33258荧光染色和琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡抑制基因bcl-2、凋亡基因bax蛋白表达的变化;采用RT-PCR检测加药后SH-SY5Y bcl-2,bax及端粒酶逆转录酶(hTERT) mRNA表达水平的变化。结果100、200、400μmol·L-1ISA处理SH-SY5Y细胞48h后,荧光染色可观察到明显的细胞凋亡的核浓缩、核碎裂形态;bcl-2 mRNA及蛋白表达逐渐减少(P<0.05),各组间比较差别有统计学意义;bax mR-NA及蛋白表达水平未见变化(P>0.05);hTERT mRNA表达水平降低(P<0.05),各组间差异比较有统计学意义;200、400μmol·L-1ISA处理SH-SY5Y细胞48h,琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯带。结论2,3-吲哚醌可能通过下调bcl-2和hTERT表达诱导SH-SY5Y细胞凋亡,并在一定浓度范围内呈浓度依赖关系。     

长春瑞滨诱导人肺癌Calu-3细胞凋亡及机制

目的　观察长春瑞滨 (VRB)诱导人肺癌Calu 3细胞凋亡时Bcl 2和半胱天冬酶 3的表达有无变化。方法　以不同浓度的VRB( 2 0 ,40和 60 μmol·L-1)作用于体外培养的人肺癌Calu 3细胞 2 4h后 ,TUNEL法和吖啶橙染色法观察肺癌细胞凋亡形态学特征 ;流式细胞仪检测肺癌细胞凋亡率和肺癌细胞Bcl 2蛋白表达水平 ;以半胱天冬酶 3荧光分析检测试剂盒测定肺癌细胞半胱天冬酶 3活性。结果　VRB( 2 0 ,40和60 μmol·L-1)处理细胞 2 4h ,TUNEL法及吖啶橙染色均观察到典型的凋亡细胞形态学特征。流式细胞仪检测VRB处理的肺癌细胞凋亡率分别为 ( 3 .1±0 .6) % ,( 7.8± 1 .2 ) %和( 1 9.6± 4.3 ) % ,较对照组 (凋亡率为 0 )显著增高且呈剂量依赖性 (P <0 .0 1 ) ;Bcl 2蛋白阳性表达细胞率分别为 ( 3 7.6±6.9) % ,( 2 5 .4±6.2 ) %和( 8.4±2 .5 ) % ,较对照组 ( 4 8.3±7.1 ) %显著降低且呈剂量依赖性 (P <0 .0 5 ) ;肺癌细胞半胱天冬酶 3活性分别为 ( 3 3 2± 1 6) ,( 4 1 7± 1 1 )和 ( 63 1± 2 7)μmol·L-1·h-1,较对照组 ( 1 95±1 2 ) μmol·L-1·h-1显著增高且呈剂量依赖性(P <0 .0 1 )。结论　VRB可以诱导肺癌细胞凋亡 ,抑制Bcl 2表达及增强半胱天冬酶 3活性     

辛伐他汀对K562细胞端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶表达的影响

目的探讨辛伐他汀治疗慢性粒细胞白血病可能的作用机制。方法辛伐他汀10和20μmol.L-1与K562细胞作用48或72 h后,用流式细胞术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡百分率;提取细胞端粒酶,用PCR-ELISA检测端粒酶活性;实时荧光定量PCR检测人端粒酶逆转录酶(hTERT),c-myc和bcl2-mRNA表达。结果辛伐他汀10和20μmo.lL-1与K562细胞作用48 h后,细胞凋亡率分别为(6.24±0.18)%和(9.41±0.22)%,与对照组(1.88±0.14)%比较明显增加;作用72 h后细胞凋亡率分别为(12.41±0.32)%和(19.08±0.26)%,与对照组(4.20±0.19)%比较明显增加。辛伐他汀10和20μmo.lL-1与K562细胞作用48或72 h后,端粒酶活性,hTERT,c-myc和bcl-2 mRNA表达明显低于对照组。结论辛伐他汀可使K562细胞端粒酶活性降低,其机制可能与下调hTERT mRNA表达有关。     

