生长因子FGF在颅缝细胞培养中作用的研究

目的:研究生长因子FGF在颅缝闭合中的调控作用.方法:以颅缝早闭动物模型(SD鼠)的颅缝为研究模型,采用细胞生物学技术、组织化学技术,研究颅缝闭合期间,生长因子bFGF作用下,细胞胶原及骨钙素分泌情况;观察生长因子bFGF,对分离培养的颅缝细胞增殖与代谢影响.结果:在大鼠颅缝分离培养细胞中,bFGF促进颅缝分离培养细胞分泌胶原、骨钙素,加快细胞增殖生长曲线平台期出现,并有效促进大鼠颅缝分离培养细胞S期增殖(p＜0.05).结论:在体外器官培养中,bFGF能促进大鼠分离培养颅缝细胞的活性(p＜0.05).     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。     

支持细胞体外培养研究进展

总结了支持细胞 (Sertolicell,Sc)原代培养的 3种方法 :Sc分离培养、生殖细胞 Sc共培养及组织培养 (器官培养 )。采用胰蛋白酶、胶原酶及透明质酸酶等消化方法从动物睾丸分离Sc ,将纯化的Sc平铺在Matrigel包被的培养皿中作体外原代培养 ,培养基通常为 1∶1(vol/vol)无血清Ham sF12营养液和Dulbecco改良Eagle培养基 (DulbeccomodifiedEaglemedium ,DMEM) (F12 /DMEM)。培养条件 :5 %CO2 、35℃。生殖细胞 Sc共培养可模拟体内精子发生的微环境 ,用于研究生殖细胞与Sc之间的相互作用。同时也总结通过转基因动物建立的永生Sc株 ,该细胞具有与真正Sc一样的某些特征     

Percoll法分离犬骨髓单个核细胞与体外成骨诱导培养的实验研究

目的建立犬骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMNCs)的分离培养、体外扩增和成骨诱导方法,为骨缺损的修复提供理想的骨组织工程种子细胞。方法用1.063g/ml percoll液分离2.5ml Beagle犬骨髓,利用细胞贴壁筛选法进行分离、培养、扩增和成骨诱导。结果采用1.063g/ml percoll液可获得纯度较高的BMNCs,接种细胞生长良好,平均倍增周期为1d,经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。结论采用1.063g/ml percoll液能够较好的进行Beagle犬BMNCs的分离培养和体外扩增,分离得到的细胞具备骨髓基质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的特性。     

男性生殖道感染标本采集和细菌定位培养改良法

目的:改良男性生殖道感染标本采集和细菌定位培养法,探讨标本采集和病原体分离对前列腺炎诊断与治疗的影响。方法:分别采集200例前列腺炎样症状患者的分段尿液、前列腺按摩液(EPS)和精液标本,定量接种培养液分离培养,根据分离物的菌落数及分布规律评估其实验室诊断意义。结果:从200例前列腺炎样症状患者检出病原体468株,包括细菌414株(占88.5%)、真菌12株(占2.6%)、支原体40株(占8.5%)、衣原体2株(占0.4%)。其中仅从EPS分离到病原体的患者为66例(占33.0%),仅从精液分离到病原体的患者为34例(占17.0%),EPS和精液均分离到病原体的患者为100例(占50.0%)。在这些标本中仅分离到1种病原体的分别为EPS 36例(占18.0%),精液20例(占10.0%),EPS和精液39例(占19.5%);分离到2种病原体的分别为EPS 30例(占15.0%),精液14例(占7.0%),EPS和精液60例(占30.0%);1例从EPS和精液分离到3种病原体(占0.5%)。结论:复数菌感染(MMI)、多器官感染(MOI)和耐药性菌株感染在前列腺炎样症状患者常见,是造成临床及实验室诊断漏诊和误诊的常见因素以及影响治疗效果的重要机制,MMI和MOI可通过标本采集和细菌定位培养改良法进行诊断与鉴别诊断。     

聚合酶链反应对女性淋菌性尿道炎和宫颈炎的诊断价值

报告用聚合酶链反应(PCR)诊断女性淋菌性尿道炎和宫颈炎共17例。将PCR与淋菌分离培养的结果比较,认为聚合酶链反应检测淋菌优于淋菌分离培养。其具有快速、高特异性、敏感性高等特点。     

