人血管生长素的真核表达及亚细胞定位

目的:建立人血管生成素(angiogenin,ANG)的真核表达系统并在细胞内亚定位。方法:采用亚克隆技术构建重组荧光真核细胞表达质粒pEGFP/ANG,然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并对转染细胞内pEGFP/ANG的表达用荧光显微镜和免疫组化染色进行鉴定。用共聚焦显微镜和免疫电镜观察ANG的亚细胞定位。结果:荧光显微镜观察可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化染色检测显示,转染的HUVEC中有棕色颗粒。共聚焦显微镜及免疫电镜检查显示,ANG集聚于细胞核区。结论:以构建的重组体pEGFP/ANG转染HUVEC后,可表达人ANG蛋白;表达的ANG定位于细胞核区。     

重组载体pEGFP-ANG的构建及ANG基因在HUVEC中的表达

目的 :建立血管生成素 (angiogenin ,ANG)基因的真核表达系统。方法 :采用化学合成拼接法 ,获得人ANG全长cDNA并测序 ,构建重组荧光真核细胞表达质粒 pEGFP ANG ,然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。应用荧光显微镜观测及免疫组化染色 ,对转染细胞内 pEGFP ANG的表达进行鉴定。结果 :测序表明 ,编码的氨基酸序列与人ANG完全一致。荧光显微镜下可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化检测显示 ,转染的HUVEC中有棕色颗粒。结论 :获得了人ANG的全长编码基因。构建的重组体pEGFP ANG转染HUVEC后 ,可表达人ANG蛋白     

模拟微重力对人脐静脉内皮细胞血管生成素产生的影响

目的探讨模拟微重力对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生成血管生成素（ANG）的影响。方法培养HUVEC，分为模拟微重力组、地面静止对照组及剪切力对照组，在培养第24h、48h、72h和96h分别收集培养上清液，用ELISA方法检测ANG的浓度变化；固定一部分细胞，应用免疫细胞化学方法检测ANG在HUVEC中的表达情况。结果无论是应用ELISA方法检测上清液中的ANG，还是应用免疫细胞化学的方法检测ANG在细胞内的表达，均发现与地面静止及剪切力对照组相比，模拟微重力组HUVEC的ANG生成增加（P〈0．05）。结论应用回转器模拟微重力能促进体外培养的HUVEC生成ANG。     

人血管生长素的亚细胞定位

已有大量研究表明血管生成素（angiogenin，ANG）与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系，肺癌、胰腺癌、乳腺癌等患者的外周血血清中，ANG的水平明显升高，血清ANG的水平与这些肿瘤的发展及转移呈显著正相关，因此，可以检测血清中ANG的水平来预测肿瘤的发生与发展情况。此外，ANG对于创伤、烧伤及血循环较差的股骨头、半月板等损伤的修复具有较大的临床应用价值。在本研究中我们构建了人ANG真核表达质粒，转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行表达，并作了初步的亚细胞定位。     

联胺诱导培养的人内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1

细胞黏附分子涉及许多生理和病理过程 ,如动脉粥样硬化 (AS) [1] 。有些因素可能诱导细胞黏附分子的表达 ,如氧化低密度脂蛋白 (oxLDL)诱导培养的内皮细胞表达血管细胞黏附分子 1(VCAM 1) [2 ] 。这提示细胞黏附分子可能是导致AS的一种重要因素。我们拟用氧化剂联胺处理培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,诱导其脂质过氧化损伤 ,观察其VCAM 1mRNA和蛋白表达 ,为抗氧化剂防治AS提供实验依据。一、材料与方法1 HUVEC培养与分组 :用胰酶消化法获取HUVEC ,培养于M199培养基 (Gibco公司产品 ) ,含 5 %新生牛血清、10 %胎牛血清、5 …     

MIPU1上调基质金属蛋白酶14促进血管新生

目的:探讨转录因子心肌缺血预处理上调蛋白1(myocardial ischemic preconditioning upregulated protein 1,MIPU1)促进血管新生的分子机制。方法:m RNA测序分析MIPU1过表达人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的m RNA差异表达;染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)检测MIPU1与基质金属蛋白酶14(matrix metalloproteinase 14,MMP14)启动子区结合情况;采用Matrigel、划痕和Transwell分析HUVEC管型形成和迁移;采用Western blot和定量PCR分别检测MIPU1和MMP14蛋白质和m RNA表达;采用LAD建立慢性心肌缺血小鼠模型,采用HE染色和CD31免疫组化分析缺血心肌组织形态学变化及微血管形成。结果:免疫组化和HE染色显示与假手术组相比,缺血心肌中组织损伤加重伴随有CD31~+微血管数目增加,同时心肌组织中MMP14和MIPU1蛋白和m RNA表达增加。RNA测序显示与对照组相比MIPU1过表达HUVEC中MMP14 m RNA增加约4倍。MMP14特异性si RNA转染显著下调MMP14蛋白表达后,可抑制MIPU1促HUVEC管型形成和迁移作用;相反,MMP14过表达可增加MIPU1的上述作用。生物信息学分析显示MMP14启动子区含有2个MIPU1结合元件核心序列("CTTA"),CHIP结果显示MIPU1与MMP14启动子区-217~-221 bp和-110~-106 bp处的"CTTA"有结合。结论:MIPU1通过上调MMP14促进HUVEC的管型形成和迁移作用,这一调节机制可能参与缺血心肌中微血管新生过程。     

