豚鼠膀胱组织ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达意义

目的 探讨体外培养豚鼠膀胱组织ICCs细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)间隙连接蛋白Connexin 43的表达.方法 胶原酶消化法进行豚鼠膀胱组织ICCs细胞的原代培养, 对照为原代培养膀胱平滑肌细胞,免疫荧光法进行两种细胞的特征性蛋白c-kit及平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)染色观察,免疫荧光法及Western blot法进行培养细胞Connexin43的检测.结果 豚鼠膀胱ICCs细胞特征性蛋白c-kit染色阳性,SMA染色阴性.豚鼠膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin 43表达水平较高,显著高于膀胱平滑肌细胞.结论 豚鼠离体膀胱ICCs细胞间隙连接蛋白Connexin43高表达可能是其信号传递的重要物质基础.     

牵张负荷对豚鼠膀胱ICCs细胞内钙波的影响

目的 探讨牵张负荷对豚鼠膀胱起搏细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)兴奋性的影响.方法 胶原酶消化豚鼠膀胱,于特制的牵张培养皿中体外培养膀胱起搏细胞,激光共聚焦技术检测Fluo-4负载的起搏细胞在牵张负荷下Ca2 信号的变化.结果 以豚鼠膀胱组织铺片及体外培养细胞中观察到c-kit染色阳性及长梭形有突起的细胞鉴定为膀胱起搏细胞,即ICCs细胞.细胞于牵张膜上培养4～5 d后,予Fluo-4钙负载染色,激光共聚焦下检测,无应力状态时,ICCs细胞可观察到周期性的"钙波",且其平均荧光强度显著强于平滑肌细胞(P＜0.05).当牵张膜被动拉伸延长20%时,ICCs细胞先于平滑肌细胞发生钙波增强现象.结论 静息状态下ICCs细胞可出现周期性钙波,牵张负荷可兴奋ICCs细胞.     

体外Cajal样细胞c-kit基因mRNA在高糖环境下表达变化及意义

目的：观察体外高糖环境下Cajal样细胞（interstitial cells of Cajal-like,ICCs）c-kit mRNA表达变化。方法：胶原酶消化法原代分离培养豚鼠膀胱ICCs,加入含葡萄糖浓度分别为5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L培养基培养24h、48h、72h后,应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测高糖环境下c-kit基因mRNA表达水平的变化。结果：RT-PCR电泳经分析显示15mmol/L、30mmol/L组ICCs c-kit mRNA表达较5mmol/L组降低（P〈0.01）,72h组较24h组、48h组表达降低。结论：高糖环境造成ICCs c-kit基因mRNA表达水平降低,可导致ICCs的SCF/c-kit信号通路异常,ICCs功能及结构障碍,可能是糖尿病膀胱病变的发病机制之一。     

牵张负荷对大鼠膀胱ICCs细胞数量及c-kit表达的影响

目的 探讨牵张负荷条件对膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)数量及c-kit蛋白表达变化的影响,阐明牵张负荷对膀胱ICCs细胞兴奋性的调控作用.方法 构建大鼠不稳定逼尿肌模型,以光镜计数及免疫组化法检测牵张负荷下逼尿肌稳定组和逼尿肌不稳定组与正常对照组膀胱ICCs细胞数量及酪氨酸激酶受体(c-kjt)在蛋白水平表达的差异.结果 逼尿肌稳定组和逼尿肌不稳定组ICCs细胞数量与c-kit表达量较正常对照组均有增高(P＜0.01),逼尿肌不稳定组较稳定组升高显著(P＜0.01).结论 牵张负荷对ICCs细胞有调控作用;ICCs细胞数量及c-kit表达增多可能是其机制之一.     

牵张负荷对大鼠膀胱Cajal间质细胞超微形态及c-kit基因表达影响

目的 通过研究膀胱Cajal间质细胞(Interstitial cells of cajal,ICCs)超微形态及c-kit基因水平变化,阐明牵张负荷对膀胱Cajal细胞兴奋性的调控作用.方法 结扎膀胱颈,构建大鼠膀胱出口部分梗阻致逼尿肌过度活动模型,通过扫描电镜方法观察牵张负荷条件下逼尿肌过度活动组与正常对照组膀胱ICCs细胞超微形态变化,观察牵张负荷条件下逼尿肌稳定组和逼尿肌过度活动组与正常对照组膀胱ICCs细胞酪氨酸激酶受体(c-kit)在基因水平表达差异.结果 逼尿肌过度活动组ICCs细胞形态和c-kit基因水平表达最较正常对照组有明显改变(P＜0.01).结论 牵张负荷对ICCs细胞有调控作用,可能的作用机制在于改变ICCs细胞形态及上调c-kit表达.     

