稳定表达MRG15基因的人晶状体上皮细胞株的建立

目的:克隆人15号染色体上死亡相关因子(MORF4-re-latedgeneonchromosome15,MRG15)基因的编码区全长,构建真核表达载体,建立稳定表达MRG15的人晶状体上皮细胞株,为MRG15在年龄相关性白内障(agerelatedcataract,ARC)发生中相关功能的研究奠定基础。方法:采用RT-PCR由人ARC晶状体前囊膜标本中扩增MRG15的编码区全长,克隆至pMD18-T载体并测序,结果正确后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )中,采用脂质体法对培养人晶状体上皮细胞进行稳定转染,挑取单克隆,用Westernblot进行MRG15表达的鉴定。结果:测序证实,由ARC晶状体前囊膜中扩增出的MRG15编码区全长序列正确。重组质粒pcDNA3.1( )-MRG15经酶切后释放出与理论长度相符的片段。培养人晶状体上皮细胞稳定转染挑取单克隆后,经Westernblot检测,30个克隆中有19个MRG15的表达量明显增高。结论:克隆了人MRG15的编码区全长,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-MRG15,并建立了稳定表达MRG15的人晶状体上皮细胞株。     

MRG15在正常及年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达

目的：研究MRG15（死亡因子相关基因）在年龄相关性白内障（ age－related cataract,ARC）、正常晶状体上皮细胞的表达差异。
　　方法：性成熟的健康雌性SD大鼠40只,随机分为研究组、对照组,每组20只,研究组切除双侧卵巢、低浓度萘长间隔给药,建立围绝经期ARC模型;对照组常规饲养。以消减杂交改良法克隆MRG15,并对其cDNA片段应用地高辛标记制作探针。获取两组大鼠晶状体前囊膜切片后,再通过原位杂交法明确晶状体上皮细胞的表达差异。
　　结果：克隆出的MRG15通过BamH1和EcoR1酶切以及琼脂糖电泳,可获取长为639bp的cDNA片段。 GeneBank对比显示,其同源性达到99．0％。原位杂交显示,ARC患者及正常晶状体上皮细胞内均可见MRG15表达。研究组阳性细胞百分率与对照组相较,有统计学差异（P＜0．05）。研究组积分指数与对照组相较,有统计学差异（ P＜0．05）。结论：MRG15在ARC 和正常晶状体上皮细胞中均有表达,并且ARC较正常晶状体上皮细胞表达增高,这可能与MRG15对晶状体上皮细胞中一部分关键基因的转录产生抑制效应有关,通过降低晶状体上皮细胞的功能,使其出现衰老样改变,进而形成白内障,临床应对此进行更进一步的研究。     

MRG15的克隆及其在正常和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达

目的克隆死亡因子相关基因15(MRG15)并研究其在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达，比较二者的差异。方法用改良的消减杂交法克隆死亡因子相关基因15，地高辛标记MRG15cDNA片断制作探针，用原位杂交法研究其在晶状体前囊膜切片上的表达，并作统计学处理。结果克隆到了死亡因子相关基因15的cDNA片断，长约639bp，死亡因子相关基因15在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达；经统计分析，其在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达高于其在正常晶状体上皮细胞中的表达。结论MRG15在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达；在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中，其表达较正常晶状体增高，提示其可能在白内障的发生中起重要作用。     

A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达

目的 构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法 应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果 重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论 成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.     

应用转基因技术体外培养表达人碱性成纤维细胞生长因子的视网膜色素上皮细胞

目的 探讨应用转基因技术体外培养稳定表达人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的可行性。方法 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为标记基因的人bFGF真核表达载体pcFG。应用脂质体介导法转染人RPE细胞,以G418筛选出表达bFGF的RPE细胞,并进行细胞克隆,传代培养4周。于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,用原位杂交和免疫组织化学染色法检测bFGF在RPE细胞的表达情况。结果 酶切结果证实含有GFP的真核表达载体pcFG构建正确。在荧光显微镜下可见RPE细胞表达绿色荧光蛋白。经原位杂交和免疫组织化学染色证实,转染pcFG后的RPE细胞内有大量bFGF—mRNA的转录蛋白表达。结论 应用转基因技术可体外培养稳定表达bFGF的RPE细胞。     