新型可降解聚合物聚乙二醇对苯二甲酸酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯的细胞相容性研究

目的：研究新型可降解聚合物聚乙二醇对苯二甲酸酯／聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEGT／PBT)的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)相容性，对其在组织工程血管中的应用进行探讨。方法：对PEGT／PBT进行细胞毒性评价。观察并检测HUVEC在PEGB／PBT、Ⅰ型胶原改性(Col-)的PEGT／PBT、纤维连接蛋白改性(Fn-)的PEGT／PBT上的粘附和增殖，对细胞在粘附过程中的粘着斑蛋白进行免疫荧光染色观察。结果：PEGT／PBT细胞毒性不大于1级，能支持脐静脉内皮细胞的粘附和增殖。纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原处理可促进HLIVEC在PEGT／PBT膜上的增殖，而且纤维连接蛋白可增加HUVEC在PEGT／PBT上20min、2h的粘附率，并促进细胞形成局部粘附结构。结论：新型可降解聚合物PEGT／PBT具有良好的血管细胞相容性，对其在组织工程血管中的应用值得进一步开发研究。     

脑内肾素-血管紧张素系统研究的进展

近二十年来肾素-血管紧张素系统(RAS)在血压调节和高血压发病中的作用越来越受到重视。随着这一系统中的有关激素和酶的放射免疫测定以及血管紧张素Ⅰ受体(ANGⅠ-R)分离提纯等方法学的进展,工作也越来越深入。特别是关于RAS在血压调节中的中枢效应的研究吸引了更多的注意。     

人参皂甙对内毒素致血管内皮细胞表达TF和PAI-1的影响

目的:研究人参皂甙对内毒素脂多糖(LPS)致血管内皮细胞组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)表达的影响,探讨人参皂甙对心血管疾病的保健及防治机制。方法:用酶消化法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC);ELISA方法检测HUVEC条件培养液PAI-1蛋白量;用一步凝固法检测HUVECTF活性;Northernblot检测HUVECTF和PAI-1的mRNA表达。结果:LPS能使HUVECPAI-1蛋白和TF活性及其mRNA表达显著增强,人参皂甙则明显抑制LPS对HUVEC的这种作用。结论:通过拮抗LPS致HUVECTF和PAI-1的表达,人参皂甙可维持血管内皮功能稳定,而发挥其心血管疾病的保健与防治作用。     

大鼠应激时下丘脑、垂体前叶、肾上腺的血管紧张素原基因的表达

采用原位杂交技术及放免分析法观察了35只SD大鼠应激时下丘脑、垂体前叶、肾上腺组织中血管紧张素原（ANG）mRNA的表达及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）含量变化。结果表明：下丘脑、垂体前叶、肾上腺髓质ANG mRNA表达均显著增强（n=5,P＜0.001,P＜0.05),以下丘脑最为明显。下丘脑、垂体前叶ANG mRNA表达增高率超过了AngⅡ含量的增高率（P＜0.05),而肾上腺皮质ANG mRNA表达仅在急性应激时有明显改变（P＜0.05)。结果提示：应激时局部组织肾素-血管紧张素系（RAS）被显著激活,以住测得的局部组织AngⅡ的增高主要是局部RAS激活的结果,本研究进一步支持了局部RAS参与了应激反应的观点。     

清解宁对白细胞-血管内皮细胞粘附的影响

白细胞 血管内皮 (HUVEC)细胞粘附在免疫应答与炎症中均有重要作用。黄连解毒汤及主要成分小檗碱、黄芩苷等能抑制白细胞与HUVEC的粘附及粘附分子的表达[1] 。我们将上述成分组成清解宁 ,研究其对白细胞 HUVEC粘附及粘附分子的影响。1　材料与方法1 1　材料　M199培养基 (美国Gibco) ,内皮细胞生长因子 (ECGF德国B M) ,I型胶原酶 (美国Sigma) ,rhTNF(北京邦定 ) ,鼠抗人E selectin单克隆抗体 (深圳晶美 ) ,清解宁 :将盐酸小檗碱、盐酸药根碱等 (均购自中国药品生物制品检定所 )用PBS按一定比例配成无菌溶液。1 2　方法1 2 1…     