低温培养对仓鼠胰岛分离后中央细胞损害的阻止作用

目的　探讨仓鼠胰岛分离后中央细胞的损害及阻止其损害的方法。方法　胰岛分离后分别在 37℃培养 7～ 14d ;2 6℃培养 7d ;2 6℃培养 2、4、7d后复温至 37℃继续培养 7d。用显微镜结合录像技术监测胰岛分离后的中央细胞损害情况 ;用计算机辅助分析系统定量算出胰岛的直径、面积以及中央细胞损害的面积 ,算出损害面积的百分比 ;用组织学及末端转移酶标记法 (TUNEL)技术观察胰岛细胞损害的形态学和功能特点。结果　胰岛在 37℃培养 7～ 14d期间 ,直径 >2 0 0 μm的胰岛呈现了中央细胞损害 (包括坏死和凋亡 )。胰岛在 2 6℃培养 7d ,没有出现中央细胞损害。 2 6℃培养7d后复温至 37℃继续培养 7d ,显著性降低了胰岛的中央细胞损害程度。结论　胰岛分离后的中央细胞损害与其直径大小成正比 ;2 6℃培养能够阻止胰岛分离后的中央细胞损害 ;2 6℃培养 7d后复温至 37℃ ,能够阻止大多数 (除直径 >30 0 μm)胰岛的中央细胞损害。     

肝干细胞研究方法进展

当前 ,国外有关肝干细胞 (又称肝祖细胞或肝干 /祖细胞 )研究进展迅速 ,但国内研究甚少 ,主要原因是方法学受限。肝干细胞方法学较为复杂 ,涉及其活化、分离培养、细胞特异性标志物筛选及细胞体内演变的鉴定等。现将有关研究方法进展综述如下。一、分离培养方法 (图 1 )肝干细胞的分离与培养是研究其生物学特性以及通过细胞移植治疗肝病的必要前提 ,因而倍受重视。Ｙａｓｕｉ等[1 ] 从ＬＥＣ(Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓＣｉｎｎａｍｏｎ)大鼠分离肝脏细胞 ,继用胶原酶、蛋白酶Ｅ、胰蛋白酶及ＤＮＡ酶破坏大肝细胞 ,然后将细胞悬液覆盖于 1 .0 35～…     

大鼠胚胎来源肝干细胞分离纯化方法的比较

目的 观察比较机械分离法和酶消化法分离纯化孕鼠胚胎来源肝干细胞的优劣.方法 取孕13.5 d SD大鼠胚胎肝后分别用机械分离法和酶消化法分离纯化肝干细胞,比较两种方法所得细胞总量和存活率的差异,用免疫荧光染色法鉴定细胞,并比较原代培养前后肝干细胞存活率的变化.结果两种方法分离培养出的细胞形似卵圆形,经免疫荧光染色法检测表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19,机械分离法分离的肝干细胞数量(57.49±14.25)×106与酶消化法(63.36±12.67)× 106相当,两者比较差异无统计学意义(P>0.05),但机械分离法所得肝干细胞的存活率(96.37±0.82)%高于酶消化法(93.53±0.63)%(P<0.05),并且培养前后细胞存活率也明显高于酶消化法,两两比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 机械分离法是一种简单、经济、实用的胚胎来源肝干细胞分离纯化方法.     

单层培养人软骨细胞Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的变化

对单层培养的人关节软骨细胞(HAC)Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的变化进行对比。样本取自股骨颈骨折行关节置换术的8例病人(平均年龄78.2岁)的髋关节软骨,分离HAC并单层培养46天,从髋关节囊分离成纤维细胞进行培养作为对照。软骨切片染色分析硫酸氨基葡聚糖。单层培养的HAC分别用抗人Ⅰ型和Ⅱ型胶原抗体及与生物素偶合的马抗鼠二抗孵育进行免疫细胞化学分析。胃蛋     

血管瘤细胞培养及其生物学特性分析

血管瘤(hemangioma)是一种小儿常见肿瘤,对其组织发生、分化及生物学行为的研究甚少。为此我们对血管瘤进行了组织切片观察、瘤体细胞的分离培养,并利用免疫细胞化学法,检测所培养细胞第Ⅷ凝血因子的表达情况,分析其生物学特性和血管瘤细胞的分化基础,初步探索血管瘤体组织的发生机理。1材料与方法1.1试剂第Ⅷ凝血因子相关抗原(FactorⅧrelated anti-gen)抗体(兔抗人)和FITC标记的第二抗(山羊抗兔)均购自北京中杉公司。其它试剂均为国产分析纯。1.2血管瘤细胞的分离培养[1]血管瘤切除标本由山东省省立医院血管外科提供。从血管瘤中分离单…     