人血管生成素-1基因真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

目的构建人血管生成素-1（Ang-1）基因的真核表达载体,并检测其在人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中的表达,为进一步研究Ang-1防治糖尿病视网膜病变（DR）的血管渗漏提供实验依据。方法提取人胎盘组织中的总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）特异性扩增Ang-1编码区序列,亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1。将pEGFP-N1-Ang-1导入UC-MSCs,然后应用含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基对人UC-MSCs进行培养,荧光显微镜下观察Ang-1在人UC-MSCs中的表达,Western blot法检测重组体的表达。结果 RT-PCR法成功克隆人Ang-1基因编码区序列,纯度为1.82;PCR扩增的片段长度为1.5 kb,与预期片段大小相近。双酶切鉴定法可识别重组pEGFP-N1-Ang-1转染质粒,目的基因与预期基因序列的同源性为100%。人UC-MSCs转染的pEGFP-N1/Ang-1质粒能够表达Ang-1蛋白,呈现绿色荧光。转染pEGFP-N1的人UC-MSCs和对照组人UC-MSCs均未见相应的Ang-1蛋白表达。结论成功地克隆出人的Ang-1基因并构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ang-1,为将Ang-1基因转染至人UC-MSCs治疗DR奠定了基础。     

错配修复基因MSH3在人晶状体中的表达

目的　研究错配修复基因MSH3在人晶状体上皮细胞系SRA01/04、年龄相关性白内障（age-related cataract,ARC）患者晶状体组织以及24周人胎眼晶状体组织中的表达情况，探讨其与ARC形成的关系。方法　采用RT-PCR检测人晶状体上皮细胞系SRA01/04、ARC患者晶状体组织和健康人脐带（阳性对照）中MSH3基因的表达水平，免疫荧光检测24周人胎眼晶状体中MSH3蛋白的表达。结果　MSH3在晶状体上皮细胞系SRA01/04中高表达，在ARC患者晶状体组织中表达下调。MSH3在24周人胎眼晶状体纤维细胞、晶状体上皮细胞以及晶状体前囊组织中均有表达，且在晶状体上皮细胞中高表达。结论　MSH3在人胎眼晶状体组织和SRA01/04中高表达，而在ARC患者晶状体组织中表达下调，这种表达差异可能会影响DNA的错配修复过程，进而影响晶状体发育导致ARC的发生。     

αA晶状体蛋白重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带鼠αA晶状体蛋白的腺病毒表达载体,为进一步研究αA晶状体蛋白高表达对损伤条件下神经细胞的保护作用提供实验基础。方法采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的αA晶状体蛋白基因,并克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建携带外源性αA晶状体蛋白编码基因的重组腺病毒载体pAd-CRYAA。脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-CRYAA。应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以腺病毒感染滴度快速测定试剂盒测定病毒滴度。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实αA晶状体蛋白基因正确插入腺病毒表达载体,并在人胚肾293细胞中包装出重组腺病毒。收获病毒的滴度为1.143×1012ifu·L-1。结论成功构建Ad-CRYAA重组腺病毒表达载体,可作为后续研究中可靠的基因转染工具。     

蛋白酶体β5亚单位基因真核表达载体的构建

目的:构建蛋白酶体亚单位β5基因真核表达质粒。方法:从人晶状体上皮细胞株SRA01/04中提取总RNA,经RT-PCR扩增获得β5亚单位的全长cDNA片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1上。结果:RT-PCR法扩增出约792bp的β5亚单位基因全部编码序列的片段。酶切鉴定和测序分析证实所插入的β5亚单位的基因序列完全正确。结论:成功构建了蛋白酶体β5亚单位基因真核表达重组质粒。     

人转化生长因子β诱导基因真核表达载体的构建及其对人角膜上皮细胞增生的影响

背景人转化生长因子-β诱导（TGFBI）基因是第一个被确定的角膜营养不良的致病基因,而TGFBI引起角膜营养不良的机制目前尚不清楚,研究TGFBI的功能对于揭示角膜营养不良的发病机制及了解角膜生理及病理功能都具有重要意义。目的构建人TGFBI基因的真核表达载体并将其转染于人角膜上皮细胞,探讨其对角膜上皮细胞增生及相关基因表达的影响。方法从角膜移植后剩余的供体角膜中提取人正常角膜组织总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）合成TGFBI cDNA,将TGFBI胶回收产物与载体pCMV—N-HA分别进行双酶切,取连接产物10μl转化100μl大肠杆菌感受态DH5α克隆入真核表达载体pCMV—N—HA,以菌落PCR和EcoRV、XhoI双酶切法测序鉴定。设置重组质粒pCMV—N—HA—TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组、阴性对照组及pGFP—C2转染对照组,以测定重组质粒转染率。重组质粒pCMV-N—HA—TGFBI转染人角膜上皮细胞,激光共焦显微镜下观察转染pGFP—C2后增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,用细胞计数试剂盒8（CCK-8法）检测转染细胞的增生情况,SYBR荧光实时定量PCR和Western blot法检测TGFBI、基质金属蛋白酶（MMPs）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）蛋白及其mRNA在转染后角膜上皮细胞的表达。结果pCMV—N-HA—TGFBI阳性克隆质粒进行经EcoRV和XhoI双酶切鉴定测序结果显示,扩增的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,pGFP—C2载体转染人角膜上皮细胞后48h共焦显微镜下可见EGFP的表达,转染效率为70％。重组质粒pCMV—N—HA-TGFBI转染组TGFBI mRNA的表达明显高于空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组,TGFBI蛋白仅在pCMV—N-HA．TGFBI转染组表达。CCK-8法显示重组质粒pCMV—N-HA-TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组间角膜上皮的吸光度（A450）值的差异无统计学意义（F=3．34,P〉0．05）。荧光实时定量PCR结果显示,重组质粒pCMV-N—HA-TGFBI转染组中MMP,mRNA、MMP,mRNA转录水平比空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组均升高（P〈0．05）,而TIMP,mRNA则明显下降（P〈0．05）;Western blot结果证实MMP1、MMP3、TIMP1蛋白表达规律相同（P〈0．05）。结论人TGFBI基因真核表达载体可被成功构建并在人角膜上皮细胞中呈过表达。TGFBI可能是通过MMP1、MMP3及TIMP1的表达变化来增加细胞外基质的降解,从而参与角膜的某些生理病理过程。     

