豚鼠钙调蛋白2基因编码区及3′端非编码区序列克隆

目的克隆豚鼠钙调蛋白2(Ca M2)基因编码区及3′端非编码区,为豚鼠Ca M基因功能等研究提供遗传学信息。方法以豚鼠心肌组织作为实验材料提取RNA,通过RT-PCR和3′-RACE PCR的方法扩增Ca M2的编码区和3′端非编码区序列,应用基因工程技术插入克隆载体构建重组质粒后基因测序及分析。结果克隆出豚鼠Ca M2基因编码区450 bp序列和3′端非编码区660 bp序列。分析编码区序列所编码的氨基酸序列与其他种属其他亚型完全一致。而3′端非编码区与其他亚型的同源性较低。结论成功获得了豚鼠Ca M2基因编码区和3′端非编码区序列,为进一步研究Ca M2的基因功能及其在相关疾病中的作用奠定基础。     

起始密码下游序列与16srRNA3′端序列的匹配性对基因表达效率的影响

目的 :研究起始密码下游序列与 16srRNA 3′端 +146 9——— +1482局部序列间的匹配关系对基因表达效率的影响。方法 :我们一方面对人IL_2、人IL_8、人IL_6 ,人GM_CSF、人G_CSF、人IL_1ra、人IL_9等全长cDNA序列及 5′末端局部序列与 16srRNA 3′端 +146 9——— +1482序列进行匹配性进行分析 ,寻找序列匹配性与表达效率间的关系 ;另一方面 ,对人IL_6、人GM_CSFcDNA 5′端序列进行沉默突变 ,增强其与 16srRNA 3′端 +146 9——— +1482序列间的匹配性 ,并克隆入pKpL4表达型质粒载体 ,通过大肠杆菌进行表达 ,实验验证序列匹配性与基因表达效率的关系。结果 :分析发现起始密码下游局部序列与 16srRNA 3′端 +146 9——— +1482核酸匹配性越好 ,则目的蛋白表达效率越高 ;目的基因编码区内与 16srRNA 3′ +146 9——— +1482间的最大匹配区域越靠近 5′末端 ,目的蛋白表达效率越高。通过对人IL_6、人GM_CSFcDNA 5′末端序列进行沉默突变 ,改善其与 16srRNA 3′端 +146 9——— +1482序列的匹配性后 ,目的蛋白的表达量均呈不同程度地提高。结论 :提高起始密码下游序列与 16srRNA 3′端 +146 9——— +1482局部序列间的匹配性 ,可增强目的基因的表达效率。     

肺癌转移相关基因ABCE1的筛选

①目的 从肺癌转移相关的3个候选基因片段(C1、L1、L2)中筛选出目的基因片段,并克隆其基因全长.②方法 3种肺癌细胞株及4种肺癌手术标本总RNA的提取;运用RT-PCR技术中,对肺癌转移相关基因C1、L1、L2片段进行验证,钓取目的片段;运用RACE(cDNA末端快速扩增)技术克隆出其基因全长序列,并登录Genbank,进行序列比对,确定克隆的基因性质.③结果 在NCI-H446细胞和95-D细胞中未得到C1和L1基因目的大小片段,只有L2基因目的片段;从2种细胞株中均得到L2基因的3′端部分未知序列1169 bp;从NCI-H446细胞中得到L2基因的5′端未知序列178 bp,从95-D细胞中145bp.3′、L2基因序列与已知的ABCE1基因序列同源性100%.④结论 从已知的3个片段C1、L1、L2中,成功筛选与肺癌转移相关基因L2即ABCE1基因.     

轮状病毒VP7基因修饰载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的 :对轮状病毒 SA1 1株 VP7基因进行修饰 ,使其表达后锚定于宿主细胞膜表面 ,同时构建一个可使目的蛋白分泌或跨膜表达的载体。方法 :用 PCR的方法把 VP7天然信号肽替换为流感病毒血凝素信号肽。然后 ,在基因下游添加流感病毒血凝素跨膜区编码序列 ,从而构建在宿主细胞表面表达的轮状病毒 SA1 1 VP7基因。利用遗传密码简并性在信号肽序列 3′端和跨膜区 5′端分别引入 Sty 和 Eco RV限制性内切酶识别位点 ,从而实现分泌 /跨膜基因修饰载体的构建。把野生型和跨膜型 VP7基因分别克隆入 pc DNA3哺乳动物细胞表达载体 ,转染 Hela细胞 ,得到稳定表达两种 VP7基因的细胞系。对外源基因在细胞染色体上的整合情况以及基因表达情况进行检测。结果 :酶切鉴定和 DNA序列分析表明膜锚定型 VP7基因和分泌 /跨膜基因修饰载体的构建正确。PCR和免疫荧光实验证明 ,VP7基因已经整合进入宿主细胞染色体 ,野生型和膜锚定型 VP7基因表达后分别定位于宿主细胞质和细胞膜。结论 :成功地构建了可在细胞膜表面锚定表达的 VP7基因 ,为进一步研究轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础。新型分泌 /跨膜基因修饰载体为研究蛋白合成后加工和提高其免疫原性提供了有力的工具。     

人轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析

目的：初步了解重症腹泻轮状病毒株NSP4基因特征及变异情况，方法：在2002年100例秋冬季腹泻患儿轮状病毒分子流行特征的研究中，确诊为轮状病毒腹泻的10例患儿的粪便标本。用PCR方法对其NSP4基因进行测定，并挑选出一株重症腹泻轮状病毒毒株(简称02′K1)。采用一步法RT-PCR对其NSP4基因进行扩增获得NSP4 cDNA，利用银染测序方法对所扩增获得NSP4 cDNA进行测定，采用Winegene231核酸分析软件对02′K1株NSP4核苷酸序列进行翻译，同时利用Omiga生物软件对02′K1株、ST3株(人轮状病毒G4血清型)及代表NSP4四个主要基因型的之一的Wa株(简称Wa-1株)、Wa-a株、Wa-v株的核苷酸和氨基酸序列进行比较，分析其同源性及02′K1株的NSP4氨基酸变异位点，结果：(1)经一步法RT-PCR扩增获得的NSP4 cDNA约725bp，NSP4基因全长686个核苷酸，含有一个开放读码框架，编码一个由175个氨基酸组成的蛋白；(2)02′K1株与ST3株、Wa-1株、Wa-a株、Wa-v株的核苷酸和氨基酸同源性均达90％以上；(3)与ST3比较，02′K1株的NSP4氨基酸序列有14个位点发生了变异。即aa16、aa26、aa60、aa72、aa76、aa124、aa135、aa140、aa141、aa145、aa146、aa161、aa162、aa169，结论：(1)02′K1株的NSP4基因型属于Wa组；(2)02′K1株的NSP4氨基酸序列有14个位点发生了变异。     

MSX1基因在物种间的变异性研究

目的 对人MSX1基因的cDNA序列和氨基酸序列进行综合分析,为其致病性突变位点的研究和非综合征性唇腭裂的病因学研究奠定理论基础. 方法 从国际生化技术信息中心(NCBI)的Genbank数据库中调取人MSX1基因和全氨基酸序列,利用序列综合分析软件DNAMAN、GENtle对人MSX1的基因序列和氨基酸序列进行综合分析. 结果 人MSX1基因全长1 944 bp,其编码区在247-1140之间,共894 bp,其蛋白质序列为298个氨基酸.MSX1蛋白的疏水性氨基酸残基分布于N端、中间14个区段和C端远区,MSX1蛋白的亲水性区域分布于分子中间10个区段.人与黑猩猩的MSX1基因100%相同,与其他物种的MSX1基因的一致性最大为90%(犬).同时,发现8个物种的MSX1基因中有452个碱基序列在不同物种间完全一致(占50.56%),另有91个碱基基本一致(占10.18%).但是,不同物种间MSX1基因的氨基酸序列差异很大,8个物种间没有完全一致的氨基酸残基,基本一致的氨基酸残基只有11个(占3.74%). 结论 MSX1基因或蛋白在不同物种间的变异较大,突变位点较多,探求MSX1基因/蛋白位点突变与非综合征性唇腭裂的关系需重新审视和认识.     

微RNA与阿尔茨海默病的关系及应用价值

微RNA(micro RNA,miRNA)是长度为20～24个核苷酸(nt)的内源性非编码蛋白RNA基因。在动植物细胞中,通过与靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3′端非编码序列(3′-uncoding region,3′-UTR)相互作用,在翻译后水平抑制靶基因活性或降解靶基因来调节其表达的活性。miRNA表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA在中枢神经系统广泛分布,对神经发育、分化、成熟发挥重要调节作用[1]。     

应用RACE技术获取小鼠乳腺癌转移相关基因 G15γ5′端未知序列(论著摘要)

G15γ5′是本组以往用mRNA差异显示法从γ干扰素预处理的小鼠腺癌细胞系MA891中分离出的cDNA片段,推测其代表的基因可能与肿瘤转移有关.为进一步研究其功能,采用cDNA未端快速扩增技术(RACE),以获取该片段5′端未知序列.用IFN-γ(200 U/ml)处理MA891细胞48 h,提取总RNA并用DNaseI纯化.根据G15γ5′端序列,设计合成3个基因特异性引物GSP1,GSP2和GSP3.以GSP1为引物合成cDNA第1链,用末端转移酶在cDNA第1链的3′端进行同聚物加尾,对加尾后的cDNA先后用GSP2和GSP3与锚定引物进行初级及巢式PCR扩增,最终得到一552 bp的扩增产物并将其克隆至pCRTM Ⅱ载体,经Northern印迹分析及序列分析证实,所得片段确实是G15γ5′的5′端延续.     

