腺病毒和逆转录病毒载体介导外源基因导入造血细胞的研究

将LacZ基因重组于ElA、ElB缺失腺病毒载体中的SRα、EFα或CA启动子下游,应用辅助细胞(293细胞)获得非复制感染性重组病毒,测得病毒滴度为0.42×10~9PFU/ml。包装LacZ基因或GM-CSF基因的逆转录病毒载体产生细胞(CRIP)由美国Richard CM.Mullinan教授惠赠。病毒滴度为0.1-7.7×10~6PFU/ml。应用这两种病毒载体,将外源基因导入人外周血淋巴细胞、人白血病原代细胞与K562、TALL-1细胞以及小鼠白血病细胞M1与WEHI-3B细胞,探索提高基因导入效率和表达效率的试验方法,比较了两种病毒载体基因转移的特点。     

两种双标记细胞系的构建及其检测具复制能力逆转录病毒 …

本实验分别以逆转录病毒载体ＬＸＳＮ（含内启动子）和ＧＣＥＮ（含ＩＲＥＳ元件）构建了含β－半乳糖苷酶基因（ＬａｃＺ）和新霉素磷酸转移酶基因（Ｎｅｏ＾Ｒ）的两种双标记细胞系ＬＧ－３Ｔ３和ＧＣ－３Ｔ３，并观察比较了两种细胞在标记拯救实验中检测有复制能力的逆转录病毒（ＲＣＲ）的灵敏度的差异，结果表明两种细胞系均可用于标记拯救，其中ＧＧ－３Ｔ３检测ＲＣＲ的灵敏度比ＬＣ－３Ｔ３高１００倍，为提高标记拯救实验的     

PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究

逆转录病毒介导的基因转移技术要过渡到临床应用，主要解决如何使病毒载体具有高滴度而不具有复制活性．本文旨在探索建立一种合适的方法，能产生高滴度而且是安全的逆转录病毒载体。采用带有人肿瘤坏死因子基因的LXSN载体转染PA317包装细胞，建立产病毒的包装细胞株，结果表明：病毒载体滴度受包装培养液体积和胎牛血清浓度影响：包装细胞在32℃产生的病毒滴度比37℃高，而且比较稳定。产病毒包装细胞和被感染的靶细胞经PCR分析显示．被转染和被转导的细胞都有病毒基因的整合．而且包装细胞不会产生具有复制活性的逆转录病毒，因此能进一步用于临床研究．     

白血病病毒核酸,病毒蛋白和反义核酸抗逆转录病毒作用研究

过转录病毒不仅作为研究肋烟如小鼠白血病病毒（Mu。V）、R。tis肉滞病毒（RSV）和基因表达系统（如启动于、增强子、转让作用）的实验材料，而且还引起家啬、家禽的白血病如禽白皿病病毒（AI。V）、猫白血病病毒（Fel，V）等和人类T细胞白血病（IITI。V一旦和一三）．以及对人     

HIV/AIDS合并宫颈癌4例报告

0 引言 宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤,是目前世界上造成妇女死亡的主要原因之一.人类免疫缺陷病毒(HIV)的广泛流行成为全球最受瞩目的公共卫生问题和社会问题.     

有复制能力的逆转录病毒的检测

运用逆转录病毒作为外源基因导入的载体,在实际临床运用时需要检测包装细胞在表达目的基因的同时,是否会产生有复制能力的逆转录病毒。本实验运用了Marker Rescue Assay(补救分析)和RT/PCR(逆转录PCR)两种方法。补救分析可检测到6×10~2CFU/ml(Colony Forming Units/ml)的有复制能力的逆转录病毒,RT/PCR的灵敏度为1CFU/10~3ml。这两种检测方法的建立,为逆转录病毒载体用于临床基因治疗的安全性提供一定的保证。     

稳定高效的逆转录病毒转染新方法——流动转染

目前进行逆转录病毒转染细胞多采用静止的方法(static transluction),即将一定浓度的病毒液加入到长有细胞的器皿中,静止放置一定时间。但这种常规方法普遍存在的问题是①转染效率不高,最大转染效率只有58％;②转染所需的病毒上清滴度要高,否则难以达到较高的转染率;③静态转染需有一定浓度的Polybrene存在,否则转染效率极低。     

两种双标记细胞系的构建及其检测具复制能力逆转录病毒能力的比较

本实验分别以逆转录病毒载体LXSN(含内启动子)和GCEN(含IRES元件)构建了含β-半乳糖苷酶基因(LacZ)和新霉素磷酸转移酶基因(Neo~R)的两种双标记细胞系LG-3T3和GG-3T3,并观察比较了两种细胞在标记拯救实验中检测有复制能力的逆转录病毒(RCR)的灵敏度的差异,结果表明两种细胞系均可用于标记拯救,其中GG-3T3检测RCR的灵敏度比LG-3T3高100倍,为提高标记拯救实验的准确性打下了一定的基础.     