In vivo human lens epithelial cell proliferation on the anterior surface of PMMA intraocular lenses.

AIMS: To study in vivo human lens epithelial cell proliferation on the anterior surface of PMMA implants and its interaction with postoperative blood-aqueous barrier breakdown in eyes undergoing cataract surgery. METHODS: A prospective study was carried out on three consecutive patient cohorts undergoing cataract surgery with intraocular lens implantation using three different surgical techniques which produce different anatomical relations between the implant and lens capsule. Specular microscopy of the anterior implant surface was used to document the natural history, topography, and density of lens epithelial cells and the laser flare and cell meter were used to measure postoperative blood-aqueous barrier breakdown. RESULTS: All groups showed lens epithelial cell proliferation onto the anterior surface of PMMA implants. This was initiated by and restricted to the region of anterior capsule-implant contact and decreased with the onset of anterior capsular opacification. Significant correlation was found in all groups between lens epithelial cell proliferation and postoperative blood-aqueous barrier breakdown. CONCLUSIONS: Human lens epithelial cell behaviour on PMMA surfaces in vivo differs from that seen in culture studies. Humoral factors in the aqueous, biomaterial properties of the implant, and its anatomical relations with the anterior and posterior lens capsule influence lens epithelial cell behaviour in vivo.     

Descemet's membrane substrate from human donor lens anterior capsule

Background: To study the potential use of human donor anterior lens capsule as a Descemet's membrane substrate. Methods: Anterior lens capsules were recovered from the lenses of 30 cornea donors. Human corneal endothelial cells were recovered from the remaining corneal sclera rims of 15 donor corneas used for penetrating keratoplasty. Samples were sorted into three groups. Group 1 consisted of 10 samples in which the endothelial cells were allowed to grow on anterior lens capsules. In Group 2 human corneal endothelial cells grew on a collagen membrane and in Group 3 on polystyrene culture plates. Cell density, morphology and adherence of the cell–capsule complex were evaluated at 1, 4, 7 and 14 days with a phase‐contrast microscope, a scanning electron microscope and by histology. Cell viability was quantified by a microscopic live–dead assay. Expression of zonula occludens‐1, Na⁺/K⁺‐adenosine triphosphatase, tissue transglutaminase and vimentin were investigated by immunohistochemistry. Results: A mean diameter of 10.05 ± 0.13 mm of anterior capsule was obtained as a substrate for cell culture. Endothelial cell density of Group 1 was measured at 2455.4 ± 283.8 cells/mm², which was also comparable with the cell density of the control group. Cell viability was 95% or superior in all groups and multiple cellular interconnections developed between growing cells. Immunohistochemical analysis demonstrated strongly positive staining for all investigated proteins. Electron microscopy confirmed the adherence and monolayer growth of the endothelial cells. Conclusions: Human donor anterior lens capsule might therefore be a potential scaffold for the ex vivo expansion of human corneal endothelial cells.     

