日本因吸虫各期虫体的酶联免疫电转移印迹分析及抗原定位研究

本文采用酶联免疫电转移印迹技术（ＥＩＴＢ）分析、比较日本血吸虫不同发育时期虫体特定的组分蛋白分子、雌虫、雄虫和虫卵抗原分别与相应的雌、雄虫和虫卵免疫血清反应呈现１７、２０和８条蛋白带，这三种抗原与其它不同时期虫体免疫血清反应，三者间及彼此间均出现交叉反应，而雌、雄虫和虫卵抗原与其它寄生虫感染血清作用没发现有叉及反应。应用间接荧光抗体试验（ＩＦＡ）和免疫酶染色试验（ＩＥＳ）对日本血吸虫抗的进行定位研     

中国大陆日本血吸虫品系的研究 XI.酶联免疫电转移印迹的分析

本文报告安徽、湖北、广西、云南和四川5地日本血吸虫成虫抗原与安徽、湖北、云南、四川4地钉螺的抗血清进行酶联免疫电转移印迹(EITB)分析的结果。安徽与湖北两地日本血吸虫EITB图谱基本相似。云南和四川的日本血吸虫EITB图谱虽相近,但在84kDa处云南雌虫呈现明显条带而四川雌虫则无此反应带。广西的日本血吸虫与云南的虫体一样,雌虫在84kDa处亦呈现明显的条带。广西的雄虫在与安徽的钉螺抗血清反应后在>130kDa处有两条主要条带,这与安徽地区雄虫的一致且较之更为浓染致密,而云南、四川两地雄虫的则未见此条带。根据上述结果并结合以前有关大陆各地钉螺对日本血吸虫的易感性结果,进行了初步的分析和讨论。     

日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原的初步分析

采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ技术分析了日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原（ＳＩＥＡ），并与可溶性成熟卵抗原（ＳＥＡ）进行比较，二者主要蛋白区带存在明显差异，同时，ＥＬＩＢ结果表明，ＳＩＥＡ中感染血清和免疫血清所识别的６５ｋＤａ、６２ｋＤａ、５０ｋＤａ、２８ｋＤａ和和２６ｋＤａ等抗原组分不出现于ＳＥＡ，推测其在ＳＩＥＡ诱导宿主产生抗雌虫生殖及抗卵胚发育免疫应答方面起作用。     

不同地区日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫反应性的比较

应用酶联免疫印迹技术检测我国不同地区日本血吸虫雌、主雌雄合抑虫体中溶性抗原，结果上述三者与相应感染动物血清及慢性日本血吸虫病人血清反应，分别显示出４－２０、６－３４和３－２９条反应带；一地日本血吸虫ＡＷＡ与各地感染鼠血清反应呈明显相似，而不同地区虫体ＡＷＡ应各感染鼠血清反应性之间则显示出很大的差异性。与不同感染宿主血清的反应带及其分子量互不相同；各地雌、雄虫之间也不同，一般雄虫较雌虫反应带多且强；     

血吸虫感染新模型小鼠血清IgG与抗原的免疫印迹分析

目的 在建立一种日本血吸虫感染小鼠伴随免疫新模型的基础上,比较新模型小鼠与血吸虫感染常规模型小鼠血清IgG识别日本血吸虫抗原的差异。方法 每只BALB/c小鼠经腹部皮肤人工感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴20d后,按300mg/(kg·d)腹腔注射酚酶抑制剂-丙烯基硫脲,同时设立未用药感染对照组,至感染后第42天剖杀2组小鼠,从小鼠眼球取血制备血清,经western-blot观察血清IgG对日本血吸虫SWAP及SEA的识别差异。结果 western-blot显示,2种模型小鼠血清IgG对SWAP的识别存在差异,明显的区别在于常规模型组可见1条90kDa大小的清晰主带,而新模型组则表现为数条弱带。SEA与常规模型组小鼠血清。IgG呈强阳性反应,而与新模型组小鼠血清IgG反应微弱。结论 2种模型小鼠体内血吸虫诱导产生的抗体存在差异,这些差异可能是导致新模型小鼠抗再感染力增强的体液免疫因素之一。     

