竞争性定量PCR检测恶性血液病造血干细胞移植术后克隆性TCRVγI-Jγ基因重排

目的 :为提高恶性血液病患者微小残留病 (MRD)检测的临床意义。方法 :构建竞争性定量聚合酶链反应 (PCR)检测技术并定量分析 3 1例恶性血液病患者 (包括 12例急性淋巴细胞白血病 ,10例急性非淋巴细胞白血病 ,6例非霍奇金淋巴瘤和 3例慢性粒细胞白血病 )造血干细胞移植术后TCRVγI Jγ基因重排。结果 :建立定量PCR方法的灵敏度为 10 -5水平 ;3 1例恶性血液病造血干细胞移植术后 1个月MRD的水平为 (3 16± 2 74)× 10 -5,移植后 1个月MRD水平显著低于移植前 [(4 2 1± 3 2 7)× 10 -5] (P <0 0 2 5 ) ;2 2例自体造血干细胞移植术后MRD为(3 47± 2 91)× 10 -5水平 ,显著高于 9例异基因造血干细胞移植术后 [(2 63± 2 2 1)× 10 -5] (P <0 0 5 ) ;MRD >40 0×10 -5的 13例病人中 2年内复发率为 5 3 8% (7/13 ) ,而MRD <40 0× 10 -5的 18例病人中仅有 2例 (11 1% )出现复发。MRD >40 0× 10 -5患者 2年内的复发率显著高于MRD <40 0× 10 -5患者 (P <0 0 1)。结论 :所构建竞争性定量PCR技术简便、快速、灵敏 ;定量检测恶性血液病造血干细胞移植术后MRD水平有利于预后预测。     

急性淋巴系白血病微小残留病的动态监测

本研究旨在建立免疫球蛋白重链基因重排的实时定量PCR(RQ-PCR)检测方法,并探讨其在急性淋巴系白血病(ALL)微小残留病(MRD)动态监测中的应用价值。采用多重PCR筛选初诊ALL患者的IgH基因单克隆重排,PCR产物测序并进行序列比对,据其连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)前向引物,联合下游保守JH引物和保守JH探针,用Taqman探针法RQ-PCR监测ALL患者治疗过程中各时间点的MRD水平,分析其敏感性和特异性。结果表明,在51例ALL患者中鉴定出21例单克隆IgH重排,其中有条件定量的为15例,标准曲线的斜率在-3.1～-3.9,相关系数均>0.98,敏感性在10-4-10-5,仅1例敏感性为10-3,定量范围多在10-4以下,背景的非特异性扩增均在低水平,不影响定量。7例MRD水平在10-3以下的患者一直持续缓解,8例MRD水平>10-3,复发率较高。结论:RQ-PCR方法定量IgH基因单克隆重排用于监测ALL患者的MRD水平,具有敏感性高、特异性强、定量结果可靠的优点。IgH重排水平与ALL患者预后高度相关。     

实时定量PCR检测IgH基因重排在成人B系急性淋巴细胞白血病微量残留病监测中的意义

目的 应用实时定量PCR(RQ-PCR)方法 检测患者的免疫球蛋白重链(IgH)基因重排,探讨其在成人B系急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的微量残留病(MRD)动态监测中的意义.方法 15例B系ALL患者的初诊DNA标本经PCR扩增莺排的IgH基因,克隆产物经基因测序、序列比对后,根据每例患者的克隆特异性序列信息,利用软件设计15条等位基因特异性寡核苷酸(ASO)引物,作为RQ-PCR检测的上游引物,合成通用的JH下游引物和TaqMan探针,监测患者随访标本MRD靶分子.7例Ph+患者同时用RQ-PCR检测bcr-abl融合基因转录本.结果 使用ASO引物RQ-PCR法扩增15例患者IgH重排靶基因的敏感性为10-3～10-5,荧光背景信号未显示或较低.动态监测表明:高危组患者诱导完全缓解(CR)后体内MRD水平明显高于标危组患者,诱导CR后MRD>10-3的患者复发率(71.4%)高于MRD≤10-3的患者(12.5%),MRD>10-3的患者生存时间短.另外,Ph+患者bcr-abl融合基因转录本的对数级变化趋势与IgH重排靶基因水平的动态变化一致.结论 使用ASO引物RQ-PCR方法 检测IgH基因重排,具有敏感性高、特异性强、结果 可靠等优点,可对肿瘤克隆进行准确定量.B系ALL患者体内IgH基因重排水平与临床治疗反应和疾病预后密切相关,可用于患者病情的随访监测.     