老年性白内障患者circKMT2E表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的　探讨circKMT2E在老年性白内障（ARC）患者中的表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法　取10例在我院接受白内障手术的ARC患者晶状体前囊膜,另选取4例健康捐献者透明晶状体前囊膜作为对照。使用Trizol试剂从人晶状体前囊膜组织中提取总RNA。依次使用cutadapt软件、DCC软件(v0.4.4)、STAR软件 (v2.51 b)、CircBase数据库和circ2Trait数据库对所测得的环状RNA（circRNA）进行注释,筛选circRNA差异表达。将体外培养的SRA01-04细胞随机分组,其中,空白对照组:用正常培养液培养,不作特殊处理;miR-control组:转染miR-control无序序列;miR-34a组:转染miR-34a-5p mimics序列;miR-34a+control组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空载体;miR-34a+HMGB1组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1质粒。采用实时荧光定量PCR与双荧光素酶报告基因检测基因表达情况。 通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达。结果　经生物信息学分析显示,circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜组织中表达上调最为显著。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-34a-5p后circKMT2E-WT报告基因的荧光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057（P<0.05）;而circKMT2E-MUT报告基因的荧光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053（P>0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞凋亡率（23.59%±3.47%）较miR-control组（3.82%±0.41%）增高（P<0.05）,而miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞凋亡率（8.97%±1.20%）较miR-34a-control组（24.59%±4.33 %）降低（P<0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相对表达量较miR-control组均升高,同时Bcl-2蛋白相对表达量则降低（均为P<0.05）;miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相对表达量较miR-34a-control组均降低,同时Bcl-2蛋白相对表达量较miR-34a-control组增加（均为P<0.05）。结论　circKMT2E可通过海绵吸附miR-34a-5p减弱其对下游靶点HMGB1的抑制作用,进而有效地阻止SRA01-04细胞凋亡,在一定程度起到延缓ARC发展的作用。     

白喉毒素氨基端389个氨基酸-人碱性成纤维细胞生长因子靶向毒素的克隆表达及对人晶状体上皮细胞毒性研究

目的 为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法 提取灭活的白喉杆菌DNA和12周胎脑皮质RNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端389个氨基酸(DT389)的基因片段及编码18kd人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化鉴定表达产物,噻唑蓝(MTT)试验检测其对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)的毒性作用,流式细胞术鉴定不同剂量融合毒素所致HLECs成活率及细胞死亡形式.结果 扩增得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达;表达的融合蛋白对HLECs有明显的毒性作用并在一定范围内呈明显剂量依赖性,半数致死量为3.8×10-11mol/L,所致细胞死亡方式主要以凋亡为主.结论 DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物促晶状体上皮细胞的凋亡、抑制后发障的研究奠定了物质基础.     

Degeneration and transdifferentiation of human lens epithelial cells in nuclear and anterior polar cataracts.

PURPOSE: To study the possible mechanisms of cataractogenesis by evaluating the characteristics of cataractous lens epithelial cells (LECs) in different types of human cataract. SETTING: Kangnam St. Mary's Hospital, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. METHODS: Lens epithelial cells attached to the anterior capsules in eyes with nuclear or anterior subcapsular were analyzed for morphological characteristics by electron microscopy and for cellular characteristics by immunohistochemistry. RESULTS: Human LECs beneath the anterior capsule were degenerated in nuclear cataracts and were transdifferentiated in anterior polar cataracts. In senile nuclear cataractous lenses, LECs beneath the anterior capsule showed degenerative changes in morphology. In nuclear cataracts, LECs were immunohistochemically positive for cytokeratin and vimentin, while those in anterior polar cataracts were positive for vimentin only. The LECs of anterior subcapsular cataracts were transdifferentiated into spindle-shaped fibroblast-like cells without cellular junctions and embedded within a fibrillar meshwork mass. The extracellular matrixes in the anterior capsule of anterior subcapsular cataracts were immunohistochemically positive for fibronectin, laminin, collagen type I, and collagen type IV. CONCLUSIONS: Lens epithelial cells in different types of cataracts have distinct cellular characteristics and may possess a bipotential nature with the ability to transdifferentiate into mesenchymal cells. This may be an underlying mechanism for the development of cataract and capsule opacification.     

增强型绿色荧光蛋白基因在人胚胎视网膜前体细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染人胚胎视网膜前体细胞的转染效率及瞬时表达情况,建立人胚胎视网膜前体细胞的示踪方法,为视网膜前体细胞移植提供示踪依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过磷酸钙介导法转染人胚胎视网膜前体细胞．应用流式细胞仪检测其转染效率,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况。结果:pEGFP-N1在基因转染24 h细胞转染率为28．98％,48 h为32．45％,72 h为30．40％,对照未转染细胞24 h、48 h分别为2．50％和2．04％:体外观察培养细胞转染24 h已有绿荧光表达,48-72 h细胞荧光强度最强,96 h荧光强度减弱。结论:pEGFP-N1质粒能有效转染人胚胎视网膜前体细胞,其转染效率可达到30％,是人胚胎视网膜前体细胞较为理想的瞬时表达载体和细胞示踪报告分子。     

pEGFP-N1-Endostatin重组质粒的构建及其体外表达

目的构建分泌型人内皮抑素（ES）的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES。采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Westernblot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达。结果通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确。采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20 000的人ES蛋白表达。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白。