肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺样毒素A亚单位(Shiga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westen blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2a基因约950bp;原核表达质粒pET-11c(+)-stx2a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%.结论EHEC O157:H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157:H7菌的感染机制奠定基础.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot(WB)分析重组蛋白生物活性。结果:PCR扩增stx2b基因约220 bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应。结论:成功克隆EHEC O157∶H7stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157∶H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础。     

EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 将叠氮溴化乙锭 （ethidium monoazide bromide,EMA）与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法。方法 以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化。结果 不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的最大EMA浓度为10 μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的最小EMA浓度为0.5 μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1%的活菌。结论 EMA-PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺毒素ⅡA1亚单位单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定

目的制备出高效价的抗志贺毒素ⅡA1亚单位(STX2A1)的单克隆抗体。方法以重组GST-STX2A1融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用细胞杂交瘤技术制备,以天然STX2毒素为筛选抗原,采用间接ELISA法筛选产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株;以体内诱生法产生腹水,并采用Protein A-Sepharose柱对其纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类,采用间接ELISA相加实验鉴定抗原识别表位。结果获得3株产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株STX2-1A3、STX2-1E10、STX2-3A7,Ig亚类分别为IgG1λ型、IgG1κ型和IgG3κ,亲和力常数分别为5.76×109、1.21×109和3.97×108。结论成功制备3株稳定分泌抗STX2A1的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体特异性好,亲和力高,能与天然STX2A亚单位反应。     

用RAPD技术分析出血性大肠杆菌O157∶H7

目的应用RAPD技术分析肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DNA多态性并对其分型.方法用两条10bp的随机引物对3株肠出血性大肠杆菌O157∶H7和3株其它病原性大肠艾希氏菌进行扩增,扩增产物经凝胶电泳后得到指纹图.结果共得到12个不同的DNA指纹图谱,经统计软件SPSS系统聚类分析得到两个不同的分类树状图.结论 RAPD技术方法简便、快速、分辨力高,在肠出血性大肠杆菌O157:H7分子流行病学研究中有较大的应用前景.     

肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻

肠出血性大肠杆菌 (ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＥ .Ｃｏｌｉ,ＥＨＥＣ)因其引起出血性肠炎 (ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｃｏｌｉｔｉｓ,ＨＣ)而得名 ,Ｏ1 5 7∶Ｈ7是最主要的血清型之一 ,其它血清型还包括Ｏ2 6∶Ｈ1 1、Ｏ1 1 1∶Ｈ8等十余种。Ｏ1 5 7∶Ｈ7是目前与ＨＣ及溶血性尿毒综合征 (ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｒｅｍｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ,ＨＵＳ)有关的主要病原菌。该菌主要通过食物传播[1] 。 1 982年首次在美国爆发ＨＣ中分离出病原菌以来 ,在发达国家已发生多次流行 ,主要分布在北欧、日本、加拿大、美国等地 ,年发生人数为 8/1…     

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的研究进展

ＷＨＯ不久前指出在过去的 2 0年里 ,世界上出现了大约 30种新的传染病 ,1982年美国首次报告的Ｏ15 7:Ｈ7大肠埃希氏菌 (ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ15 7:Ｈ7)引起的出血性肠炎即是其中之一。肠出血性大肠埃希氏菌 (Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒ ｈａｇｉｃＥ .Ｃｏｌｉ,ＥＨＥＣ)是大肠埃希氏菌众多血清型中非常重要的一组 ,其中目前公认的能引起人血性腹泻的血清型有Ｏ15 7:Ｈ7、Ｏ2 6 :Ｈ11、Ｏ111:Ｈ8等 ,而Ｏ15 7:Ｈ7则是其主要的血清型[1] 。近年来 ,ＥＨＥＣ感染已成为世界性卫生问题。由Ｏ15 7:Ｈ7引起的食物中毒的暴发流行在发…     

检出山梨醇阳性肠出血性大肠杆菌O157:H7一例及特征分析

目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7(entro-hemorrhaguc E.Coli O157:H7 or EHEC O157:H7)是具有强致病力的条件致病菌,该菌可通过污染的食物、水、以及直接接触感染的人或动物而感染。加强对该菌的检验,对预防与控制由该菌所致的感染流行十分重要。方法:本文参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0973-2000方法进行检验。结果:从进口冻猪肚中检出一例EHEC O157:H7,并用PCR方法检测VERO毒素呈阳性。结论:该菌株的生化特征与相关文献报道的EHEC O157:H7生化特征不同的是山梨醇阳性,棉籽糖阴性,检验过程中应慎重鉴别。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7对抗生素敏感性的研究

目的 了解和掌握O157：H7大肠杆菌对抗生素的敏感性,以便选择防治O157：H7大肠杆菌感染的药物,方法 按照NCCLS药敏试验法,选用MH平板,参照改良K－B法药敏试验判断标准进行结果判定。结果 对选择的29种药物,其中21种为敏感,4种为耐药。结论 肠出血性大肠杆菌O157：H7对大多数抗生素敏感。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质.方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx28的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E. coli BL-21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot (WB)分析重组蛋白生物活性.结果:PCR扩增stx2b基因约220bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应.结论:成功克隆EHEC O157:H7 stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157:H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础.     