应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病

本研究旨在应用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD),采用B系ALL18对引物、T系ALL8对引物进行PCR反应扩增Ig/TCR基因重排,以Ig/TCR基因重排作为追踪的分子标记,应用SYBR Green I染料法对儿童ALL-MRD水平进行定量。研究结果表明:9例B-ALL患儿中有8例重排,找到患儿重排标记(marker)的机率为88.8%;并对诱导化疗后(第33天)骨髓MRD检测发现,其MRD水平明显下降。结论:本研究证实Ig/TCR基因重排可作为检测儿童ALL MRD标记,SYBR green I实时荧光定量PCR是一种可靠的、相对敏感的、并且比较容易的作为常规检测。     

实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因的临床应用研究

目的 利用PML-RARα融合基因作为标志物,应用实时荧光定量PCR技术,监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)患者体内病毒的状态,探讨预测APL复发风险的方法.方法 利用本实验室建立的定量检测APL患者PML-RARα融合基因的方法,对25例处于初诊、完全缓解(complete remission,CR)、复发等不同阶段的APL患者进行了PML-RARα融合基因的定量检测,并对其中6例患者的MRD状态进行了动态监测.结果 应用荧光定量PCR技术分析患者初诊、CR和复发状态的PML-RARα基因对数值(lg)水平,结果 显示有统计学意义(x2=6.847,P＜0.05);随访期患者的PML-RARα对数值(lg)水平变化较大:初诊时较高(-0.61±0.79),CR时下降(-1.31±0.62),复发时又出现上升(-0.57±0.44),提示若该患者在CR时的对数值呈现上升趋势,患者复发的机率大.结论 应用实时荧光定量(RQ)-PCR技术定量检测PML-RARα融合基因,对监测APL患者MRD状态具有临床适用性,随访期的MRD动态追踪监测具有预后价值.     

T细胞受体基因VγI-Jγ重排检测在血液病中的临床意义

目的本研究采用PCR联合单链构象多态性技术（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析检测TCRVγI-Jγ基因重排在常见血液病的中的表达，结合临床资料初步探讨TCRVγI-Jγ基因重排在常见血液病的中的表达差异和临床意义。方法应用PCR对115例血液病的骨髓进行TCRVγI-Jγ基因重排检测，阳性者行SSCP分析。结果（1）TCRVγI-Jγ基因重排在急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、急性非淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减小性紫癜、免疫相关性血细胞减少症和系统性红斑狼疮的阳性率分别为77．78％、71．43％、21．62％、33．33％、77，78％、66．67％、50，00％和100％。（2）急性淋巴细胞白血病部分缓解、完全缓解患者与初治患者积分有显著差异（P值分别为0．013、0．02）。在SSCP中，TCRVγI-Jγ基因重排在不同血液病中表达不同，恶性肿瘤患者表现为单克隆带，有优势寡亚克隆带．非恶性肿瘤患者表现为无优势寡亚克隆带，多克隆带．两者差异显著（P〈0．01）。结论（1）TCRVγI-Jγ基因重排检测对淋巴系统恶性肿瘤的诊断有辅助作用。（2）急性非淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征也存在TCRVγI-Jγ基因重排。（3）PCR—SSCP检测TCRVγI-Jγ基因重排对良、恶性血液病的鉴别有一定意义。     

miRNA-326及N-ras基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的研究

目的探讨儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者骨髓中miRNA-326的表达及其临床意义。研究N-ras基因在儿童ALL微小残留病(MRD)中的表达,以期为儿童ALL的复发提供生物学检测标志。方法本研究选取35例儿童ALL和35例非白血病儿童作为对照组,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测miRNA-326在儿童ALL中相对表达量,使用单链构象多态性PCR(PCR-SSCP)检测N-ras基因在治疗1年后的微小残留病(MRD)中的变化。结果miRNA-326在儿童ALL中的相对表达量(2.22±0.72)较对照组(6.35±1.23)明显下降;SSCP的电泳结果显示MRD组患者N-ras基因的电泳速度较对照组快,基因突变率为44.44%。结论miRNA-326和N-ras基因的检测可作为儿童ALL的诊断及复发生物学标志,也可为白血病的耐药性监测和治疗提供新的靶点。     