中国与日本不同地域品系日本血吸虫蛋白组分的SDS-PAGE和EITB分析

目的： 补充观察我国浙江、江西、台湾省和日本山梨的日本血吸虫成虫的蛋白组分, 以及上述４ 地和安徽、湖北、四川、云南省血吸虫与广西省钉螺和日本钉螺抗血清的反应性。方法： 采用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ＳＤＳ－ＰＡＧＥ） 和酶联免疫电转移印迹 （ＥＩＴＢ） 分析。结果与结论： 浙江、江西、台湾省和日本的血吸虫隔离群雄虫及雌虫抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后, 以考马斯亮蓝染色结果分别可见７～１７ 条（江西省和日本的血吸虫雄虫条带显色很淡） 及１～６ 条显色带;银染结果分别可见１４～２３条及４～１９ 条（台湾省的血吸虫雌虫仅见１条极淡的）显色带。台湾省血吸虫雄虫与浙江省血吸虫雄虫谱型相似, 但在８１ ｋＤａ以上组分有所不同, 江西省血吸虫雄虫５４ｋＤａ 条带明显, 日本的血吸虫雄虫不仅条带少, 谱型也与浙江、江西及台湾省的血吸虫各异。ＥＩＴＢ结果： 所试血吸虫成虫与广西省钉螺和日本的钉螺抗血清均产生反应, 证明存在交叉反应抗原组分。所试血吸虫成虫与广西省钉螺和日本的钉螺间存在共同抗原组分。     

不同地区日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫反应性的比较

应用酶联免疫印迹技术检测我国不同地区日本血吸虫雌、雄及雌雄合抱虫体可溶性抗原(AWA),结果上述三者与相应感染动物血清及慢性日本血吸虫病人血清反应,分别显示出4～20、6～34和3～29条反应带;一地日本血吸虫AWA与各地感染鼠血清反应呈明显相似,而不同地区虫体AWA与各感染鼠血清反应性之间则显示出大的差异性;与不同感染宿主血清(感染鼠、兔和病人血清)的反应带及其分子量互不相同;各地雌、雄虫之间也不同,一般雄虫较雌虫反应带多且强;不同宿主(兔和鼠)体内获取的江苏虫体AWA的反应性也存有差异。提示不同地区日本血吸虫成虫可溶性抗原的血清反应性存在着地区及性别间差异。     

酶联免疫印迹术（EITB）在小鼠日本血吸虫感染早期诊断中的应用

为探讨日本血吸虫感染的早期诊断方法,本文应用酶联免疫印迹术(EITB)检测感染鼠血清的循环抗原。所用抗体由日本血吸虫成虫和虫卵的五种抗原(SEA、UEA、TA、CY、MC)免疫动物获得。SDS—PAGE和EITB显示这些抗原与华支睾吸虫、肺吸虫和蛔虫等交叉反应不明显。其中CY抗原的31KD条带是血吸虫特有。用EITB监测小鼠感染日本血吸虫后6周内各期和用吡喹酮治疗后2周的循环抗原有如下变化:UEA抗体显示的187KD抗原多肽在4周出现并逐渐加深,治疗后变淡;与TA和CY抗血清反应的40KD抗原分别在感染后3天～4周和3天～2周出现;抗MC显示的15.3KD在6周出现,治疗后消失;与成虫表膜相关的20、15、12.8KD仅在治疗后出现。对这些特异的抗原性多肽动态观察似可为早期诊断日本血吸虫病和考核疗效提供参考。     

单克隆抗体—酶联免疫电转移印斑技术用于黑热病患者循环抗原的检测

本文报告用单克隆抗体-酶联免疫电转移印斑技术对25例黑热病患者。20例健康人,以及黑热病治愈者,疫区正常人,血吸虫病、结核病及疟疾患者各10例血清进行循环抗原检测,结果证明:黑热病患者血清出现四条反应带,其表现分子量为130kD、100kD、50kD和25kD;而其他被检血清在130kD、100kD及25kD处均不出现反应带,仅有少数血清在50kD处有交叉条带。此法敏感、特异,具有检测黑热病循环抗原的实用价值。     

磁微粒分离酶联免疫法在日本血吸虫抗体检测中的应用

目的探讨磁微粒分离酶联免疫法(MPAIA)用于检测日本血吸虫病血清抗体的效果。方法用MPAIA测定日本血吸虫病血清中特异性抗体。结果用MPAIA检测384例非血吸虫病流行区阴性血清,均为阴性;检测61例急性血吸虫病人血清、788例慢性血吸虫病人血清、32例晚期血吸虫病人血清其阳性率分别为100%、94.2%、90.6%;检测14例并殖吸虫病人、13例囊虫病人、9例旋毛虫病人血清,均未发现交叉反应。结论MPAIA检测日本血吸虫血清抗体有较高的灵敏度和特异度,可用于日本血吸虫病的临床诊断和现场疫情监测,该方法具有广阔应用前景。     