应用热溶素改进人角质细胞的分离和培养

体外培养自体角质细胞皮片作为缺损皮肤永久性复盖对大面积烧伤病人(>40％TBSA)的治疗带来广阔的发展前景。以往10多年中,此种培养技术不断得到改进。本文报道与胰酶常规分离、培养法(Tr法)不同的热溶素(therm-olysin)改良法(Th-Tr法)。Tr法和Th-Tr法在制成细胞悬液、原代及传代培养方面并无差异,不同的只是,Tr法单用0.05％胰酶溶液在37℃消化削薄的成人皮肤标本;而Th-Tr法先用热溶素(500μg/ml)在37℃消化2小时,分离     

小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及电镜观察

我们在成功分离培养鼠神经干细胞的基础上[1,2 ] ,对神经干细胞的生长发育特性进行电镜观察。一、材料与方法1.材料 :一级昆明E12 13孕小鼠(本校动物中心提供 ) ,改良的Eagle培养液 (DMEM /F12 ) ,胎牛血清 ,表皮生长因子 (EGF) ,均购于Gibco公司 ;N 2添加剂 (N2 supplement)、Nestin抗体、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)抗体、神经丝蛋白 2 0 0 (NF 2 0 0 )抗体 ,购自Sigma公司 ;免疫组织化学检测系统购自博士德公司。透射电子显微镜 (日立 F75型 )。2 .细胞的分离培养及传代 :无菌条件下剖腹取胎鼠 ,在解剖显微镜下分离胎鼠大脑半…     

米非司酮抑制人子宫内膜基质细胞增殖

目的在改良子宫内膜细胞原代分离培养方法的基础之上,探讨米非司酮对原代分离培养的人子宫内膜基质细胞增殖的抑制作用。方法利用改良后的"二次消化法"分离培养增殖期人子宫内膜基质和上皮细胞,进行细胞形态学观察,并通过流式细胞术检测人子宫内膜基质和上皮细胞的波形蛋白和角蛋白表达阳性的细胞比率,计算分离培养的基质和上皮细胞的纯度;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测米非司酮对原代分离培养人子宫内膜基质细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果原代分离培养的基质细胞较上皮细胞生长迅速。流式细胞检测结果显示,分离培养的基质细胞波形蛋白阳性率达97%,上皮细胞角蛋白阳性率达90%。米非司酮处理人子宫内膜基质细胞2d或3d后,结果均显示,随着米非司酮浓度增加,基质细胞的细胞抑制率(IR)逐渐升高。米非司酮作用基质细胞2d后,50和100μmol/L组的IR值均高于对照组,差异均具有统计学意义(P0.05);米非司酮作用3d后,25、50和100μmol/L组的IR值均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。通过对IR值进行直线回归分析,结果表明:米非司酮处理2d和3d对原代人子宫内膜基质细胞的IC50分别为52.85μmol/L和86.46μmol/L。结论改良后的"二次消化法"可获得高纯度人子宫内膜基质细胞和上皮细胞。米非司酮对原代人子宫内膜基质细胞有抑制作用,并呈时间和剂量依赖效应。     

人脐血内皮祖细胞对脐动脉内膜损伤的修复作用

目的 体外分离培养人脐带静脉血内皮祖细胞(EPCs),观察EPCs对损伤脐动脉的修复作用.方法 采用磁珠分选法(MACS)从人脐血中分离培养EPCs,用流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光检测进行鉴定;牵拉钳夹损伤法制备去内膜脐动脉段,与EPCs共孵育7 d后,通过病理切片、免疫组织化学和图像分析技术评价EPCs对动脉损伤的修复效果.结果 成功从人脐血中分离培养EPCs,流式细胞术分析结果 为培养7 d后CD133+细胞＞90%;CD34、vWF因子相关抗原免疫染色均为阳性.EPCs移植组新生内膜厚度(43.5±5.5)ìm显著低于对照组内膜厚度(90.7±12.7)ìm,(t=-28.88,P＜0.01);EPCs移植组的再内皮化程度(77.8±0.1)%明显高于对照组(52.2±0.1)%,(t=21.86,P＜0.01).结论 成功从人脐血中培养出EPCs,人脐血EPCs可修复内皮损伤血管.     

NOD小鼠未成熟树突状细胞体外诱导淋巴细胞生成并扩增调节性T细胞的研究

目的 探索非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)诱导并扩增调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的优化方案.方法 分离、培养NOD小鼠骨髓来源的imDC和淋巴细胞,并进行混合淋巴细胞培养,分别加...     