丹参注射液对H-7402细胞与HUVEC粘附的影响

目的循环中的肿瘤细胞必须牢固地粘附在血管壁上,才能进一步穿过血管壁,继续生长繁殖形成转移灶.本研究从肿瘤细胞与血管内皮细胞粘附的角度,研究活血化瘀药丹参注射液影响肿瘤转移的细胞及分子机制.方法以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为血管内皮细胞模型,药物及TNF(10×105U/L)处理HUVEC24h后1.倒置显微镜下观察细胞形态,研究丹参对TNF所致血管内皮损伤的保护作用;2.以蛋白染料染色法研究丹参对H-7402细胞与HUVEC粘附的作用(以A值表示);3.用细胞ELISA法观察HUVEC表面粘附分子ICAM-1的表达.结果1.丹参对TNF所致血管内皮损伤有保护作用;2.TNF处理HUVEC24h后,H-7402与HUVEC的粘附A值为0.167±0.012,与对照(0.035±0.009)比,P＜0.01.若加入丹参0.125mg、0.25mg、1.25mg、2.5mg、12.5mg,则粘附A值分别为0.158±0.015、0.126±0.018、0.102±0.012、0.084±0.005、0.064±0.008,与TNF比,有显著差异,说明丹参可抑制TNF导致的H-7402与HUVEC粘附增加;3.TNF处理HUVEC24h后,HUVEC表面粘附分子ICAM-1表达的A值为0.238±0.008,与对照(0.087±0.009)比,P＜0.01.若加入丹参0.125mg、0.25mg、1.25mg、2.5mg、12.5mg,则A值分别为0.209±0.016、0.194±0.011、0.175±0.013、0.145±0.006、0.108±0.014,与TNF比有显著差异,说明丹参可下调TNF诱导的HUVEC表面粘附分子ICAM-1表达的升高.结论丹参可通过下调血管内皮细胞粘附分子ICAM-1的表达及保护内皮细胞的完整结构而抑制肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附,从而抑制循环中的肿瘤细胞穿过血管壁,这可能是丹参抑制肿瘤血行转移的机制之一.     

血管生成素-2和内皮抑素在子宫内膜异位症中的高表达

目的 探讨血管生成素-2（ANG-2）和内皮抑素（ENS）在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法 卵巢子宫内膜异位症病人25例，24例无内膜病变者为对照组。留取子宫内膜，用免疫组化染色法检测ANG -2和ENS在子宫内膜中的表达，用酶联免疫吸附测定法检测腹腔液中ANG -2和ENS的蛋白含量。结果ANG -2在位子宫内膜组织中的阳性表达率显著高于异位内膜和对照组，异位内膜中阳性表达率显著高于对照组；ENS在异位内膜组织中的表达明显高于在位内膜和对照组，在位内膜明显高于对照组；ANG-2及ENS表达强度在子宫内膜异位症Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ比较无显著差异。异位组腹腔液的ANG-2、ENS含量和ANG-2/ENS 比值均显著高于对照组。结论ANG-2和ENS在子宫内膜异位症血管生成中起到重要的作用，参与调节异位病灶的发生和进展。     

ZNF667调节VEGF-VASH1通路促进血管新生

目的:VEGF-VASH1(vasohibin-1)通路在血管新生过程的精细调节中发挥重要作用,转录因子锌指蛋白667(zinc finger protein 667,ZNF667)具有促进血管新生作用。本研究主要探讨ZNF667对上述通路中VEGF和VASH1表达的调控,以期阐明ZNF667促进血管新生的分子机制。方法:采用LAD建立慢性心肌缺血小鼠模型,采用HE染色和CD31免疫组化分析缺血心肌组织形态学变化及微血管形成。采用Matrigel、划痕和Transwell分析HUVEC管型形成和迁移;采用Western blot、ELISA和定量PCR分别检测ZNF667和VASH1蛋白质和m RNA表达;m RNA测序分析ZNF667过表达HUVEC的m RNA差异表达;染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)检测ZNF667与VEGF和VASH1启动子区结合情况。结果:免疫组化和HE染色显示与假手术组相比,缺血心肌中组织损伤加重伴随有CD31~+微血管数目增加,同时心肌组织中VEGF和ZNF667蛋白和m RNA表达呈时间依赖性增加,而VASH1表达降低。m RNA测序、ELISA和定量PCR显示ZNF667过表达可促进HUVEC中VEGF表达而抑制VASH1表达。VASH1过表达可抑制VEGF和ZNF667的促HUVEC管型形成和迁移作用。Ch IP显示ZNF667与VEGF(-346~-350 bp;-265~-269 bp)和VASH1(-170~-175 bp)基因启动子区结合。结论:HUVEC中ZNF667靶向调节VEGF-VASH1通路促进管型形成和迁移作用,这一调节机制可能参与缺血心肌中微血管新生过程。     

