转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

核转录因子-κB小干扰RNA转染对食管癌细胞化疗敏感性的影响

我们通过小分子干扰RNA(siRNA)阻断核转录因子(NF) -κB信号通路,观察其对食管鳞癌细胞增殖及化疗敏感性的影响.一、材料与方法构建NF-κB p65 siRNA载体质粒“p65 siRNA”及无义序列质粒“HK”并转染食管癌Eca109细胞,转染72 h后将细胞分为:(1)对照组:未转染Eca109细胞;(2) HK组:Eca109细胞转染HK;(3) p65siRNA组:Eca109细胞转染p65siRNA.     

KPNA2基因沉默和过表达对人膀胱癌细胞株5637增殖能力的影响

目的观察KPNA2(karyopherin a2)基因沉默和过表达对人膀胱癌细胞株5637增殖能力的影响。方法将KPNA2siRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1(+)-KPNA2用LipofectaminTM2000方法瞬时转染膀胱癌细胞株5637,转染后48h,应用蛋白质印迹法检测转染细胞中KPNA2蛋白表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖活性,通过生长曲线检测KPNA2基因沉默和过表达后细胞增殖能力的改变。结果与阴性对照组比较,KPNA2siRNA干扰质粒转染5637细胞后,转染组细胞KPNA2蛋白表达水平显著下降,细胞增殖能力明显受到抑制,pcDNA3.1(+)-KPNA2过表达质粒转染5637细胞后,转染组细胞KPNA2蛋白表达水平显著升高,细胞增殖能力明显增强(P0.05)。结论 KPNA2基因沉默和过表达可以调节人膀胱癌细胞株5637的增殖能力,为膀胱癌的临床治疗提供了新方向。     

靶向Survivin的siRNA联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖

目的 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体,观察其对吉西他滨化疗抑制胰腺癌Pane-1细胞增殖的影响.方法 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体psiRNA-Survivin,行酶切和测序鉴定.用重组质粒转染Pane-1细胞并筛选稳定转染的细胞株,绘制细胞生长曲线.采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测Survivin的mRNA和蛋白表达变化.以吉西他滨分别作用于对照组和转染组Panc-1细胞24 h,噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 酶切和测序鉴定表明,成功构建了psiRNA-Survivin重组质粒.重组质粒稳定转染胰腺癌细胞株后,Survivin的mRNA和蛋白表达分别下调了79.2%和83.6%(P<0.05),生长曲线明显变平缓,并能显著增强吉西他滨对Panc-1细胞的增殖抑制[(24.6±4.5)%/(38.7±5.2)%]和凋亡诱导作用[(16.7±2.5)%/(26.8±3.4)%,P<0.05).结论 构建Survivin的siRNA表达载体可明显下调Survivin的表达,抑制Panc-1细胞增殖,并能提高细胞对吉西他滨的化疗敏感性.     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

重组LIGHT-Fc基因对食管鳞癌Eea109细胞生长的抑制

目的 研究重组LIGHT-Fc基因对食管鳞癌Eca109细胞的抑制效应.方法 以脂质体介导LIGHT-Fc基因转染食管鳞癌Eca109细胞,观察基因转染后对Eca109细胞体外生长的影响.建立荷瘤裸小鼠模型,分为野生型组(Eca109/Wt)、转空质粒组(Eca109/neo)和实验组(Eca109/LIGHT),每组15只.观察各组成瘤情况和瘤组织的病理表现.结果 Eca109细胞中有LIGHT受体的表达,转染LIGHT-Fc基因后,瘤细胞的生长被抑制.野生型组、转空质粒组和实验组成瘤分别为12、11和5只,实验组与其余两组比较差异有统汁学意义(X2=6.652,4.821,P<0.05).病理检查显示在实验组小鼠瘤组织中存在较为明显的坏死.结论 LIGHT-Fc基因的表达对食管鳞癌Eca109细胞具有体内和体外抑制作用.     