大鼠不稳定膀胱中ICCs细胞中HCN蛋白表达的变化

目的 研究HCN离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)蛋白在膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中的表达及在不稳定膀胱ICCs细胞中表达的变化,探讨ICCs细胞兴奋性变化与逼尿肌不稳定(detrusor instability,DI)的关系.方法 ①将30只大鼠随机分为正常对照(10例),逼尿肌稳定组(DS,n=12),逼尿肌不稳定组(DI,n=8):大鼠尿道近端结扎,建立膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)模型.②对各组进行HCN和c-kit免疫荧光双标,确定HCN蛋白是否在ICCs细胞上存在及HCN表达的变化.③以Western blot法检测HCN蛋白表达量的变化.结果 ①免疫荧光双标显示,在c-kit阳性的ICCs细胞膜上,有HCN抗原的表达,c-kit阴性细胞未见HCN表达;与正常组相比,DI组、DS组HCN蛋白表达增加.②Western blot检测显示,与正常组相比,DI组、DS组的HCN表达增高,DI组增高显著(P＜0.01).结论 大鼠膀胱ICCs细胞可表达HCN通道蛋白,且DI膀胱ICCs细胞HCN通道明显增多,由此导致的ICCs细胞兴奋性增高可能在DI发生中起重要作用.     

胃肠道起搏细胞ICCs在豚鼠泌尿道分布研究

目的研究胃肠道起搏细胞-Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)在豚鼠泌尿道的分布情况.方法取8只豚鼠肾盂、输尿管、膀胱和尿道组织,经铺片处理后,行ICCs特异性标志物KIT免疫细胞化学染色.结果KIT染色阳性,形态与胃肠道起搏细胞ICCs相似的细胞(ICCs样细胞)存在于豚鼠全泌尿道的黏膜下层和肌层.结论在豚鼠全泌尿道存在有ICCs样细胞分布,豚鼠可作为研究人泌尿道ICCs样细胞功能的理想动物模型.     

Cajal间质细胞在输尿管平滑肌自发性收缩中的作用

目的 通过Glivec特异性地阻断Cajal间质细胞后观察豚鼠输尿管平滑肌肌条自发性收缩活动的变化,从功能学上探讨caial间质细胞在输尿管平滑肌自发性收缩巾的作用.方法 采用c-kit免疫荧光化学染色,激光共聚焦显微镜观察豚鼠输尿管组织内的ICCs;通过离体肌条实验观察特异性地阻断ICCs后豚鼠输尿管平滑肌肌条自发性收缩的变化.结果 c-kit免疫荧光染色显示,在豚鼠输尿管组织中存在c-kit阳性的ICCs.在2.0 g的前负荷下,终浓度为2×10~(-2)mol/L的KCI可诱发对照组肌条出现稳定的自发性收缩,自发性收缩的波幅为(0.104 5±0.021 6)g,频率为(6.8±1.6)次/min;实验组经终浓度为10~(-4)moL/L Glivec孵育30 min后,再给予终浓度为2×10~(-2) mol/L的KCI不能诱发肌条出现明显自发性收缩,更换Kreb's液洗脱Glivec 30 min后,肌条又恢复了自发性收缩,但收缩幅度略有降低.结论 输尿管的ICCs在输尿管平滑肌的自发性收缩中起着重要作用,极有可能是输尿管的起搏细胞.     

成年豚鼠膀胱ICCs细胞起搏电流的鉴定

目的 确定成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞(interstitial cells of cajal,ICCs)细胞是否具有起搏电流.方法 采用胶原酶消化法,得到原代培养的成年豚鼠膀胱ICCs细胞.采用膜片钳技术,在全细胞记录模式下,记录其超级化激活的内向电流(hyperrepolarization-activated inward current,Ih).结果 原代培养的ICCs细胞和逼尿肌细胞的静息膜电位、膜电容存在明显差异;ICCs细胞可记录到起搏细胞特征电流Ih,而在逼尿肌细胞则记录不到.结论 记录到成年豚鼠膀胱ICCs细胞具有起搏细胞的特征电流Ih,提示ICCs细胞在膀胱具有起搏作用.     