恶性疟原虫FCC1/HN株MSA1抗原Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ保守区基因的亚克隆及序列分析

P190系恶性疟原虫裂殖子表面抗原1(MSA1),是很有希望的疟疾疫苗候选抗原。根据该基因现有序列,我们设计了3对引物,在5′端引物和3′端引物前分别设有BamHI和XbaI酶切位点序列,在每个酶切位点前设有保护性碱基GC,用固相亚磷酸酰胺法在ABI391型DNA自动合成仪上自动合成引物,合成的引物氨解、冷冻干燥后经HPLC纯化。采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增了恶性疤原虫FCC1/HN株P190第3、4保守区和第2保守区部分序列的基因片段,分别定名为P190CR3、P190CR4和P190CR2-2,各片段均连接到pUC18载体上,用双脱氧末端终止法测定了克隆片段的DNA序列,结果表明这3个区域的DNA序列与MAD20(采自巴布亚-新几内亚)、Wellcome(采自西非)、K1(采自泰国)及CAMP(采自马尔加什)株恶性疟原虫P190相应区域比较也是高度保守的。在该基因第2保守区核苷酸第81位(相当于MAD20的732位)发生了碱基替换,由T替代了C,但未发生氨基酸的改变。     

miR-203的转录调控及在肿瘤中的研究进展

miR-203基因位于14q32.33,由蛋白编码基因间DNA序列编码.家族中有miR-203a和miR-203b(又名miR-3545)两个成员.根据NCBI数据库显示,miR-203基因正义链经转录、剪切后产生一条110个核苷酸的茎环结构的pre-miR-203a,Dicer进一步剪切下,产生miR-203a-5p和miR-203a-3p(成熟链),后者被引导进入RNA诱导沉默复合体(RISC),与靶基因mRNA 3′端非编码区(3′-UTR)碱基互补配对,在转录后水平调控靶基因的翻译;其反义链编码产生miR-203b.     

含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒的构建和表达

目的：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,构建并表达含轮状病毒NSP3基因耐RNA酶的病毒样颗粒,并探讨其稳定性。方法：设计含PvuⅠ和KpnⅠ酶切位点的上、下游引物,扩增1 049 bp轮状病毒NSP3基因片段,并将包装位点-5位的U替换为C,提高与MS2衣壳蛋白作用的亲和力。用PvuⅠ和KpnⅠ双酶切扩增的目的基因和pACYC-MS2表达载体,连接获得重组载体pACYC-MS2-NSP3,转化TOP10感受态细胞后用PCR验证阳性克隆并测序。阳性克隆转化BL21(DE3)细胞后表达含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,用超声破碎、纯化获得表达产物,鉴定并讨论其稳定性。结果：成功构建pACYC-MS2-NSP3表达载体并获得了含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,其可耐受DNA酶和RNA酶的降解,并在-20 ℃、4 ℃、室温25 ℃下10 d保持稳定。 结论：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,可以成功构建耐RNA酶的病毒样颗粒,本研究所构建的病毒样颗粒具有耐RNA酶的特性和良好的稳定性,为轮状病毒实时荧光定量逆转录 PCR的标准品和质控品的研究提供了一个可行的方法。     