T细胞受体基因VγⅠ—Jγ重排检测在血液病中的临床意义

目的本研究采用PCR联合单链构象多态性技术(single strand conformation polymorphism,SS-CP)分析检测TCRVγⅠ—Jγ基因重排在常见血液病的中的表达,结合临床资料初步探讨TCRVγⅠ—Jγ基因重排在常见血液病的中的表达差异和临床意义。方法应用PCR对115例血液病的骨髓进行TCRVγⅠ—Jγ基因重排检测,阳性者行SSCP分析。结果⑴TCRVγⅠ-Jγ基因重排在急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、急性非淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减小性紫癜、免疫相关性血细胞减少症和系统性红斑狼疮的阳性率分别为77.78%、71.43%、21.62%、33.33%、77.78%、66.67%、50.00%和100%。⑵急性淋巴细胞白血病部分缓解、完全缓解患者与初治患者积分有显著差异(P值分别为0.013、0.02)。在SSCP中,TCRVγⅠ-Jγ基因重排在不同血液病中表达不同,恶性肿瘤患者表现为单克隆带/有优势寡亚克隆带,非恶性肿瘤患者表现为无优势寡亚克隆带/多克隆带,两者差异显著(P<0.01)。结论(1)TCRVγⅠ-Jγ基因重排检测对淋巴系统恶性肿...     

多重PCR法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病患者克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因重排

目的 应用多莺PCR方法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的克隆性免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排,为实时定量RT-PCR(RQ-PCR)法监测ALL患者体内的微量残留病(MRD)奠定基础.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和(或)TCR检测方法,设计96条不同的PCR引物,分成14个混合管,通过多重PCR,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRB、TCRG、TCRD克隆性基因重排.结果 在22例成人B系ALL患者中,Ig克隆性重排检出率为96%,其中IgH为86%,IgK为14%.在18例成人T系ALL患者中,TCR克隆性重排检出率为100%,其中TCRB为83%,TCRG为78%,TCRD为39%.两个及两个以上克隆性标志物的检出率在B和T系ALL中分别为91%(22例中20例)和89%(18例中16例).结论 BIOMED-2协作组设计的14管多重PCR引物和方法,几乎可检测到淋巴细胞白血病患者体内所有占优势的克隆性T、B细胞增殖群体,方法简便、可靠、覆盖面广,适用于成人ALL患者基因重排检测和MRD监测.     

急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测及其临床意义

急性淋巴细胞白血病(ALL)完全缓解率已明显提高,缓解期体内残留病灶(MRD)是导致复发而成为影响患者长期生存的主要因素。动态、定量监测ALL缓解期MDR水平具有独立的预后价值,有利于个体化治疗。本文复习了有关ALLMRD检测技术的进展,其中PCR检测白血病特异的DNA/RNA序列,如融合基因和IgH、TCR基因重排,敏感性10~(-4)～10~(-6);流式细胞术分析白血病细胞免疫表型敏感性10~(-4)～10~(-5)。MRD与预后的相关性得到一致肯定,但究竟何时何水平MRD临床价值最大尚需进一步研究确定。     

实时定量PCR监测多发性骨髓瘤患者自体造血干细胞移植后微小残留病

为了探讨应用实时定量PCR方法在监测多发性骨髓瘤患者造血干细胞移植后微小残留病 (minimalresid ualdisease ,MRD)中的作用 ,利用SYBRGreenⅠ荧光染料 ,采用实时定量PCR方法 ,以IgH为标志 ,对 8例多发性骨髓瘤和 1例Waldenstr m巨球蛋白血症患者自体外周血干细胞移植 (autologousperipheralbloodstemcelltrans plantation ,APBSCT)前后的IgH(immunoglobulinheavychain ,IgH)基因重排进行定量分析。结果发现 ,IgH基因重排拷贝数在APBSCT前后分别为 3 10 8± 10 43 ,594± 660 ,两者差异有显著性 (P <0 .0 5) ,与患者骨髓浆细胞比值和外周血M蛋白量成正相关 (r =0 .86,P <0 .0 5) ,并对 1例复发患者进行连续检测 ,结果与临床相符。结论 :实时定量PCR方法对IgH基因重排定量分析 ,可以作为判断多发性骨髓瘤治疗疗效的一种检测方法 ,并对患者的预后判断也有意义     

