PTEN在胚胎早期心脏发育过程中作用的研究

目的 胚胎早期原肠胚形成期PTEN表达在原条及其而后发生的中胚层组织,本实验通过过表达PTEN探讨其在早期心脏发生发育过程的作用和意义。方法 《改良滤纸鸡胚胎整体培养法》取胚,37℃孵箱孵育待其发育到HH4期,对鸡胚心肌干细胞（Cardiac Stem Cell）进行PTEN电转染,转染成功后一部分鸡胚37℃孵箱继续培养30 h,待其发育形成心管,观察过表达PTEN对心管发生的影响;另一部分鸡胚在超净台内完成心肌干细胞的离体,体外培养使其分化发育成心肌组织[1],主要研究PTEN在细胞增殖、分化和凋亡过程中的作用。结果 30 h后鸡胚整体的免疫组织化学（N-cadherin）结果显示,PTEN-WT组和PTEN-G129E组鸡胚心管出现了反向环化、多囊化等畸形,GFP组和PTEN-C124S组心管发育受到的影响较小;转染后离体培养得到的心肌组织的跳动频率与GFP组下降的速度加快,且维持时间缩短,GFP组与PTEN-WT组有显著差异（P<0.05）,PTEN-WT组与PTEN-C124S组、PTEN-G129E组无显著差异（P＞0.05）。结论 PTEN蛋白酯酶可能参与早期胚胎心肌干细胞之间的粘附分子的表达从而调节细胞迁移、分化发育,并加速了心肌组织的衰老。     

胚胎心肌干细胞体外的分化

目的 鸡胚原肠胚形成期含有心肌干细胞(cardiac stem cell, CSC)的生心区原条组织离体后体外培养,使其增殖分化成具有舒缩功能的心肌组织.方法 改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育,待胚胎发育到原肠胚的HH4期,无菌环境内选择性离体胚胎生心区原条组织(原条组织的前25%～40%)于10%FBS DMEM-F12培养基中培养,2～5 d后得到局部跳动的细胞组织,通过原位杂交、免疫组织化学、DiI示踪和细胞的超微结构鉴定是否分化为心肌组织.结果 FGF8特异性表达于心管和神经管;N-cadherin特异性表达于心管、神经管和体节;DiI标记的细胞迁移参与心管的形成;细胞的超微结构显示心肌组织特有的结构--闰盘.结论 CSC体外培养可以定向分化发育成心肌组织,为进一步研究心肌细胞的发育分化和生理药理学实验提供了良好的平台.     

胚胎心肌干细胞体外的分化※

目的鸡胚原肠胚形成期含有心肌干细胞（cardiac stem cell, CSC）的生心区原条组织离体后体外培养,使其增殖分化成具有舒缩功能的心肌组织。方法 改良滤纸鸡胚胎整体培养法取胚,37℃孵箱孵育,待胚胎发育到原肠胚的HH4期,无菌环境内选择性离体胚胎生心区原条组织（原条组织的前25%～40%）于10%FBS DMEM-F12培养基中培养,2 ～5 d后得到局部跳动的细胞组织,通过原位杂交、免疫组织化学、DiI示踪和细胞的超微结构鉴定是否分化为心肌组织。结果 FGF8特异性表达于心管和神经管;N-cadherin特异性表达于心管、神经管和体节;DiI标记的细胞迁移参与心管的形成;细胞的超微结构显示心肌组织特有的结构--闰盘。结论 CSC体外培养可以定向分化发育成心肌组织,为进一步研究心肌细胞的发育分化和生理药理学实验提供了良好的平台。     

Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

目的研究Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用。方法实验组以二甲基亚砜（DMSO）作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt8a的表达,对比分化率。结果两组在分化第2,3,4天Wnt8a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为92.22%,对照组分化率为37.78%,差异性具有统计学意义。结论Wnt8a促进小鼠胚胎心肌分化。     

PTEN基因在小鼠胚胎着床过程中作用的实验研究

目的探讨PTEN基因小鼠胚胎着床过程中的作用。方法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluores-cence quantitativePCR,FQ-PCR)分别检测未孕及孕1、3、4、5、7d(分别记为d0、d1、d3、d4、d5、d7)小鼠子宫内膜PTEN基因mRNA的表达和子宫角注射反义寡核苷酸观察胚泡着床数。结果FQ-PCR测得妊娠的子宫内膜组织PTEN的表达高于未妊娠的子宫内膜组织,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐增加的趋势,到妊娠第5天达到最高。子宫角注射PTEN反义寡核苷酸后胚泡着床数明显减少。结论PTEN在妊娠早期子宫内膜持续表达,可能参与了胚泡着床。     

