B7-1和IL-12基因转染对肝癌细胞免疫原性的影响

目的 观察Ｂ７－１和ＩＬ－１２基因表达对人肝癌细胞免疫原性原影响。方法 分别将Ｂ７－１和ＩＬ－１２基因以逆转录病毒介导转染ＨｅｐＧ２细胞。阳性克隆细胞与健康人外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）混合培养后,用流式细胞仪检测ＰＢＬ表面Ⅰ类人白细胞抗原（ＨＬＡ－Ⅰ）分子表达,以ＭＴＴ法检测ＰＢＬ的特异性杀伤活性Ｋ５６２细胞的活性。结果 混合ＨｅｐＧ２／Ｂ７－１ＨｅｐＧ２／ＩＬ－１２细胞组ＰＢＬ表面的ＨＬＡ－Ⅰ分子     

原发性肝癌基因治疗目的基因筛选的初步研究

目的 通过动物实验初步筛选对肝癌有明确疗效的目的基因。方法 应用携带对肿瘤有明确疗效的目的基因白细胞介素－２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２,ＩＬ－２）,白细胞介素－１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２,ＩＬ－１２）,共刺激因子Ｂ７－１（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ,Ｂ７－１,Ｂ７－１）,单纯疱疹病毒胸苷激素（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ－１ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ,ＨＳＶ－ＴＫ）,抑癌基因Ｐ５３     

转白细胞介素2基因人肝癌细胞株的建立及其部分生物活性？…

目的 建立转白细胞介素２（ＩＬ－２）基因人肝癌细胞株，并研究ＩＬ－２的表达情况及其在动物体内的生物活性。方法 用重组载体逆转录病毒ＬＮＣ－ＩＬ２与肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１混合培养、Ｇ４１８筛选，建立转基因细胞株。以斑点杂交法，ＲＴ－ＰＣＲ法及ＭＴＴ法分别从ＤＮＡ、ＰＮＡ及蛋白质水平检测外源性ＩＬ－２基因。同时在裸鼠皮直进行致瘤及抑瘤试验。结果及结论 ＩＬ－２基因成功地整合到ＳＭＭＣ－７７２１细胞     

白细胞介素-4和γ-干扰素基因联合治疗胶质瘤

目的 探讨逆转录病毒载体介导的白细胞介素(IL)-4和γ-干扰素(IFN)基因联合治疗胶质瘤的作用。方法构建携带IL-4或IFN-γ基因的逆转录病毒载体，将其导入逆转录病毒包装细胞；将携带IL-4和IFN-γ基因的逆转录病毒包装细胞分别或联合注射到脑内荷瘤大鼠的肿瘤组织中，观察其治疗作用。结果成功获得携带治疗基因的逆转录病毒包装细胞PA317IFN-γ和PA317IL-4，所产病毒滴度分别为2x10^6cfu／ml和2．5x10^6cfu／ml。包装细胞瘤内注射能够诱导大鼠产生抗肿瘤免疫反应，杀伤肿瘤细胞，联合应用具有协同治疗作用。结论携带IL-4或IFN-γ基因的逆转录病毒包装细胞瘤内注射是一种有效的胶质瘤基因治疗方法，两者联合应用具有协同治疗作用。     

逆转录病毒转体介导的人IL—2基因在膀胱肿瘤细胞T24中的表达

报道逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ在人源性膀胱肿瘤细胞Ｔ２４中的表述，ＩＬ－２ｃＤＮＡ插入到真核表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，构建成ＩＬ－２ｃＤＮＡ的表达载体ｐＤＯＲＩＬ２，磷酸钙沉淀法将其导入Ｔ２４细胞中，经Ｇ４１８选择，转染阳性率约为２０％；原位杂交技术检测ＩＬ－２ｃＤＮＡ可转录ＩＬ－２ｍＲＮＡ，细胞培养上汪肿ＩＬ－２活性２４小时每１０＾５细胞为８－３４Ｕ／ｍｌ。表明Ｉ     

B7修饰的肝癌细胞疫苗对细胞因子产生的研究

目的 研究Ｂ７基因修饰的肝癌细胞疫苗刺激产生细胞因子（ＩＬ－２,ＴＮＦ－α和Ｇ－ＣＳＦ）的能力。方法 应用逆转录病毒载体,将Ｂ７－１,Ｂ７－２基因导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ－６细胞株中,获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆,经丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ０处理,制备肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ）,观察ＴＣＶＢ７体内外对细胞因子ＩＬ－２,ＴＮＦ－α和Ｃ－ＣＳＦ产生的影响。结果 （１）ＴＣＶＢ７体外能刺激脾细胞分泌细胞因子Ｉ     