转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究

目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段。材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC。从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低。实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1μg/3μl;2μg/6μl;2μg/8μl;3μg/12μl。ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达。再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面。复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的。结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数最多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532·5±43·1pg/ml。使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69·9%±3·5%、43·7%±2·5%,有明显改善。结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附。     

局部血管紧张素Ⅱ对加压素诱发的缩血管反应的增强作用

血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)和精氨酸加压素(AVP)是两种重要的血管活性多肽。近年来发现,血管组织不仅存在肾素一血管紧张素系统(RAS),而且还可生成加压素。这两种旁分泌系统在血管活动调节中的作用及其相互关系尚未阐明。本文探讨肠系膜血管床局部的RAS对加压素诱发的缩血管反应的影响.实验采用:大鼠离体肠系膜动脉床灌流法,灌流压的高低反映血管阻力的升降,应用放免法测定血管灌流液中ANGⅡ的含量。结果(1)合成的肾素底物十四肽(TDP,即血管紧张素原)5×10~(-7)mol/L可诱发肠系膜血管收缩,使灌流任明显升高(P<0.001,n=12).TDP的这种作用与剂量有关,5×10~(-8)mol/L不能升高灌流压.这种编血管作用可被ANGⅡ受体拮抗剂Saralasin所阻断,但不能被血管紧张素转换酶     

血管紧张素转换酶抑制剂对梗死心肌组织钙蛋白酶的影响

目的：探讨血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）对梗死心肌组织钙蛋白酶(calpain)系统的调节作用。 方法: 结扎大鼠左冠状动脉复制心肌梗死模型，术前7 d起用ACEI雷米普利（rampril）(1 mg·kg-1·d-1)。术后1、3、7、14 d分别检测左心室游离壁（LVFW）、室间隔（IS）、右室壁(RV) calpainⅠ、Ⅱ及钙蛋白酶抑制剂（calpastatin）蛋白表达。 结果: 室间隔calpainⅠ蛋白表达于心肌梗死14 d增加; 左室游离壁calpainⅡ蛋白表达于心肌梗死3 d达高峰。雷米普利可抑制心肌组织calpainⅠ和Ⅱ的上调，减少心梗面积和间质纤维化，calpastatin蛋白表达不受ACEI的影响。 结论: CalpainⅠ参与梗死心肌组织的晚期重塑，calpainⅡ参与缺血心肌组织的早期损伤作用。心肌梗死病理过程中，ACEI的心脏保护作用可能与其抑制calpainⅠ、Ⅱ有关。     

血管生长素与血管生成

血管生长素 (ANG)属于RNase超家族 ,是唯一具有核糖核酸酶活性的血管生成因子。它可通过促进基膜的降解 ,促进内皮细胞增殖、迁移、粘附等作用来促进血管生成。ANG在多种肿瘤中表达增高。在糖尿病、外周动脉阻塞性疾病中其表达水平亦有升高     

骨髓间充质细胞来源的血管内皮样细胞与脐静脉血管内皮细胞抗凝基因表达的比较

目的观察不同来源的血管内皮细胞抗凝能力的差异。方法采用密度梯度离心及贴壁培养法对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)进行体外培养、纯化和扩增,用含有VEGF(10μg/L)的诱导培养液对其进行体外诱导分化,1周后免疫组化染色鉴定Ⅷ因子相关抗原(VWF),用RT-PCR法检测BMMSCs来源的血管内皮样细胞及脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的主要抗凝血基因的表达。结果BMMSCs能够在体外成功诱导分化为血管内皮样细胞,但不表达主要抗凝基因的mRNA,而HUVEC能够表达这些基因的mRNA。结论虽然BMSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,但它的抗凝能力较HUVEC弱。     

CD44促进HUVECs增殖和黏附

目的研究CD44在血管内皮细胞增殖和黏附中的作用及机制。方法采用pc DNA3.1载体上调人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)中CD44的表达。使用siRNA分别沉默HUVEC中Akt和血小板内皮细胞黏附因子(PECAM1)基因。MTT法测定细胞增殖,细胞计数法测定细胞黏附率,RT-PCR分析PECAM1的mRNA水平,Western blot分析蛋白Ki67、PECAM1以及Akt磷酸化水平。结果 CD44过表达显著促进了HUVEC的增殖(P0.05),上调Ki67的表达并促进Akt的磷酸化(P0.05);Akt siRNA显著降低了CD44诱导的细胞增殖(P0.05)。CD44促进HUVEC细胞间黏附(P0.05),上调PECAM1的mRNA和蛋白水平(P0.05);PECAM1 siRNA降低CD44诱导的细胞黏附(P0.05)。结论 CD44能够促进HUVEC的增殖和黏附,部分作用可能与上调PECAM1有关。