MicroRNAs在心脏发育及心血管疾病中的作用研究进展

MicroRNA(miRNA)是长21～25 nt内源性非编码小分子RNA,在基因转录和表达调控等方面发挥重要作用,近些年来一直是医学研究的热点之一。miRNA具有多种生物学作用,与某些疾病的发生、发展关系密切,对细胞的分化、增殖、凋亡、血管生成、个体发育及机体代谢等都具有重要作用。最近研究发现,miRNA参与了心脏发育、心肌肥厚、心肌纤维化、心律失常和血管病变等的生理病理过程。结合国内外研究进展,该文就miRNA在心血管系统生理病理过程中的作用予以综述。     

父本表观基因组在早期胚胎发育过程中的功能作用

胚胎发育是一个复杂的动态变化过程,频繁改变的基因表达最终导致细胞分化和各种细胞系的形成。这些改变由特定细胞中表观遗传因子所调控。一直以来,人们认为父本表观基因组在胚胎发育中的作用范围很局限。然而,近期精子发生过程中表观遗传修饰的研究显示父本表观基因组在早期胚胎发育过程中具有重要作用。任一表观遗传标记建立和（或）维持的轻微异常均会影响早期胚胎发育过程。现主要综述DNA甲基化和组蛋白修饰的功能作用,阐明了其在胚胎发育和男性不育中的作用机制,为胚胎植入前遗传学诊断提供一些基础材料。     

PTEN在骨形态发生蛋白9诱导小鼠胚胎成纤细胞骨向分化中的作用

目的 研究PTEN对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化的影响,并分析PTEN调节BMP9功能的可能机制.方法 采用定量PCR检测PTEN在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达,分析在MEFs中BMP9对PTEN表达的影响.采用组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,PCR检测OPN和OCN的表达水平,茜素红染色检测钙盐沉积,分析PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化的影响;利用荧光素酶报告质粒和蛋白印迹等方法分析PTEN对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)/Smads信号转导的影响.结果 PTEN在几种常见MSCs中均有表达;BMP9在MEFs中明显抑制PTEN的表达.抑制PTEN能促进BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但过表达PTEN对BMP9诱导MEFs的ALP活性有明显抑制作用.抑制PTEN明显促进BMP9在MEFs细胞中诱导的OCN表达,并增强钙盐沉积.报告质粒分析结果显示,抑制PTEN能明显增强BMPR-Smad报告质粒的转录活性,并增加Smad1/5/8的磷酸化水平.结论 下调PTEN表达可能是BMP9诱导MEFs成骨分化重要途径之一,其机制可能与促进BMPs/Smads信号转导有关.     

nesprins基因在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达

目的:探讨nesprins基因在小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)分化为心肌细胞过程中的表达及作用.方法:体外培养小鼠ESC,采用5-氮杂胞苷为诱导剂诱导ESC分化为心肌细胞,并进行心肌细胞鉴定;RT-PCR检测分化过程中各时间点(d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20)nesprin-1、nesprin-2基因mRNA的表达;免疫荧光检测各时间点nesprin-1蛋白的细胞定位.结果:nesprin-1、nesprin-2基因mRNA在ESC分化为心肌细胞过程中均有表达;nesprin-l基因mRNA在d7、d7+3、d7+6均表达较高,无显著性差异,随后表达呈下降趋势,在d7+20时表达最低(P＜0.05);nesprin-2基因mRNA在d7时表达最高,与d7+3、d7+6组间均有显著性差异(P＜0.05),且随着分化时间的延长表达逐渐下降,在d7+20时表达最低;nesprin-1蛋白在ESC分化过程中均有表达,定位于核被膜及核周间隙.结论:nesprin-1、nesprin-2基因表达高峰在生心细胞的诱导和特化时期,推测nesprins对维持心肌细胞发育,使ESC更完全的向心肌细胞分化起重要作用.     