儿童急性淋巴细胞白血病微量残留病变检测的意义

急性淋巴细胞白血病(ALL)微量残留病变(MRD)的检测可以确定亚临床水平的疾患。以IgH基因第三互补决定区(CDR-Ⅲ)重排作为克隆特异的基因标记,应用聚合酶链反应(PCR)技术研究MRD,检测水平达到10~4～10~5正常骨髓细胞中1个白血病细胞,超过光学显微镜形态学观察量值的2～3倍。作者对14例复发与缓解的ALL患儿MRD作回顾性比较研究。14例ALL受试患者诊断时年龄1.0～20岁     

PCR检测急性淋巴细胞白血病微小残留病38例临床分析

微小残留病(Minimal residual disease,MRD)是指白血病患者诱导化疗完全缓解后,体内残留微量白血病细胞的状态.MRD是白血病复发的根源,因此检测MRD对白血病判断预后、预防复发及个体化治疗都有重要意义.作者应用PCR检测了38例急性淋巴细胞白血病(ALL)的IgH和TCRγ基因重排,现报道如下.     

流式细胞术动态监测急性白血病完全缓解后微小残留病与预后的关系

本研究探讨多参数流式细胞术(FCM)动态监测急性白血病(AL)完全缓解(CR)后微小残留病(MRD)与预后的关系。选择2010年10月至2012年5月我院血液科收治的58例AL患者,其中45例为急性髓细胞白血病(AML)患者和13例为急性淋巴细胞白血病(ALL)患者,定期用FCM检测患者骨髓MRD,同时检测骨髓细胞形态学的变化,追踪至复发或随访截止日期。平均随访9个月(3-21个月)得出完全缓解患者MRD平均水平,并对CR后不同时间点MRD水平在评估AL患者预后中的价值进行分析和总结。定义MRD≥1%为阳性,否则为阴性。结果表明:45例AML患者,测得CR后MRD最大值9.57%,最小值0.01%,平均值0.67%;13例ALL患者,测得CR后MRD最大值7.9%,最小值0.0016%,平均值0.99%;共测得44份AL诱导缓解后的骨髓MRD水平,MRD(+)组复发率53.3%(8/15),MRD(-)组复发率10.3%(3/29),MRD(+)组复发率高于MRD(-)组(χ2=7.58,P=0.006);共测得58份AL巩固治疗1个疗程后的骨髓MRD水平,MRD(+)组复发率62.5%(5/8),MRD(-)组复发率16.0%(8/50),MRD(+)组复发率高于MRD(-)组(χ2=6.11,P=0.013)。结论:多参数流式细胞术检测急性白血病CR后MRD差异较大,10-6-10-2,不能作为评价完全缓解的单一指标。诱导缓解后及巩固治疗1个疗程后MRD≥1%时复发率高,MRD可以作为预后评价的敏感指标。     

荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建

目的：构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线，为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础。方法：对TCR VγI-Jγ基因进行序列分析，利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针。提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA，经PCR扩增，产物纯化后与pMD 18-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒。结果：重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长，表明TCR VγI-Jγ基因已成功克隆。以10^0～10^-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增，Ct值分别为21．08、24．34、27．53、30．58和33．25。统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系，回归系数为0．998。结论：所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好，准确可靠，利于统一标准。     

荧光实时定量PCR在检测CML患者BCR-ABL融合基因中的应用

目的:探讨荧光实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者BCR-ABL融合基因的可行性.方法:取10例CML患者(CML组)及3名正常体检者(对照组)的外周血,应用荧光实时定量PCR检测BCR-ABL融合基因,并与巢式PCR结果比较.结果:CML组10例巢式PCR均为( ),其中3例为( )、7例为( )/(-),对照组3名均为(--).CML组荧光实时定量PCR呈阳性6例.巢式PCR( )、( )/(-)和(--)的3组中用荧光实时定量PCR测定的BCR-ABL融合基因量依次减少.结论:荧光实时定量PCR可简便地检测BCR-ABL融合基因,结果可靠,且较巢式PCR更直观,具有较高临床应用价值.     