阻断致瘤病毒复制的抗肿瘤药物筛选策略

许多病毒与人类恶性肿瘤的发生有关，阻断病毒与靶细胞的结合和融合、干扰病毒的复制和表达，抑制与病毒复制有关的酶等多个环节，将为抗肿瘤药物的筛选提供相关策略。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因联合5—氟胞嘧啶治疗胃癌的实验研究

目的 观察自杀基因CD对小鼠胃癌的体内外杀伤作用及组织病理变化。方法 应用逆转录病毒方法转导自杀基因CD,通过体外实验观察CD基因对小鼠胃癌MFC细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在615小鼠建立胃癌模型,然后分组将病毒上清注入瘤体内,并应用前药（5－氟胞嘧啶,5－Fc),观察对肿瘤的杀伤作用及组织病理变化。结果 CD基因在体外即显出明显的杀伤作用,20％的转基因细胞可以杀伤70％－80％以上的肿瘤细胞。体内实验表明CD基因结合前药5－Fc可显著杀伤肿瘤,而单纯转导CD基因或应用5－Fc可显著杀伤肿瘤,而单纯转导CD基因或应用5－Fc并不能起到杀伤作用。结论 自杀基因CD联合前药5－Fc对体内外小鼠胃癌细胞产生显著杀伤作用,不仅转基因细胞被杀死,而且通过旁观者效应杀伤大量周围细胞。     

白血病病毒病因的现代观

20世纪70年代,已有研究证明逆转录病毒可诱发动物白血病,后续研究发现人类基因组有大量内源性逆转录病毒,但是仅在局部地区有逆转录病毒相关的成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia,ATL）流行。近年来,对APOBEC3（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3）成员的深入研究阐释了人类对逆转录病毒诱发白血病的抵御机制。EB病毒（Ep-stein-Barr virus,EBV）在人群中广泛传播,以隐性感染形式长期存在于体内,与部分淋巴瘤的发生、发展密切相关,部分实体瘤也与EBV相关,表明其致瘤性。其他病毒感染与人类白血病/淋巴瘤发生、发展的关系,部分可能通过复杂、曲折的网络关系间接相关,大部分还有待于进一步的深入研究。      

CD基因联合 5-Fc治疗人胃癌的实验研究

目的：通过 转基因方法观察自杀基因CD对人胃癌细胞株7901的体内外 杀伤作用,并观察组织病理变化。方法：应用逆转录病毒方法转导自杀基因CD,通过体外实验观察CD 基因对人胃癌7901细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在BALB／cnu/nu裸鼠建立胃癌模型,然后将病毒上清注入瘤体内,并结合应用前药,观察肿上瘤体积变化,通过病理切片观察组织病理变化。结果：CD基因在外外即显出明显的杀伤作用（含旁观者效应）,20％的转基因细胞可以杀伤70％－80％的肿瘤细胞。在实验动物体内,CD基因结合前药5－Fc可显著杀伤肿瘤,而单纯转导CD基因和只用5－Fc并不能起到杀伤作用。结论：自杀基因CD联合前药5－Fc对胃癌产生显著杀伤作用,不仅转基因细胞被杀死,而且通过旁观者效应杀伤大量周围细胞。CD／5－Fe在体内试验对胃癌有显著杀伤作用。     

浆母细胞淋巴瘤的临床病理特征的研究

目的:浆母细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤的一个罕见亚类.我国对浆母细胞淋巴瘤的报道多为个案报道,缺乏对其共性的研究.为了探求我国浆母细胞淋巴瘤的临床病理特征,我们进行了本次研究.方法:对10例浆母细胞淋巴瘤进行临床资料分析,免疫组化法检测免疫表型,原位杂交法检测EB病毒感染情况,用原位荧光杂交法检测MYC基因的易位和扩增.结果:浆母细胞淋巴瘤多发生于结外器官,发现时即为临床晚期,生存期短;其发病和HIV感染或免疫抑制无明显相关性.其EB病毒感染率为50％.免疫组化结果不常具有B淋巴细胞标记,但生发中心后表型常为阳性.MYC易位发生率为10％,扩增的发生率为10％.结论:我国浆母细胞淋巴瘤多发生于免疫状态正常的患者.HIV感染鲜有阳性,EBV感染率略低,存在MYC基因异常但发生率较低(约20％),但其高度侵袭性的淋巴瘤的特性、病理形态特征、免疫表型和临床表现与西方报道相似.     