抑癌基因PTEN在子宫内膜异位症发生发展中的作用

目的:检测第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)在子宫内膜异位症(EMS)中的表达,探讨其在EMS发病机制中的作用. 方法: 收集EMS患者子宫内膜病灶37(卵巢巧克力囊肿20,子宫肌腺症17)例和正常子宫内膜33例,采用原位杂交技术检测PTEN mRNA在异位内膜组织中的定位和表达强度,并比较PTEN基因表达与EMS临床分型的关系. 结果: PTEN mRNA主要表达于腺体细胞的胞质中;与正常子宫内膜相比,PTEN基因在异位内膜组织中的表达显著降低(48.6% vs 93.9%, P=0.0002);PTEN mRNA的表达呈明显的周期性改变,在增殖期内膜呈低水平表达,分泌期表达增加,但这一差异仅在正常子宫内膜组织中有意义(P=0.0102);PTEN mRNA的表达水平随临床分期的增加而降低(P=0.0026);但在子宫肌腺症和卵巢巧克力囊肿组织中,PTEN基因表达水平无差异(55.0% vs 52.9%, P=0.4018). 结论: PTEN mRNA表达水平的降低可能是EMS的发病机制之一.     

人类胚胎干细胞向造血细胞的自发分化

目的 研究人类胚胎干细胞自发向造血分化过程中造血干细胞和成熟血细胞标志出现时间,这将为胚胎干细胞定向诱导分化提供依据.方法 将我所建立的人类胚胎干细胞系(chESC3)自发分化形成拟胚体,RT-PCR方法检测不同时间点造血相关基因KDR、Bmil、Scl、gata2等的表达、流式细胞术检测6、8、10、12 d造血干细胞标志CD34表达,并通过造血集落培养方法检测这些时间点造血集落形成能力,最后将拟胚体制备石蜡切片,免疫细胞化学检测10、12、15、18 dCD45阳性阳性细胞数.结果 造血干细胞早期基因KDR、Bmil在hESCs中有表达,同时该基因随着拟胚体培养时间的延长,在第4～6天开始上调表达;造血干细胞标志性基因Scl,gata2在6～8 d开始表达,并且维持高表达到12 d.流式细胞术检测不同时间点hEBs中CD34阳性细胞数,发现其随时间的延长有增多的趋势,6、8、10、12 d分别为(1.4±0.4)%、(3.4±1.3)%、(5.5±2.2)%、(5.1%±1.7)%;6、8、10、12 d的拟胚体细胞进行集落培养检测形成的集落数在每105个拟胚体细胞中分别为0、7±2、37±11、89±29,P<0.01;集落细胞表达CD45,瑞士吉姆撒染色,可以检测到分叶核粒细胞;免疫细胞化学法对10、12、15、18 d拟胚体进行切片染色,发现在这4 d中可以明显观察到CD45阳性细胞的出现,并随时间的延长而数量增多,分别为:0、40.5±15.09、178.6±55.89、253.0±52.04,P<0.05.结论 在自发向造血细胞分化的过程中经历了 3个阶段:hESCs向胚层特异性细胞分化(前6～8 d);造血干祖细胞扩增期(第8～12天);成熟血细胞大量出现期(15 d以后).     

干细胞移植心肌再生及其细胞因子分泌研究进展

干细胞具有多向分化的潜能,可以被诱导分化成心肌细胞,代替心肌梗死后死亡的心肌细胞,改善心功能,并且干细胞能分泌一些细胞因子,它们通过增加血管密度、减少心肌重构、防止细胞凋亡等在提高心功能上发挥了重要的作用。     

Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro

Objective To investigate an method for hepatic differentiation from embryonic stem cells (ES cells) in vitro and the resulting differentiation ratio, in order to develop a procedure for producing a new type of hepatocyte for hepatocyte replacement therapy in the treament of liver failure.Methods ES cells from Balb/C mice were cultured and maintained in an undifferentiated state in gelatin-coated dishes using Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 1000 U/ml leukemia inhibitory factor (LIF). Then, LIF was withdrawn from the DMEM to allow the ES cells to develop into embryonic bodies (EBs). EBs were plated onto tissue culture dishes, and growth factors such as acidicfibroblast growth factor (aFGF) and hepatocyte growth factor (HGF) were added to the medium to promote directional differentiation. The course of development and differentiation was observed dynamically using an inversion microscope. The expression of hepatic proteins, such as α-fetoprotein (AFP), albumin (ALB), cytokeratin 8 (CK8), cytokeratin 18 (CK18), in cytoplasm was analyzed by immunocytochemistry (ICC). The concentration of ALB in the medium was determined dynamically by radioimmunoassay (RIA). Results ES cells replicated as clones, without differentiating, in DMEM containing LIF. They developed into EBs in medium without LIF. Our ICC assay showed that differentiating cells did not express hepatic proteins, such as AFP, ALB, CK8, and CK18 until day 7, day 9, day 11, and day 11, respectively (up to 2 days later when growth factors are not present). The concentration of AFP in the medium was first detected on day 8, at a concentration of 3.4 ng/ml, and increased to 22.8 ng/ml by day 15. The concentration of ALB in the medium was 0.2 μg/ml on day 11, and increased to 2.2 μg/ml by day 15. ALB-positive cells under ICC manifest morphological structures were consistent with normal mouse hepatocytes. The differentiation ratio of hepatocytes in the ES cell differentiation system was 30％ on day 15 (significantly lower without the presence of growth factors).Conclusions ES cells can differentiate into mature hepatocytes. Growth factors, such as aFGF and HGF, can enhance this differentiation and produce sufficient numbers of functional hepatocytes. This method may be a reliable new way of differentiating ES cells into hepatocytes for use in replacement therapy in the treament of liver failure.     

胎儿肝脏间充质干细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

目的:研究来源于胎儿肝脏的间充质干细胞(FMSCs)移植到大鼠心肌梗死模型中的存活及分化情况.方法:从平均胎龄为9周的胎儿肝脏中分离培养出FMSCs,将该细胞移植到大鼠梗死心脏模型中,分别于移植后第7及第14天时取出心脏,通过荧光原位杂交及免疫组化的方法检测移植细胞的存活及心肌分化情况.结果:FMSCs具有稳定的抗原表达谱,阳性表达CD29、CD44、CD166、CD105、SH3、SH4,不表达造血干细胞表面标志抗原如CD14、CD34、CD45.荧光原位杂交显示,将细胞移植到大鼠心肌梗死模型中7天后,有较多细胞在心肌组织中存活;但至移植后第14天,移植细胞从心肌组织中消失.免疫组化染色未发现存活的植入细胞发生向心肌方向的分化.结论:本实验成功分离培养出了FMSCs,将其移植到梗死心肌模型中能短暂存活,但不发生向心肌方向的分化.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

Differentiation of rat embryonic neural stem cells promoted by co-cultured Schwann cells

Objective To explore the factors which induce differentiation of embryonic neural stem cells. Methods Rat embryonic neural stem cells were co-cultured with newborn rat Schwann cells in serum-free medium. The phenotype and specific-markers including tubulin-β, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and galactorcerebroside (GalC), were domonstrated by phase contrast microscopy and double immunofluorescence staining. Results Overall, 80%±5% of neural stem cells protruded several elongated processes and expressed tubulin-β antigen at high levels, while 20±3% of them protruded several short processes and were GalC or GFAP positive. Conclusion The factors secreted by Schwann cells could induce rat embryonic neural stem cell to differentiate.     

胚胎干细胞研究进展

近年来,胚胎干细胞(ES细胞)因其自身的许多特性成为生命科学的研究重点。ES细胞能够自我更新和多向分化的生物学特性,具有重要的医学价值,在基因治疗、组织工程学、药学研究等许多领域都具有广泛的应用。本文就ES细胞的生物学特性、培养因素及主要研究领域的最新进展、研究存在的问题作一概述。     

实现人类心肌的再生：干细胞的风雨路

如何实现人类心肌的再生,科研工作者和临床医生已经为之努力了近一个世纪。1953 年,实施了第一例室间隔缺 损修复手术,1967 年第一例心脏移植成功,2002 年骨髓来源的细胞首次移植到心肌内,使心肌的修复取得重大进步。然 而慢性心力衰竭仍是世界范围内的难题。为什么实现心肌的再生面临巨大的挑战？要实现心肌的再生还有多远？细胞移 植技术近年已取得突飞猛进的进步,许多大型动物实验结果带来了曙光和挑战。将对心肌再生的历史和临床研究进行探 讨,对干细胞的实施和目前正在进行的实验进行综述。