小细胞肺癌患者血浆循环DNA定量检测和完整性分析

目的定量检测小细胞肺癌患者血浆循环DNA并进行完整性分析。方法收集60例肺癌患者(病例组)、40例健康者(对照组)样本,采用实时荧光定量PCR,以管家基因GAPDH为目的基因定量检测血浆DNA水平;以肌动蛋白基因β-actin为目的基因(长片段543bp,短片度230bp)分析完整性。应用SPSS19.0统计统计进行数据分析。结果病例组患者血浆DNA水平[(3.105×10~5±0.923×10~5)copies/μL]高于对照组[(1.522×10~5±3.241×10~4)copies/μL]。病例组患者血浆DNA完整度指数(0.208 2±0.132 8)明显高于对照组(0.077 96±0.038 6),差异均有统计学意义(P0.01)。结论小细胞肺癌患者血浆循环DNA水平和完整度均高于健康者。     

急性淋巴细胞白血病TCR/IgH基因重排的联合检测及临床意义

目的探讨T细胞受体γ（T　cell　receptor．γ，TCRγ）、T细胞受体δ（T cell receptor δ，TCRδ）、免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain H，IgH）基因重排的联合检测方法及其在监测急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL）微小残留病（Minimal Residual Disease，MRD）中的临床意义。方法应用PCR／SSP的方法对104例急性淋巴细胞白血病患者（83例儿童、21例成人）进行TCRγ、TCRδ、IgH三种基因重排的联合检测，并通过动态监测来了解它们与临床MPD的关系。结果三种基因重排联合检测在ALL患者的检出率较高（儿童前B-ALL为89．2％，T-ALL为94．4％；成人PreB-ALL为84．6％，T-ALL为87．5％），远高于单一基因重排的检出率；联合检测持续阳性患者的复发率远高与阴性患者（Χ^2=9．07，P〈0．01）。结论TCRγ、TCRγ、IgH基因重排的联合检测方法简便、敏感性高，对于急性淋巴细胞白血病的诊断以及MRD的监测具有非常重要的临床意义。     

血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义

目的检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者外周血血浆游离DNA免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体γ(TCRγ)基因克隆性重排,并探讨其在监测微小残留病变(MRD)中的临床意义。方法提取63例NHL患者血浆游离DNA并以Globin基因确定其存在,通过PCR方法检测IgH(VH FR3-JH)和TCRγ(Vγ-Jγ)克隆性基因重排,与病理组织学检查进行比较。并随访患者以监测和检测MRD。结果 63例中有49例[30例B细胞NHL(B-NHL)和19例T细胞NHL(T-NHL)]初诊、难治或复发的患者血浆游离DNA提取成功。30例确诊的B-NHL患者中IgH基因单克隆重排阳性27例(90%),19例确诊的T-NHL患者中TCRγ基因单克隆重排阳性14例(74%);其病理活检标本基因重排结果分别为87%和74%(P0.05)。另14例(9例B-NHL,5例T-NHL)临床缓解患者中,仅1例(B-NHL)提取出血浆游离DNA并检测到IgH基因单克隆重排。随访治疗缓解的患者共56例,其中24例患者血浆游离DNA基因重排持续阴性,2年存活率达83%;27例患者血浆游离DNA基因重排缓解时呈阴性随后转阳,5例患者缓解后始终能检测到血浆游离DNA基因重排,其2年存活率分别为26%和20%(P0.05)。结论 NHL患者血浆中可以检测出肿瘤源性的血浆游离DNA;NHL患者血浆游离DNA IgH、TCRγ基因重排的检测简单、方便,与病理活检标本检测具有相同的临床意义。在MRD的监测中,利用血浆游离DNA检测单克隆性重排具有一定的早期预测复发的作用。     

垂体瘤转化基因在急性淋巴细胞白血病患者中表达的研究

本研究旨在探索垂体瘤转化基因(pituitary tumor-transforming gene,PTTG)在急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia,ALL)患者中的表达及其与ALL发病机理的关系,同时探讨PTTG在Ph1染色体阳性和阴性ALL中的表达是否存在差异性。采用实时荧光定量PCR方法检测28例ALL患者及28例正常对照骨髓中PT-TG的表达水平。结果表明:ALL患者PTTG的表达水平(1.9428E5±1.8372E5)明显高于正常对照组(4.5766E3±1.1817E3)(P<0.05),一个周期诱导缓解治疗后达完全缓解(complete remission,CR)患者中PTTG的初始表达水平低于未缓解(non-complete remission,non-CR)患者;Ph1染色体阳性ALL(Ph1+ALL)患者中PTTG的初始表达水平高于Ph1染色体阴性ALL(Ph1-ALL)患者。结论:PTTG的过度表达可能和ALL的发生发展有关,可能与Ph1染色体阳性ALL的发生关系更加密切,这为ALL的发病机制及其基因靶向治疗的研究提供了新的思路。