豚鼠膀胱Cajal样细胞缺失模型的建立

目的:探讨通过体内阻断c-kit信号途径来建立豚鼠膀胱Cajal样细胞缺失模型的方法。方法:选取新生豚鼠20只,随机分成实验组、对照组。实验组在出生24h内的豚鼠腹腔内隔天注射c-kit抗体(ACK2)100μg,共5次,对照组腹腔内注射生理盐水,于第10天取膀胱。然后将两组豚鼠膀胱制作冰冻切片行免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察。结果:10d后实验组与对照组豚鼠逼尿肌中Cajal样细胞在激光共聚焦显微镜下比较:实验组膀胱逼尿肌中Cajal样细胞数量减少甚至消失(P<0.01),Cajal样细胞二聚体消失(P<0.01)。结论:通过阻断c-kit信号通路可以成功建立豚鼠膀胱Cajal样细胞缺失模型。     

Cajal细胞调节豚鼠胆囊动力的实验研究

目的证实豚鼠胆囊Cajal间质细胞(ICC)是胆囊平滑肌动力的起搏细胞。方法采用在体记录和组织钳细胞内记录的方式,研究胆囊自发电活动。亚甲蓝+光照的方法破坏胆囊ICC。胶原酶分离方法分离胆囊平滑肌细胞,并对分离的单个细胞进行形态学分析,联合激光共聚焦显微镜检测c-kit蛋白表达的方法鉴定ICC。膜片钳用于证明胆囊ICC能产生具有起搏活性的自发去极化电流。结果豚鼠胆囊在体记录的慢波每分钟(58±3.2)次,细胞内记录时可记录到慢波和动作电位。采用亚甲蓝+光照的方法后,慢波和动作电位明显减弱或消失。豚鼠胆囊新鲜分离的细胞经过贴壁之后,可见少量具有典型ICC光镜特征的细胞,占细胞总数的(5±1.2)%(n=12),(21±4)%细胞的c-kit蛋白表达阳性。全细胞膜片钳记录胆囊ICC的自发去极化电流,发现豚鼠胆囊ICC自发去极化电流频率每分钟(58.4±3.5)次(n=21),幅度约-(72±3.5)pA。结论豚鼠胆囊平滑肌中存在ICC起搏细胞,参与起搏胆囊自发节律性电活动和自动节律性收缩活动。     

豚鼠膀胱Cajal样间质细胞肌层分布及相关功能分析

目的：研究豚鼠膀胱Cajal样间质细胞分布、超微结构特点并探讨其功能。方法：选择健康豚鼠10只,利用激光共聚焦显微镜和透射电镜观察膀胱Cajal样间质细胞在肌层的分布和结构特点。结果：豚鼠膀胱肌层Cajal样间质细胞形成网状和平行状两种不同的分布。超微结构核大、具有丰富的细胞器。结论：膀胱Cajal样间质细胞分布和超微结构与胃肠道的ICCs相似,具有起搏细胞特征。     

TGF-β1 inhibits connexin-43 expression in cultured smooth muscle cells of human bladder

Objective： In this research, we studied the TGF-β1 effects on connexin-43 expression in cultured human bladder smooth muscle cells. Methods： Human bladder smooth muscle cells primary cultures, with bladder tissue obtained from patients undergoing cystectomy, were intervened by recombinant human TGF-β1. Connexin-43 expression in human bladder smooth muscle cells was then examined by Western blotting and immunocytochemistry. Results： Stimulation with TGF-β1 led to significant reduction of connexin-43 immunoreactivity and coupling （P〈0.0001）. Connexin-43 protein expression was significantly downregulated （P〈0.05）. Simultaneously, low phosphorylation species of connexin-43 were particularly affected. Conclusion： Our experiments demonstrated a significant downregulation of connexin-43 by TGF-β1 in cultured human bladder smooth muscle cells. These findings support the view that TGF-β1 is involved in the pathophysiology of urinary bladder dysfunction     