miRNA-101对激素非依赖型前列腺癌细胞系LNCaP EZH2表达的影响

目的:探讨microRNA-101(miRNA-101)对激素非依赖型前列腺癌细胞系LNCa P的果蝇zeste基因增强子的人类同源基因(EZH2)表达的影响。方法:实验分为空白组、阴性对照组和转染组。转染组通过基因重组技术构建miRNA-101表达载体,应用脂质体将其转染到LNCa P细胞中,荧光显微镜检测转染效率。3组细胞通过qRT-PCR检测细胞中EZH2 mRNA的表达。阴性对照组和转染组用Western印迹检测EZH2蛋白的水平。结果:转染组细胞培养24 h后,70%以上的细胞内出现绿色荧光基因信号。阴性对照组和转染组细胞培养72 h后,转染组细胞miRNA-101表达增加明显(P<0.01);转染组EZH2 mRNA的表达水平(0.01±0.10)显著低于空白组(0.95±0.40)和阴性对照组(0.86±0.30)(P均<0.01)。阴性对照组EZH2蛋白表达水平随培养时间延长而增加,但转染组EZH2蛋白表达水平随培养时间延长则下降。结论:miRNA-101可以抑制LNCa P细胞的EZH2的表达,具有成为前列腺癌生物治疗靶点的可能。     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探讨趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。方法Real-time PCR 检测人骨肉瘤细胞株 HOS-8603、U2OS 和 MG-63 中 CXCR4 mRNA 的表达情况;构建、鉴定pcDNA3/CXCR4 重组质粒并将其转染到 HOS-8603 细胞中（PCDNA3/CXCR4 组）,同时制备转染 pcDNA3 空质粒的阴性对照组（pcDNA3组）。MTT检测细胞增殖情况,穿膜小室重组细胞基底膜迁移实验检测细胞迁移情况。结果 HOS-8603细胞中CXCR4 mRNA相对表达含量低于U2OS、MG-63细胞（P 〈0.05）。转染后24、48h,pcDNA3/CXCR4 组 CXCR4 mRNA 表达量是 pcDNA3 组的 96 倍和 124 倍（P 〈0.05）。与 pcDNA3 组比较,转染后24、48、72 h,pcDNA3/CXCR4组细胞增殖率和发生迁移的细胞数明显增加（P 〈0.05）。结论 CXCR4的表达可能是促进骨肉瘤细胞增殖和迁移的重要因素。     

外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

雄激素和雌激素受体与食管癌的关系

目的 通过测定食管癌组织中雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）的含量,探讨食管癌生物学行为与AR和ER的关系。方法 应用放射配体结合分析法定量测定31例食管癌患者癌组织中AR和ER的含量,并与正常食管黏膜组织作对照。结果 与正常食管组织比较,食管癌组织中存在较多的AR和ER,其含量与患者性别、分化程度、浸润程度、有无淋巴结转移有关（P＜0．05）,而与患者年龄、肿瘤的部位无明显关系（P＞0．05）。结论 AR和ER含量与食管癌生物学行为关系密切,可能为食管癌的防治提供新的方法,并作为评价食管癌患者预后的新指标。     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒对食管癌细胞凋亡和抑制侵袭的作用

目的 观察鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶双反义腺病毒对食管癌Eca109细胞凋亡作用及抑制细胞侵袭的影响.方法 采用Western印迹检测腺病毒载体对食管癌Eca109细胞中ODC和AdoMetDC蛋白表达;应用噻唑蓝(MTT)比色法测定观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖的影响;应用原位末端标记(TUNEL)法和Matrigel侵袭实验分别观察Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞凋亡作用的影响和侵袭活性的改变.结果 Ad-ODC-AdoMetDCas可明显抑制食管癌Eca109细胞中ODE和AdoMetDC基因表达(P＜0.05).MTT法实验表明,Ad-ODC-AdoMetDCas对食管癌Eca109细胞生长增殖有显著抑制作用(P＜0.05).TUNEL标记检测Matrigel侵袭实验结果 显示,Ad-ODC-AdoMetDCas可明显引起食管癌Eca109细胞凋亡(P＜0.05),可显著降低食管癌细胞Eca109的体外侵袭能力(P＜0.05).结论 Ad-ODC-AdoMetDCas能显著促进细胞凋亡,抑制食管癌细胞侵袭.     