出血性大肠杆菌O157：H7 vero细胞毒素抗体的保护性研究

目的:在体外研究vero细胞毒素抗体的保护作用。方法:用从出血性大肠杆菌O157:H7中纯化的一种新的vero细胞毒素来免疫家兔,获得多克隆抗体。用不同剂量抗体,在不同时间段与此vero细胞毒素进行vero细胞毒性试验。结果:高剂量的抗体预先处理过的vero细胞,可以受到抗体保护,毒素的细胞毒作用被抑制。预先用毒素作用vero细胞后,一小时内给予大剂量抗体可以部分抑制毒素的细胞毒作用。结论:本试验提示用抗毒素紧急预防和治疗Vero细胞毒素引起的疾病是可行的。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7流行病学调查

目的 了解芜湖县动物宿主携带肠出血性大肠杆菌P157：H7的情况，为防治工作提供依据。方法选择芜湖县境内家畜粪便、水样以及各类养殖场饲料等标本821份，以免疫磁珠法和血清学方法检测EHEC0157：H7。结果821份标本检出1株EHEC O157：H7，检出率为0．12％。结论芜湖县部分动物携带EHEC O157：H7。     

江苏省建湖地区肠出血性大肠杆菌O157：H7监测分析

目的 了解建湖地区腹泻患者肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染情况,家禽、家畜O157∶H7带菌情况,水源水中O157∶H7污染情况. 方法 在2008年5月-9月采集腹泻患者和家禽、家畜的粪便以及水源水、肉制品、苍蝇等标本计836份,应用免疫磁珠浓集、山梨醇麦康凯琼脂(SMAC)分离、生化和血清学反应进行鉴定.结果 共检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7 阳性标本17份,其中腹泻患者阳性率为1.15%,4种动物粪便、肉制品均检出阳性标本,但水、苍蝇标本中均未检出阳性.菌株对青霉素耐药性最高,达100%,对其他受试抗生素均敏感.结论 该地区腹泻患者和家禽、家畜中存在肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染,且具潜在的流行性危险.     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7黏附HeLa细胞模型的建立

目的 建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础.方法 以细菌黏附HeLa细胞数量为指标,分别评价细菌数量、细菌与细胞孵育时间对细菌黏附数量的影响,得到最佳条件,最后肌动蛋白荧光染色(FAS)试验鉴定模型.结果 加入细菌为1×105 CFU,细菌与细胞孵育4 h时,黏附细胞的数量最佳,FAS检测发现该条件下细菌能够引起细胞特异性黏附、擦拭(attaching & effacing, A/E) 损伤,模型建立成功.结论 成功建立O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制提供了条件.     

用RAPD技术分析出血性大肠杆菌O157：H7

目的 应用RAPD技术分析肠出血性大肠杆菌O157：H7 DNA多态性并对其分型。方法 用两条10bp的随机引物对3株肠出血性大肠杆菌O157：H7和3株其它病原性大肠艾希氏菌进行扩增，扩增产物经凝胶电泳后得到指纹图。结果 共得到12个不同的DNA指纹图谱，经统计软件SPSS系统聚类分析得到两个不同的分类树状图。结论 RAPD技术方法简便、快速、分辨力高，在肠出血性大肠杆菌O157：H7分子流行病学研究中有较大的应用前景。     

细菌性痢疾和O157:H7出血性大肠杆菌混合感染一例

患者女性 ,19岁 ,于 2 0 0 1年 4月 30日从学校返回家乡农村。 5月 2日开始腹泻 ,6日出现腹痛 ,当日返校后腹痛加重 ,每日腹泻 3～ 6次 ,同时伴有发热 ,恶心和呕吐。 5月 8日在学校医务室输液治疗后未见好转 ,体温升高到 39 5℃ ,腹痛加剧。 9日校医将患者转入当地县人民医院治疗 ,同时作为疑似Ｏ15 7:Ｈ7病例报告了当地县卫生防疫站 ,因为患者出现血便 ,当地卫生防疫站马上到病房采取了患者的粪便 ,送到河南省疾病控制中心实验室化验。经一系列微生物病原菌分离、鉴定和分子生物学试验确认 ,这是一例Ｏ15 7:Ｈ7出血性大肠杆菌和细菌性痢疾…