猪睾丸Sertoli细胞的分离、培养及其免疫豁免相关细胞因子的检测

目的 探讨猪睾丸Sertoli细胞分离、培养的方法 ,并对其体外培养的状态及免疫豁免相关细胞因子的表达进行检测,为Sertoli细胞用于移植提供依据.方法 无菌条件下取10～15日龄的湖北白猪睾丸,剥离睾丸白膜及表面血管,剪碎后用2.0 g/L V型胶原酶以及2.5 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L DNaseI消化(两步法)分离Sertoli细胞,于37℃、含体积分数为5%CO<,2>的培养箱中培养.采用倒置相差显微镜观察细胞形态,透射电镜进行超微结构鉴定,流式细胞仪检测细胞体外活率.逆转录聚合酶链反应检测Sertoli细胞sox9、FasL、转化生长因子β(TGF-β)及Clusterin的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞的活性.结果 猪睾丸经分离、培养,所获得的Sertoli细胞纯度达90%以上,培养后的细胞凋亡率为(2.61±0.96)%,死亡率为(2.12±0.74)%;培养的Sertoli细胞稳定表达sox9、TGF-β、Clusterin,而FasL表达较弱.体外培养的Sertoli细胞可以保持良好活性达21 d.结论 采用V型胶原酶以及胰蛋白酶和DNaseI两步法消化分离可获得大量高纯度的Sertoli细胞,该细胞在培养过程中能够稳定表达FasL、TGF-β和Clusterin分子.     

大鼠肝星状细胞和库普弗细胞的分离培养及鉴定

目的 应用改良的方法同步分离、培养和鉴定原代大鼠肝星状细胞(HSC)和库普弗细胞(KC).方法 采用Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Percoll密度梯度离心体外同步分离、纯化及培养HSC和KC,并用光学显微镜、免疫组织化学染色、电子显微镜等方法进行鉴定.结果 每只大鼠HSC和KC的细胞获得率分别为(1.8～2.9)×107和(0.8～1.4)×107,平均纯度分别为94.7%±1.7%和95.2%±1.5%,活力分别为95.5%±1.3%和96.4%±2.4%.结论 Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Percoll密度梯度离心体外同步分离培养HSC和KC方法简单,细胞获得率、活力和纯度高.     

小鼠关节软骨表层细胞分离培养及鉴定

目的分离培养小鼠关节软骨表层细胞(ACSC)并鉴定其干细胞特性。方法运用纤连蛋白黏附法从3~5 d新生小鼠膝关节软骨表层分离细胞及培养,对分离细胞以流式细胞仪检测干细胞表面阳性标志物(CD44与CD90)和阴性标志物(CD45、CD31与CD34)的表达;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测相关基因表达;单克隆形成实验检测克隆形成能力。三系诱导分化(成软骨、成骨与成脂分化)检测分离培养细胞的多向分化潜能。取第6代分离培养细胞做裸鼠皮下移植实验,检测其体内成软骨能力。结果纤连蛋白可以特异性地黏附ACSC,ACSC形态偏长,类似成纤维细胞。ACSC高表达CD44和CD90,但几乎不表达CD31、CD34和CD45。qRT-PCR检测结果显示,以ACSC表达的mRNA水平为1,则软骨细胞显著性低水平表达间充质干细胞标志物CD73(0.08±0.07,P0.001)、CD90(0.07±0.01,P0.001)、CD105(0.37±0.02,P0.001)和软骨表层细胞标志物Prg4(0.42±0.01,P0.001)、Erg(0.61±0.02,P0.001)、Ten C(0.64±0.07,P0.001),但显著性高水平表达软骨细胞标志物Col2(6.89±0.06,P0.001)、Acan(6.51±0.04,P0.001)、MATN1(14.57±4.21,P0.01)。经过14 d培养,单个ACSC可以形成大于50个细胞的单克隆细胞团。体外诱导ACSC具备很强的成软骨、成骨与成脂分化能力,裸鼠体内ACSC具有成软骨能力。结论小鼠ACSC具有典型的干细胞特征。     

兔半月板纤维软骨细胞在纤维蛋白凝胶中体外培养的生物学特性

目的：研究兔半月板纤维软骨细胞的分离、培养及在纤维蛋白凝胶中三维培养时的生物学特性。方法：(1)分离、培养兔半月板纤维软骨细胞；(2)制备纤维软骨细胞与纤维蛋白凝胶复合物，在纤维蛋白中培养细胞；(3)通过倒置相差显微镜，HE染色、电镜检查作形态学观察；(4)通过测定生长曲线及ABPAS染色、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化检查，了解细胞生长特性及软骨基质的分泌情况。结果：(1)单层培养的纤维软骨细胞呈线形，部分呈多角形，在纤维蛋白中的纤维软骨细胞为圆形，表面细胞呈多角形；(2)细胞在纤维蛋白中培养时，对数生长期明显延长；(3)AB-PAS染色( )，Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化检查( )。结论：兔半月板纤维软骨细胞在纤维蛋白凝胶中能够增殖，保持其表型和分泌胞外基质。