长链非编码RNA反义RNA 1靶向微小RNA-501-3p对食管癌细胞恶性生物学行为影响的实验研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)胸腺生成素反义RNA 1(TMPO-AS1)对食管癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制。方法2016年6月至2019年12月,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测20例食管癌组织和癌旁组织中lncRNA TMPO-AS1和微小RNA(miR)-501-3p的水平,食管癌Eca109细胞分为lncRNA TMPO-AS1干扰组(转染si-NC和si-TMPO-AS1);miR-501-3p过表达组(转染miR-NC和miR-501-3p);lncRNA TMPO-AS1过表达组(转染pcDNA和pcDNA-TMPO-AS1);lncRNA TMPO-AS1和miR-501-3p共抑制组(转染si-TMPO-AS1+anti-miR-NC和si-TMPO-AS1+anti-miR-501-3p)。噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术和Transwell实验分别检测食管癌Eca109细胞增殖、凋亡率、细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法(Western blot)检测相关蛋白水平,双荧光素酶报告系统验证lncRNA TMPO-AS1与miR-501-3p的调控关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差进行分析。结果食管癌组织组中的lncRNA TMPO-AS1水平(2.64±0.26)高于癌旁组织(1.00±0.09,t=26.657,P<0.05),miR-501-3p水平(0.44±0.04)低于癌旁组织(1.00±0.07,t=31.063,P<0.05);干扰lncRNA TMPO-AS1的Eca109细胞24 h增殖(0.36±0.03)低于si-NC组(0.39±0.03,t=2.121,P<0.05),48 h增殖(0.45±0.04)低于si-NC组(0.75±0.07,t=11.163,P<0.05),72 h增殖(0.57±0.05)低于si-NC组(1.16±0.09,t=17.191,P<0.05),迁移细胞数[(54.14±5.65)个]低于si-NC组[(113.02±9.87)个,t=15.531,P<0.05],侵袭细胞数[(47.69±5.01)个]低于si-NC组[(96.32±9.88)个,t=13.169,P<0.05],细胞凋亡率[(22.15±2.22)%]高于si-NC组[(6.98±0.69)%,t=19.576,P<0.05];过表达miR-501-3p的Eca109细胞48 h增殖(0.51±0.05)低于miR-NC组(0.77±0.07,t=9.067,P<0.05),72 h增殖(0.65±0.06)低于miR-NC组(1.15±0.09,t=13.867,P<0.05),迁移细胞数[(61.23±6.33)个]低于miR-NC组[(115.25±9.25)个,t=14.458,P<0.05],侵袭细胞数[(53.14±5.33)]低于miR-NC组[(98.32±8.47)个,t=13.543,P<0.05],细胞凋亡[(19.58±1.74)%]高于miR-NC组[(7.23±0.77)%,t=19.471,P<0.05],差异均有统计学意义。结论lncRNA TMPO-AS1通过靶向miR-501-3p促进食管癌细胞的恶性生物学行为,可被视为食管癌患者的潜在治疗靶标。     

生育酚结合蛋白基因重组腺相关病毒的制备及抗癌作用

目的 制备生育酚结合蛋白(TAP)重组腺相关病毒,并探讨其对前列腺癌生长的作用.方法 构建重组腺相关病毒质粒pSNAV-TAP-EGFP,酶切、聚合酶链反应(PCR)、测序.225 cm2细胞培养瓶中,接种293T细胞,以重组质粒转染.扩增、纯化病毒,并转染DU-145细胞,噻唑蓝(MTT)比色法观察第2、4、6天的细胞增殖.结果 成功构建pSNAV-TAP-EGFP质粒,并制备滴度6.4×1011vg/ml、纯度95%的rAAV2-TAP.该病毒转染DU-145细胞后TAP表达量明显上升.转染后第4天,TAP转染组的细胞吸光度(A值)0.546±0.072,对照组以及空载体转染组的A值分别为0.673±0.015、0.638±0.051,生长明显受到抑制(P＜0.05).至第6天各组细胞生长差异更显著.结论 成功制备高滴度的rAAV-TAP-EGFP病毒,并可抑制前列腺癌细胞的生长.

Abstract：

Objective To produce recombinant rAAV2 virus carrying α-tocopherol associated protein (TAP) and to observe its effect on prostate cancer cells. Methods The pSNAV-TAP-EGFP plasmid was constructed and digested with restriction enzyme. Polymerase chain reaction (PCR), and sequence analysis were performed to identify the correct recombinant clones. The plasmid was transfected into 293T cells to produce virus. The virus was amplified and purified. DU-145 cells were infected by rAAV-TAPEGFP. Cell growth was detected by MTT assay. Results The pSNAV-TAP-EGFP was constructed successfully. The titer of rAAV2-TAP-virus was 6. 4 × 1011 vg/ml and the purity was 95%. The rAAV-TAP-EGFP was infected into the DU-145 cells with high efficiency. The expression of TAP was increased significantly by real-time PCR. MTT assay showed differences at the 4th day. The cellular absorbance value in the TAP transfection group, control group and empty vector transfection group was 0. 546 +0. 072, O. 673 +0. 015,and 0. 638 + 0. 051 (P ＜ 0. 05 ). The differences became more significant after 6 days. Conclusion High tier recombinant adeno-associated virus rAAV2-TAP-EGFP was obtained, which was able to inhibit the proliferation of prostate cancer cells.