诱导型一氧化氮合酶在不同虫期日本血吸虫虫体中的表达

目的　了解日本血吸虫不同虫期诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达及其在体内的分布。　方法　收集日本血吸虫成虫制成冰冻切片,将含胞蚴、尾蚴的感染性钉螺和含成熟虫卵的小鼠肝脏制成石蜡切片,用免疫荧光法检测成虫、胞蚴、尾蚴以及毛蚴中的iNOS,并观察该酶在各期虫体内的分布;用蛋白质印迹法(Westernblotting)检测成虫匀浆中的可溶性蛋白是否具抗iNOS多抗的可溶性蛋白。　结果　组织切片免疫荧光结果显示,特异性黄绿色荧光主要分布于成虫紧贴皮层下组织处、毛蚴的表层和腺体中以及胞蚴和尾蚴的体表;Westernblotting结果表明,成虫蛋白中出现1条明显的被抗iNOS抗体识别的特异性反应条带,其相对分子质量(Mr)为210000。　结论　日本血吸虫成虫及不同虫期幼虫均有类iNOS的蛋白表达。     

日本血吸虫环卵沉淀物中抗原的鉴定

分析日本血吸虫环卵沉淀物中的抗原成分,为获得高敏感性、特异性且具有疗效考核价值的血吸虫病诊断抗原提供科学依据。制备日本血吸虫改良干卵,将其与重感染日本血吸虫病兔血清ＩｇＧ进行环卵沉淀反应,用震荡结合尼龙绢筛过滤法分离环卵沉淀物,以０．２ＭＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）缓冲液解离环卵沉淀物,对解离产物进行免疫印迹分析。改良干卵和重感染日本血吸虫的病兔血清ＩｇＧ发生环卵沉淀反应,反应的环沉率达８０．０     

日本血吸虫与曼氏血吸虫的致病差异

曼氏血吸虫和日本血吸虫是全球范围内两种主要的肠道血吸虫病病原体,所致基本病理均为虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化,但两者在产卵方式以及肉芽肿的组成细胞等方面均存在明显差异。 目前,我国的血吸虫病研究主要以日本血吸虫病为对象,国外主要以曼氏血吸虫病为对象,而介绍两种血吸虫致病差异的综述较少。 为更好地理解两种血吸虫的致病差异,本文从血吸虫的基因组和进化路径、幼虫迁移、成虫寄生位置及产卵方式、局部组织病理、肉芽肿的形成机制以及肉芽肿的细胞组成等 6 个方面对日本血吸虫和曼氏血吸虫的致病差异进行了综述。     

量化检测日本血吸虫循环抗原的初步研究

目的探索量化检测日本血吸虫循环抗原的方法。方法用AWA-PcAb/MG2双抗体夹心ELISA(S-ELISA)检测SEA-TCA抗原,并根据测得的OD490值和相应抗原浓度计算回归方程式,再用该法和fSjc26GST-PcAb双抗体夹心ELISA方法检测急慢性日本血吸虫病人的血清循环抗原。并初步应用于检测流行区和传播阻断地区的人群血清循环抗原。结果AWA-PcAb/MG2双抗体夹心ELISA测得SEA-TCA浓度(y)与OD490值(x)呈明显的正相关(r=0.981,y=128.08x-46.95);血清循环抗原的平均含量,急性血吸虫病人(206.27±36.62 ng/ml)显著高于慢性血吸虫病人(122.88±75.13 ng/ml)。两组双抗体S-ELISA检测急性血吸虫病人循环抗原的阳性率均为100%(34/34),慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率则分别为87.50%(70/80)和78.57%(63/80),特异性分别为90.74%(98/108)和92.59%(100/108)。用以上两法对流行区和传播阻断地区的人群血清进行循环抗原检测,其阳性率分别为34.52%(87/252)和9.72%(49/504),具有显著性差异。结论两组双抗体S-ELISA用于检测日本血吸虫循环抗原均有较好的效果,其中AWA-PcAb/MG2双抗体夹心ELISA能量化检测日本血吸虫循环抗原。     

运用生物信息技术分析日本血吸虫Z88基因cDNA序列

目的通过基因序列分析，寻找日本血吸虫新的基因，为日本血吸虫病防治筛选新的候选疫苗抗原。方法从已构建的日本血吸虫成虫cDNA文库中挑取已知克隆(克隆号为Z88)，测定其全长cDNA序列后，再运用生物信息学方法以及相关软件对此基因进行分析。结果通过测定以及分析可知此基因的cDNA序列为1303bp，编码349个氨基酸，为DnaJ-相似蛋白，与果蝇、鲐、人及鼠的DnaJ-相似蛋白有一定同源性。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论Z88基因为日本血吸虫DnaJ-相似蛋白基因，可能参与蛋白折叠、装配和运输等功能。     