逆转录病毒载体介导的人IL－2基因在膀胱肿瘤细胞T_（24）中的表达

报道逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ在人源性膀胱肿瘤细胞Ｔ２４中的表述，ＩＬ－２ｃＤＮＡ插入到真核表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，构建成ＩＬ－２ｃＤＮＡ的表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２，磷酸钙沉淀法将其导入Ｔ２４细胞中，经Ｇ４１８选择，转染阳性率约为２０％；原位杂交技术检测ＩＬ－２ｃＤＮＡ可转录ＩＬ－２ｍＲＮＡ，细胞培养上清中ＩＬ－２活性２４小时每１０５细胞为８～３４Ｕ／ｍ１。表明ＩＬ－２基因在Ｔ２４细胞中已表达，为研制膀胱肿瘤转基因瘤苗及开展膀胱肿瘤基因治疗打下了基础。     

原发性肝癌患者血清白细胞介素—12与外周血和癌组织中 …

目的 探讨原发性肝癌患者血清白细胞介素－１２（ＩＬ－２）与外周血和癌组织中Ｔ淋巴细胞亚群变化的规律及其相关性。方法 应用ＥＬＩＳＡ技术检测３６例原发性肝癌患者血清ＩＬ－１２水平,采用流式细胞技术检测外周血Ｔ淋巴细胞亚群,免疫组化技术检测肝癌组织中Ｔ淋巴细胞亚群分布。结果 随着肝癌的发展,肿瘤体积增大和癌栓的形成,外周血ＣＤ４＾＋细胞数目减少,ＣＤ８＾＋细胞数产多,Ｔ４／Ｔ８比值进行性下降。血清ＩＬ     

转染IL－2cDNA在膀胱肿瘤细胞表达及其生物学行为的实验研究

作者报道逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ在人源性膀胱肿瘤细胞Ｔ２４中的表达及对其生物学行为的影响。用磷酸钙沉淀法把ＩＬ－２ｃＤＮＡ转入Ｔ２４细胞，经原位杂交、免疫细胞化学和生物学活性测定，证明转染成功并表达有生物活性的ＩＬ－２，观察４０天，其分泌ＩＬ－２的量为８～３２ｕ／ｍｌ／１×１０５细胞／２４小时。转染并表达ＩＬ－２ｃＤＮＡ，对Ｔ２４的生长曲线无明显影响。但在软琼脂中细胞体积减小，裸鼠致瘤力下降     

血清IL—6,IL—10,IL—12在消化道肿瘤中的表达及其意义

目的 探讨消化道肿瘤患血清ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２的变化及其意义。方法 应用酶联免疫法测定了胃癌、结肠癌及健康血清ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２含量,比较其相互间的关系。结果 胃癌和结肠癌组ＩＬ－１０、ＩＬ－１２含量低于对照组;ＩＬ－６含量则高于对照组,且随着肿瘤临床病理分期的进展而不断升高;胃癌血清ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２含量与结肠癌接近。结论 消经道肿瘤患血清细胞因子Ｉ     

白细胞介素18对肝细胞肝癌治疗的实验研究

目的研究携带白介素 18基因的腺病毒载体包装细胞对体内肝癌生长抑制作用。方法　构建白介素 18腺病毒载体 ,并进一步通过与Ad5腺病毒DNA TPC复合物同源重组 ,制备IL 18的复制缺陷性重组腺病毒 ,并对实验性肝癌大鼠进行治疗 ,观察抗癌作用。结果IL 18的复制缺陷性重组腺病毒包装细胞肝内局部或脾内注射后抑制肝癌细胞系CBRH3 的生长 ,接种CBRH3 第 1,3天注射者长期生存 ,第 5 ,7天注射者生存期延长空白组及空载体对照组注射者均见癌灶生长 [P =0 0 0 15 ,生存时间 (2 1± 4 )d]。结论肝癌局部及脾内注射IL 18的复制缺陷性重组腺病毒包装细胞能产生有效的抗癌作用 ,早期治疗优于晚期治疗 ,脾内注射安全有效。     

pLXSN-GDNF重组载体的鉴定及其包装细胞系的建立

目的 鉴定携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line—derived neurotrophic factor，GDNF）的重组逆转录病毒载体（pLXSN—GDNF），并建立包装细胞系。方法 采用脂质体包裹法进行pLXSN—GDNF质粒PA317细胞的包装、G418抗性筛选及病毒液提取，PCR及RT—PCR进行重组逆转录病毒的鉴定，NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒滴度测定。结果 pLXSN-GDNF质粒测序结果与GeneBank中序列一致，所测DNA序列位于pLXSN多克隆位点Xho I。采用pLXSN—GDNF质粒转染包装细胞PA317，获得G418抗性细胞，RT—PCR证实其培养上清含有重组逆转录病毒，采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为10^4～10^5CFU／ml。结论 pLXSN—GDNF结构正确，GDNF基因序列完整；并成功建立了pLXSN-GDNF的包装细胞系。     