天津市2018—2020年人轮状病毒株VP7、VP4和NSP4基因特征

目的 对天津流行的人A组轮状病毒VP7、VP4和NSP4基因进行分型和序列特征分析。方法 收集2018—2020年天津市急性腹泻A组轮状病毒（Rotavirus group A, RVA）阳性病例的粪便标本,提取核酸,进行RT-PCR扩增VP7、VP4和NSP4基因片段全长并进行测序和进化树分析。结果 本次研究所有RVA均属于G9P[8]基因型,进化树分析其VP7和VP4基因分别属于G9-VI和P[8]-3亚型。分析NSP4基因片段发现19株为E1型,12株为E2型。TJ株VP7、VP4、NSP4与疫苗株和参考株比对发现在关键位点有氨基酸替代现象。31个TJ-VP7氨基酸序列与 Rotavac G9 和Rotasiil G9 VP7相比,各有4个和3个替换位点。31例天津株VP8*核苷酸序列与Rotarix P[8]-1和RotaTeq相比,各有6个和3个氨基酸差异。天津株VP5*核苷酸与两种疫苗相比,仅在RotaTeq的5-1区I388L这一处发现氨基酸位点变异情况,其余11个氨基酸位点高度保守;而与Rotarix5-1到5-5区氨基酸序列完全一致。TJ E1株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI和ASII区分别有2和3个氨基酸位点发生变异;TJ E2株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI-ASIV分别有3、8、2和5个氨基酸位点发生替换。2018—2020年在天津地区检测到19株G9P[8]-E1型RVA,12株G9P[8]-E2型RVA,这是首次在天津发现G9P[8]-E2重组基因型。结论 与同基因型疫苗株和参考株相比,位于TJ株VP7、VP4和NSP4抗原位点的改变对于疫苗保护效力的影响还需进一步研究。需要对轮状病毒分子变异和重组现象进行持续监测,不只是单一监测G/P分型情况,要考虑多基因片段共同分析和全基因组测序,以便及时追踪和掌握轮状病毒的重组和变异情况。     

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析

目的 探讨轮状病毒非结构蛋白(NSP4)基因的特征及变异情况.方法 在2007年和2008年昆明医学院第一附属医院儿科住院的96例秋冬季腹泻患儿中,随机选取轮状病毒阳性的12例(其中2007年6例,2008年6例)患儿粪便标本,采用RT-PCR扩增NSP4基因,并进行测序,测序结果 用DNAassist软件对核苷酸序列进行翻译,并用Clustal-mp软件与Genbank Datebase中的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hochi)、3株动物RV(EW、OSU、SAll)和中国北京、上海、广州的流行株的NSP4序列进行分析比较.结果 (1)选取的2007年6份和2008年6份样本均可以扩增出NSP4的全长片段,测序表明:2007年6份样本中有5株属于Wa株,1株属于KUN株;2008年6份样本中也有5株属于Wa株,1株属于KUN株.10株Wa株与来自GenBank Database的4株人RV(wa、KUN、AU-1、Hochi)和3株动物RV(EW、OSU、SAll)同源性分别为96.3%、85.3%、84.7%、95.1%和57.7%、92%、82.8%,与中国北京、上海、广州的流行株同源性均在95%以上;2株KUN株与以上来自GenBank Database的标准株的同源性分别为85.3%、98.2%、82.8%、85.9%、60.1%、85.3%、94.3%,和其他地区流行株的同源性为85%左右; (2)以Wa株为参考,10株Wa株的NSP4基因变异发生在第34位氨基酸,第76位氨基酸,第141位氨基酸,第145位氨基酸,第161位氨基酸和第169位氨基酸;以KUN株为参考,2株KUN株的NSP4基因变异仅在第87位氨基酸和第140位氨基酸.结论 2007年和2008年昆明地区流行株NSP4基因为Wa组和KUN组,以Wa组为主.     

肝癌细胞株Bel-7402中侧群细胞的分离和致瘤能力

【目的】 分选肝癌Bel-7402细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性?【方法】 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将Bel-7402细胞分为SP细胞和非侧群(NSP) 细胞2亚群?实验分组:SP组与NSP组?细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;RT-PCR法检测SP细胞和NSP细胞的CD133?三磷酸腺苷结合盒转动蛋白G2(ABCG2)表达;流式细胞术分析细胞凋亡率;无血清培养法检测SP细胞及NSP细胞成球率;非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性?【结果】 Bel-7402细胞中分选出的SP细胞比例为(2.4 ± 0.0)%?生长曲线表明SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P < 0.05)?SP?NSP细胞的克隆形成率分别为(20.5 ± 2.6)%?(5.1 ± 0.9)%,两者差异明显(P < 0.05)?SP细胞ABCG2 mRNA和CD133 mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的3.03倍(P < 0.01)和1.98倍(P < 0.01)?SP细胞凋亡率为(0.89 ± 0.23)%,低于NSP细胞 (P < 0.05)?在无血清培养基中,SP细胞成球率为(14.1 ± 1.9)%,高于NSP细胞(P < 0.05)?1 × 103?104?105数量的SP细胞形成皮下移植瘤(P > 0.05,P < 0.05,P < 0.05),而1 × 105 NSP细胞则还不能成瘤?【结论】 肝癌 Bel-7402细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞?     