日本血吸虫不同阶段抗原免疫抑制过敏性哮喘小鼠气道炎症的实验观察

目的 观察日本血吸虫不同生活史阶段抗原对过敏性哮喘小鼠气道炎症的影响。方法 雌性BALB/c小鼠48只,随机均分8组,A组为健康对照组;B组为哮喘模型组,以鸡卵白蛋白（OVA）抗原腹腔注射致敏,OVA滴鼻诱发哮喘;C、D和E组小鼠分别用可溶性虫卵抗原（SEA）、可溶性成虫抗原（SWA）和童虫抗原（SSA）经腹部皮下免疫,共4次,每次间隔1周,末次免疫后1周再按B组方法诱发哮喘;F、G和H组分别用SEA、SWA和SSA免疫接种小鼠（免疫方法及剂量分别同C、D、E组）,末次免疫后1周用等量生理盐水代替OVA处理小鼠,不诱发哮喘。诱发哮喘后48 h剖杀各组小鼠,观察各组小鼠肺组织的病理变化和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的相关细胞成分及细胞因子的变化。 结果 A组小鼠气道肺组织无明显炎症变化;B组小鼠气道肺组织可见明显的炎性细胞,尤其是嗜酸粒细胞的浸润;C、D和E组小鼠气道肺组织炎症明显轻于B组小鼠。B组小鼠BALF中白细胞总数［（98.4±16.1）×10⁴/ml］、嗜酸粒细胞百分数[（17.6±4.3）×10⁴/ml]和白细胞介素-5(IL-5)水平［（197.9±36.5）pg/ml］均明显高于A组［分别为（8.2±1.1）×10⁴/ml、（0.02±0.01）×10⁴/ml和（12.3±7.4）pg/ml］,而IL-10和γ干扰素(IFN-γ)水平明显低于A组。C、D和E组小鼠BALF中白细胞总数、嗜酸粒细胞百分数和IL-5水平均明显低于B组,而IL-10,IFN-γ水平则明显高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 日本血吸虫不同抗原免疫后能有效调节过敏性哮喘小鼠的细胞因子平衡,同时对哮喘小鼠嗜酸粒细胞在肺组织中的浸润及肺组织炎症都有一定的抑制作用。     

日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16的克隆与表达

目的　克隆和表达日本血吸虫新的分泌蛋白Sjsp16的编码基因。　 方法　根据EST测序的结果设计引物 ,从含有Sjsp16基因的cDNA克隆中扩增得到该编码基因 ,亚克隆入原核表达载体 pET2 8中表达 ,然后用生物信息学的方法对蛋白结构功能进行预测。　结果　成功克隆和表达了日本血吸虫分泌蛋白基因Sjsp16,生物信息学分析提示该基因编码蛋白的N端带有一个信号肽序列 ,是一个分泌蛋白 ,含有一个ML功能结构域 ,具有 4种潜在的功能作用位点 ,即 1个N 糖基化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 3个肉豆蔻酰化位点。　结论　Sjsp16基因编码蛋白为具有脂质识别和结合功能的分泌蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病药物靶点或疫苗候选分子。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的特性及抗原表位的分析

目的　分析rSj338重组蛋白的氨基酸序列 ,了解该蛋白的特性 ,预测其抗原表位。方法　制备Sj338基因片段并重组入测序载体pGEM T ,对其核苷酸序列进行测定 ,分别以DNASIS和GOLDKEY软件对序列资料进行分析 ,并在BLAST网上进行同源性分析。结果　rSj338基因长 487bp ,含 1个由 45 9bp组成的开放阅读框 ,编码一由 15 3个氨基酸残基组成的多肽 ,分子量为 17 6kDa,氨基酸同源性分析发现 ,重组蛋白与人的线粒体传入受体亚单位氨基酸同源性为 46 % ,与褐鼠线粒体膜受体的前体氨基酸同源性为 44 % ,预测该蛋白的抗原表位位置为2 6～ 32、37～ 46、131～ 136和 147～ 15 1氨基酸肽段。结论　rSj338重组蛋白可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白     

日本血吸虫复合B细胞表位抗原的制备和鉴定

目的 制备日本血吸虫复合B细胞表位抗原，并对其抗原性进行鉴定。 方法 用生物信息学软件（BioSun）预测已报告的日本血吸虫Sj22.6、Sj14?鄄3?鄄3、Sj26等3个B细胞表位片段的基因序列（P2、P6、P7），用随机顺序法连接3个片段，克隆入高效融合表达载体pET-32c（+）中，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，经酶切及基因测序鉴定重组子。阳性克隆经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物用Ni^2＋螯合柱纯化，用蛋白质印迹（Western blotting）分析该表达产物的抗原性。 结果 3个目的表位基因片段按P2-P6-P7和P6-P2-P7的顺序连接为2条复合表位片段（表位间由6个氨基酸组成的柔性接头连接），成功克隆入pET-32c（+）。其重组子均可表达相对分子质量（Mr）约20 400的融合蛋白。亲和层析纯化的融合蛋白经十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带（Mr 20 400），Western blotting分析显示，这2条重组复合表位蛋白均可被日本血吸虫病患者血清识别，而不与健康者血清反应。 结论 获得2个具有日本血吸虫病诊断潜在价值的复合B细胞表位抗原。