NO前药JS-K对HL-60细胞增殖、分化的影响

目的观察一氧化氮前体药物JS-K对白血病HL-60细胞增殖分化的影响。方法体外传代培养HL-60细胞,用不同浓度的JS-K处理HL-60细胞24～96h,MTT法测定细胞活力,观察细胞生长情况。流式细胞仪检测细胞分化的表面分子变化。结果按对数浓度差0.5的间距加入JS-K0.3～10μmol.L-1,处理24～96h,随着JS-K浓度的增加和作用时间的延长,MTT法检测所得各组的光密度值呈剂量依赖性和时间依赖性降低,细胞生长抑制率增高,JS-K作用96h抑制HL-60细胞增殖的IC50为(1.025±0.23)μmol.L-1。JS-K3和10μmol.L-1处理96h后,显微镜下可见细胞数量明显减少,细胞皱缩、细胞碎片明显增加。JS-K3μmol.L-1作用96h后,表达CD11b阳性和CD14阳性细胞的百分率明显提高。结论JS-K可明显抑制HL-60细胞的增殖,促进HL-60细胞分化。     

hTERT反义寡核苷酸增强DDP介导细胞凋亡作用

目的研究端粒酶催化亚基(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对HeLa细胞端粒酶活性的抑制及其对顺铂(DDP)诱导细胞凋亡的影响。方法用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)定量端粒酶重复扩增法(TRAP)检测细胞的端粒酶活性。观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞仪对细胞凋亡进行定量分析。结果ASODN作用后,细胞的端粒酶活性明显降低,且这种作用具有明显的时间和剂量依赖性。0.05、0.1μmol.L-1和0.2μmol.L-1的硫代ASODN治疗后,HeLa细胞的端粒酶活性分别下降了21.8%、52.4%和71.1%。0.2μmol.L-1的硫代ASODN作用HeLa24、48h和72h后,细胞的端粒酶活性分别下降了12.48%、38.27%和71.10%。细胞转染0.2μmol.L-1浓度的ASODN24h后再与1.5、3.0mg.L-1浓度的顺铂联合作用,吖啶橙染色可见典型的凋亡形态,并且凋亡百分率(50.35%、29.67%)分别与RSODN联合顺铂组(19.33%、12.13%)、单用顺铂组(19.67%、11.38%)比较,差异有显著性(P<0.05)。结论hTERT反义寡核苷酸能有效抑制其端粒酶活性,并且促进DDP诱导HeLa细胞凋亡。     

虎杖苷对VSMC内钙信号的调节机制初探

目的　观察虎杖苷对大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)内游离钙浓度的变化 ,以探讨虎杖苷对血管平滑肌细胞的调节机制。方法　用荧光染料Fluo 3 AM标记细胞 ,在粘附式细胞仪上测定细胞内游离钙的变化。结果　给予虎杖苷 5min后 ,VSMC内游离钙浓度升高。当虎杖苷加入前 10min用河豚毒素和优降糖分别预处理后 ,其VSMC内游离钙都不再明显升高 ;而给予普萘洛尔、甲氰咪胍及亚甲蓝分别预处理时 ,细胞内钙浓度反而升得更高 ,与单纯虎杖苷作用相比差异都有显著性。结论　虎杖苷可增加细胞内游离钙浓度 ,其作用可能与钠、钾通道开放有关 ,并且受 β肾上腺素能受体、H2 受体系统及鸟苷酸环化酶系统的反向调节。     

酪氨酸激酶抑制剂对cyclopiazoni cacid引起的大鼠主动脉血管环收缩效应的影响

目的　探讨酪氨酸激酶在Ca2 +池操纵性Ca2 +内流中的作用。方法　记录大鼠胸主动脉环收缩反应。结果　①不同剂量酪氨酸激酶抑制剂 genistein (1～ 10 0 μmol·L-1)和tyrphostin 2 5 (Tyr 2 5 ,1～ 30 μmol·L-1)均以浓度依赖性抑制cyclopiazonicacid (CPA)引起的平滑肌收缩平台期。Tyr 2 5的最大作用浓度为 10 μmol·L-1,抑制率为 42 %±11%。② 10 μmol·L-1Tyr 2 5和 1μmol·L-1nifedipine(Nif)对CPA引起电压依赖性Ca2 +通道 (VDCC)开放过程的抑制作用存在部分交叉。③ 1μmol·L-1Nif预处理阻断VDCC作用后 ,10 μmol·L-1Tyr 2 5只能部分阻断CPA引起的Ca2 +池操纵性Ca2 +通道 (SOCC)开放过程 ,再加入 6 0 μmol·L-1SK&F96 36 5可完全阻断SOCC的开放过程。结论　CPA引起平滑肌的收缩过程中 ,蛋白质酪氨酸激酶参与了开启VDCC和SOCC的信号转导过程