大鼠诱发肝癌模型中脾内转染IL-2和IL-12基因激活NK细胞

目的研究大鼠诱发肝癌模型中脾内直接注射携带白介素2（IL-2）和（或）白介素12（IL-12）基因的逆转录病毒包装细胞株对血IL-2和IL-12,以及NK细胞活性的影响.方法大鼠随即分为生理盐水对照组、空载体对照组、IL-12基因治疗组、IL-2基因治疗组及IL-2/IL-12联合基因治疗组.构建携带IL-2和（或）IL-12基因的逆转录病毒载体.口服二乙基亚硝胺诱癌后,含IL-2和（或）IL-12基因的包装细胞转染脾细胞.比较大鼠血IL-2和IL-12浓度、NK细胞活性、病理变化和毒性反应.结果IL基因治疗后血IL-2和IL-12明显增加.联合基因组同时表达IL-2和IL-12,总水平高于单基因治疗组.病理示治疗后肝癌组织中淋巴细胞浸润明显增多.IL治疗组NK细胞活性较对照组显著增高（P＜0.01）.联合基因组较IL单基因增高（P＜0.05）.治疗后3 d血清IL达高峰,以后逐步下降.结论脾内直接注射携带IL-2和（或）IL-12基因的逆转录包装细胞株可明显增强NK细胞活性,IL联合基因治疗优于IL单基因.     

导入FasL基因对荷肝癌裸鼠肿瘤增殖影响的实验研究

目的　对 PA 317/ Fas L - p L XSN在裸小鼠体内抗肿瘤作用及机理作进一步探讨。方法　制备 PA317/ p KXSN -Fas L +病毒上清及转 Fas L CBRH7919细胞株。 6 0只实验动物 ,随机分成 4组。收集处于对数生长期的 CBRH 7919肝癌细胞 ,A、C、D三组每只裸小鼠接种肝癌细胞于腋窝皮下。 A组 (对照组 ) :接种 5天后 ,在腋窝部肿瘤内注射生理盐水 ;B组 :接种Fas L - CBRH7919制备模型 ;C组 :实验方法同 A组 ,在腋窝部肿瘤内注射 PA 317/ p L XSN- Fas L +病毒上清 ;D组 :实验方法同 C组 ,在腋窝部肿瘤内注射 PA 317/ p L XSN空载体。肿瘤细胞接种后测量、计算肿瘤的体积 ;间接免疫荧光流式细胞仪(flowcytom eter,FCM)检测各组肿瘤组织 Fas L的表达情况。采用 PI- Annexin V方法 ,用 FCM检则各组肿瘤细胞凋亡情况。结果　观察时间为 2 0天 ,B、C组肿瘤生长受到明显抑制 ,但并未完全消退 ,且与对照组有显著差异 ;D组肿瘤生长与对照组无显著差异。 B、C组肿瘤组织中 Fas L表达显著高于 A、D组 (分别为 72 .3% ,6 8.6 % vs7.2 % ,11.3% ,P<0 .0 1) ;与此对应 ,B、C组肿瘤组织中细胞凋亡显著高于 A、D组 (分别为 30 .5 % ,31.3% vs 12 .1% ,19.4 ,P<0 .0 1)结论　采用逆转录病毒载体将Fas L基因导入裸小鼠肝癌组织 ,     

FasL逆转录病毒转移体系的建立及其在肝癌细胞中的表达

目的　研究Fas/FasL系统的生物学功能,探讨转FasL基因治疗肿瘤的可行性。方法将大鼠FasL全长cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,获得FasL正向单拷贝插入子pLXSN/FasL     