新生儿轮状病毒无症状感染的聚合酶链反应研究

选用与 A 组人类轮状病毒(Human Romvirus,HRV)编码 VP7蛋白的第9基因(或8)两个保守序列互补的引物,建立检测 A 组 HRV dsRNA 的聚合酶链反应技术,扩增产物片段约342bp。经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCT)检测18例无腹泻症状新生儿89份粪便标本,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法进行比较,结果前者检出 HRV 核酸54份(60.7%),而后者则检出35份(39.3%),PCR 结果可能比较接近新生儿排泌轮状病毒的实际情况。     

人膀胱癌细胞系SW780中侧群细胞的功能鉴定

目的 使用DCV荧光染料从SW780人膀胱癌细胞系中分离侧群细胞（SP细胞）,并观察该侧群细胞是否具有肿瘤干细胞样生物学特征. 方法 SW780细胞体外培养,用DCV荧光染料分析SP细胞比率.分选SP与NSP细胞群落后体外培养扩增.软琼脂克隆集落生成实验比较SP细胞与NSP细胞的体外单克隆生长能力.采用RT-PCR法比较ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1等基因表达差异. 结果 SW780细胞的SP比率为1.6％.经体外培养后SP细胞可以产生SP细胞与NSP细胞,NSP细胞只能产生NSP细胞.SP细胞体外单克隆生长率显著大于NSP细胞（P＜0.01）.半定量RT-PCR结果表明SP细胞的ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1基因表达显著高于NSP细胞. 结论 流式细胞仪激发DCV荧光染料可从人膀胱癌SW780细胞系中分离出侧群细胞,该侧群细胞具有肿瘤干细胞样生物学特征.     

用DIG标记的寡核苷酸基因探针杂交技术进行人轮状病毒VP7G血清型鉴定

目的：建立用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的寡核苷酸基因探针鉴定Ａ群轮状病毒ＶＰ７Ｇ血清型的分子杂交技术，并应用该技术研究河南Ａ群轮状病毒的Ｇ血清型分布。方法：根据轮状病毒编码糖蛋白ＶＰ７的基因核苷酸序列，选择该基因高保守区序列中与ＶＰ７Ｇ血清型高度相关的核苷酸片段，人工合成，并用ＤＩＧ标记。在优选的杂交条件下进行杂交：结果：①Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３和Ｇ４四种Ｇ血清型特异性寡核苷酸探针只与同血清型的轮状病毒参考毒株杂交，无交叉杂交现象。灵敏度和特异性达到放射性同位素３２Ｐ标记的水平。②１８８份经ＰＡＧＥ确定的轮状病毒阳性标本中，７９份（４２．０％）、３５份（１８．６％）、１５份（７．９％）分别与Ｇ１、Ｇ２或Ｇ３型探针杂交；未检出Ｇ４型；５６份（２９．８％）未能分型；３份分型特殊。结论：该Ｇ血清型分型技术具有高度特异性和灵敏度     

妊娠高血压综合征型肾病综合征的临床特征和病理改变

目的:观察妊高征肾病型的临床特点及病理变化,探讨其可能的机制.方法:对本科行肾活检的妊高征肾病型(肾病组)与同期本院非肾病型妊高征患者(对照组)的实验室检查及病理进行分析.结果:肾病组血浆白蛋白低于、24 h尿蛋白定量高于对照组,差异非常显著(均P＜0.01);血浆尿素氮、肌酐、尿酸水平均明显高于对照组(均P＜0.05);肾功能损害发生率亦明显升高(P＜0.01);妊高征肾病型肾脏光镜改变为肾小球毛细血管内皮细胞病,部分病例免疫荧光示肾小球毛细血管壁有IgM、IgG和纤维蛋白原的沉积.结论:妊高征型肾病综合征肾脏损害重,病理改变典型,产后择时行肾活检对明确诊断、指导治疗颇有意义.     

益母草类中药原植物的核核糖体内转录间隔区序列分析

目的分析益母草属4种植物nrDNAITS序列,探讨其在益母草药材DNA分子鉴别中的作用。方法对4种益母草属植物分别进行ITS序列的PCR扩增和测序,并运用CLUSTRALX和MEGA软件进行分析。结果测得4种植物的ITS序列,包括ITS1、5.8S和ITS2全长序列以及18S、26S部分序列;益母草及其易混淆的3种植物ITS1、ITS2序列的差异性分别为7.2%～18.8%和14.2%～27%。根据ITS序列特征所构建的系统树与传统分类有所不同。结论ITS序列特征可作为益母草种间鉴别的有效分子标记。