CAR-T细胞产品中病毒载体生产的研发进展和审评考虑

[摘要] 嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T, CAR-T）细胞疗法因在血液肿瘤中的突出疗效已成为肿瘤细胞免疫治疗领域中新的研发热点。作为CAR-T 细胞生产关键原材料的病毒载体,在CAR基因结构设计、生产工艺的精细化、质量控制和标准的设定等方面与CAR-T细胞产品的安全性、有效性和质量的可控性密切相关。本文根据慢病毒和γ-逆转录病毒载体的研发进展,结合审评体会,对病毒载体研发和生产过程中需要重点关注的几个常见问题进行讨论,希望能为未来国内相关产品的研发、上市提供参考。     

携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用

目的 :探讨表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 ,对人膀胱癌细胞生长及细胞周期调控的作用。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,构建表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ AS ;分别转染膀胱癌细胞株EJ ,观察不同载体对膀胱癌细胞体外增殖、克隆形成和细胞周期时相的影响。结果 :pRevTβ、pRevTβ AS载体病毒滴度分别为 0 84、0 88× 10 5CFU/ml,对EJ细胞的整合率为10 0 % ,并有效表达 ;抑制TGFβ1表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率 ,同时出现G0 /G1期细胞比例增高和S期细胞比例降低。结论 :携TGFβ1反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体可以下调EJ细胞内源性TGFβ1表达 ,诱导肿瘤细胞G1期阻滞 ,抑制肿瘤细胞体外生长增殖。     

基因治疗载体的研究进展

载体携带目的基因的靶向高效表达是基因治疗成功的关键。基因治疗载体的研究从逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒等病毒载体发展到如今还处在研究阶段的人工染色体载体、细菌载体等，其中病毒载体又新出现了牛痘病毒、杆状病毒、EB病毒、水疱性口炎病毒、人巨细胞病毒、肝炎病毒以及杂交体病毒载体等。但是现有的载体都还不能达到长期稳定表达外源基因的目的，还需要对现有载体做进一步的改进或开发出新的载体。     

Epstein—Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系

应用非同位素原位杂交和图像分析法，研究鼻咽癌和慢性鼻咽炎活检标本中，Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）ＤＮＡ的分布以及ＥＢ病毒潜伏基因ＢＮＬＦ１和ＢａｍＨ１Ｗ序列的表达。结果显示，高拷贝数的ＥＢ病毒基因组和ＢａｍＨ１Ｗ序列的表达，后者与ＥＢ病毒核抗原１的转录和病毒复制的启动有关，几乎都发生于低分化或未分化鼻咽癌。此外，潜伏基因ＢＮＬＦ１的转录产物即ＬＭＰｍＲＮＡ，在非典型增生的鼻咽上皮中也有表达。以上结果提示，ＥＢＶ游离体的大量复制发生于鼻咽癌演进过程，可能由于低分化或未分化鼻咽癌中病毒启动子的激活；ＬＭＰ的不适当表达可能具有启动鼻咽上皮细胞异型增生的作用。     

HIV感染女性发生宫颈癌的常见临床影响因素分析

目的 探讨人类免疫缺陷病毒( HIV) 感染女性发生宫颈癌的常见临床影响因素。方法 收集 60 例 HIV/AIDS 合并宫颈癌患者的临床资料,匹配年龄相同或相近、同期住院的 HIV 感染的非肿瘤女性患者 60 例,分析宫颈癌组的临床特点,比较两组常见的临床指标差异。根据是否人乳头瘤病毒( HPV) 感染,将合并 HIV 感染的宫颈癌患者分为 HPV 感染组和未感染组,比较两组的年龄、肿瘤病理类型、宫颈上皮内瘤变和肿瘤分期,分析 HPV 感染的影响因素。结果 合并 HIV 感染的宫颈癌以鳞癌居多,Ⅰ期占 45. 0%,Ⅱ期占 41. 7%,HPV 感染率为 50. 0%,感染的基因型主要为高危 16 型,占 53. 3%。单因素 Logistic 回归分析显示,HIV/AIDS 组与宫颈癌组在 HIV 感染时间、HIV-RNA 阳性率、抗病毒治疗、传播途径、CD3⁺、CD4⁺和 CD4⁺/ CD8⁺比值的差异均有统计学意义( P<0. 05) ; 多因素 Logistic 回归分析显示,CD4...     

逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用研究

目的 观察逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用，探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染Raji淋巴瘤细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的Raji/CD tk细胞株。采用RT-PCR法检测双自杀基因的表达。MTT法测定转基因组及末转基因组Raji细胞的存活率。结果 双自杀基因在Raji细胞中可稳定表达，联合使用5-氟胞咳暖(5-FC)和无环鸟苷(QCV)对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论 逆转录病毒介导双自杀基因较单一自杀基因具有更强的杀伤作用。