白细胞介素12基因治疗结肠癌的实验研究

目的观察携白细胞介素12(mIL-12)基因逆转录病毒载体的包装细胞(PA317-mIL-12)瘤内注射后,对肿瘤生长的抑制及对荷瘤动物生存的影响。方法在非免疫缺陷的结肠癌动物模型上分别施以化疗、放射免疫(放免)导向治疗、PA317-mIL-12基因治疗以及放免导向与IL-12基因联合治疗,比较各治疗组的肿瘤抑制效果和荷瘤动物的生存情况。结果经筛选后的携有mIL-12逆转录病毒载体包装细胞系PA317-mIL-12的上清,mIL-12浓度48h达27ng/106细胞。治疗3周后,IL-12基因治疗组(GT组)和IL-12基因与RIT联合治疗组(GT加RIT组)无论瘤体积还是瘤重量均明显低于对照组,生存率明显高于对照组(P<0.01)。结论PA317-mIL-12瘤内注射可有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤动物的生存时间。基因治疗疗效优于化疗、放免导向治疗。放免导向与IL-12基因联合治疗疗效更佳。     

脾内转染白细胞介素-2和/或12基因增强接种肝癌大鼠T细胞功能研究

目的　探讨脾内直接注射白细胞介素IL 2、12基因对血IL 2和IL 12 ,以及T细胞活性的影响。方法　构建IL 2和或IL 12基因的逆转录病毒载体。含IL 2和或IL 12基因的包装细胞于不同时间进行脾内注射转染脾细胞。比较大鼠血IL 2和IL 12浓度、T细胞活性和毒性反应。结果　IL单基因治疗后血清IL 2或IL 12明显增高。IL 2 /IL 12联合基因组中血清IL 2和IL 12增加较单基因组显著。病理示肝癌组织中淋巴细胞浸润明显增多。IL治疗组治疗后 7d ,T细胞活性较对照组显著增高 (P <0 .0 5 )。联合基因组治疗后 7d ,T细胞功能较IL单基因组增强(P <0 .0 5 )。结论　脾内直接注射IL 2和或IL 12基因可增强T细胞活性 ,IL联合基因治疗优于IL单基因。     

逆转录病毒介导单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的：观察单纯疱疹病毒－胸苷激酶（HSV－tk)／丙氧鸟苷（GCV）基因治疗系统在体内外对人胰腺癌细胞的杀伤效应。方法：构建含HSV－tk基因的重组逆转录病毒载体pDOR-tk-neo,经病毒包装细胞PA317产生重组逆转录病毒,后者将HSV－tk基因转入人胰腺癌细胞系PC－2细胞内,筛选出稳定表达HSV－tk的细胞克隆PC－2／tk。测定PC－2/tk细胞在体外对GCV的敏感性及其旁观杀伤效应PC－2／tk细胞在裸鼠皮下成瘤,观察GCV的治疗作用。结果：GCV对PC－2/tk细胞有明显的杀伤作用,且其作用呈现剂量和时间依赖性特点以及旁观杀伤效应,对母本细胞则无明显毒性。裸鼠腹腔注射GCV后对移植瘤有明显治疗作用。结论：表达HSV－tk的人胰腺癌细胞在体内外均可被GCV有效杀伤。     

DPC4/Smad4基因转染对胰腺癌细胞体外生长的抑制作用

目的 观察抑癌基因DPC4/Smad4对胰腺癌细胞生长的抑制作用。方法 将人全长DPC4/Smad4 cDNA亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN 中，分别导入包装细胞GP+E86和PA317，经G418筛选获取阳性抗性克隆。收集病毒上清液，转染至胰腺癌BxPC-3细胞；获稳定表达后，观察其对BxPC-3体外生长的抑制作用。结果 聚合酶链反应扩增证实GP+E86、PA317/ pLXSN DPC4+细胞中有外源性DPC4/Smad4 基因整合；DPC4基因转染BxPC-3细胞后，可获得稳定表达，并可显著抑制胰腺癌细胞的生长和集落形成，下调癌细胞内VEGF基因的表达。结论 将DPC4/Smad4逆转录病毒载体转染到人源性胰腺癌细胞后，可显著抑制癌细胞的生长及血管形成能力。     

HyTK基因逆转录病毒重组质粒的构建及其在PA317细胞中的高表

目的:为开展逆转录病毒介导的HyTK基因治疗恶性肿瘤奠定实验基础。方法:利用逆转录病毒载体与潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的融合基因(HyTK)连接构建重组质粒pL(HyTK)SN,应用新一代的非脂质体基因转导系统FuGENETM6将构建的pL(HyTK)SN导入Ψ2单嗜性包装细胞并获得瞬间表达,继而再转染PA317双嗜性细胞。结果:获得高滴度重组病毒,上清逆转录病毒滴度为5.4×106cfu/ml。结论:所构建的HyTK基因可用于治疗恶性肿瘤。