不稳定膀胱逼尿肌中Cajal样间质细胞的分布

目的:了解Cajal(ICCs)样间质细胞在不稳定膀胱逼尿肌中的分布,探讨其与逼尿肌不稳定(DI)发病机制的相关性。方法:建立豚鼠膀胱出口梗阻模型,行充盈性膀胱测压确定DI组14只,另设对照组10只,采用组织冰冻切片、酪氨酸蛋白激酶受体(KIT)单克隆抗体间接免疫荧光检测技术观察逼尿肌中ICCs样细胞的分布情况。结果:KIT阳性细胞走向与逼尿肌肌束平行,主要分布于逼尿肌肌束边缘和逼尿肌肌束中,呈梭形双极细胞。与对照组比较,DI组KIT阳性细胞数量明显增多(P<0.01)。结论:膀胱ICCs样间质细胞增多引起逼尿肌自发收缩活动增加可能是DI发病的重要因素之一。     

Rho激酶在致石豚鼠胆囊平滑肌中的表达及作用

目的:探讨致石过程中,Rho激酶在豚鼠胆囊平滑肌中表达的变化及其对胆囊平滑肌收缩功能的影响.方法:60只雄性豚鼠随机分为对照组和实验组,实验组建立动物模型分为模型组和Rho激酶抑制剂法舒地尔(fasudil)干预组.采用酶比色法和氧化酶法测定胆汁中胆同醇(TC)和甘油三脂(TG)含量,同时测量空腹胆囊体积(FV)及空腹...     

胞外钙及胞内钙库钙在膀胱ICCs细胞自发性钙瞬变中的作用

目的 观察离体活膀胱肌条铺片中卡哈尔间质细胞(interstitial cells of cajal,ICCs)自发性钙瞬变,并检测胞外钙及胞内钙库钙对ICCs细胞自发性钙瞬变的影响,探讨ICCs细胞自发性钙瞬,变产生的机制.方法 制作离体膀胱肌条铺片,生理液灌流保持肌条铺片活性.待肌条自发性收缩活动出现后,Fluo-4负载肌条铺片,激光共聚焦显微镜观察其中ICCs细胞自发性钙瞬变,随后观察尼莫地平(Nimodipine)、2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-aminoethoxydip henylborate,2-APB)、雷诺丁(Ryanodine)、毒胡萝卜素(Thapsigargin)及无钙、高钙生理液对ICCs细胞自发性钙瞬变的影响,探讨ICCs细胞自发性钙瞬变产生的机制.结果 可见离体活膀胱肌条铺片中平滑肌细胞和ICCs细胞均产生节律性A发性钙瞬变,平滑肌细胞钙瞬变频率较快,而ICCs细胞钙瞬变频率相对较慢.尼莫地平能完全抑制平滑肌细胞的自发性钙瞬变,但对ICCs细胞的自发性钙瞬变无显著影响.2-APB、雷诺丁、毒胡萝卜素及无钙生理液均可完全抑制ICCs细胞的自发性钙瞬变,高钙生理液可显著增加ICCs细胞自发性钙瞬变的频率.结论 细胞外钙离子通过非L型钙离子通道入胞及细胞内钙库放钙均参与ICCs细胞自发性钙瞬变的产生.     

地塞米松对哮喘豚鼠气管平滑肌毒蕈碱受体mRNA的表达及肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞浸润的影响

目的 探讨地塞米松对哮喘豚鼠气管平滑肌毒蕈碱受体(MR)mRNA的表达及肺泡灌洗液(BALF)嗜酸性粒细胞(Eos)浸润的影响。方法 30只健康豚鼠随机分为3组:正常对照组、哮喘组和地塞米松治疗组。后两组制作成哮喘豚鼠模型,再激发用药。测定BALF的细胞总数及细胞分类,观察肺组织的病理改变,进行气管平滑肌的M₂R、M₃RmRNART-PCR半定量分析。结果 各组BALF的Eos计数,地塞米松治疗组(11.0±3.1)较正常组(2.8±3.0)和哮喘组(29.2±7.3)有显著差异(P<0.01)。地塞米松治疗组肺组织充血水肿明显,但Eos肺组织浸润较哮喘组有明显减少。气管平滑肌的MRmRNART-PCR半定量分析显示,地塞米松治疗组M₂R(0.90±0.14)与正常组(0.50±0.16)及哮喘组(1.26±0.24)比较均有显著差异(P<0.01),地塞米松组M₃R与哮喘组比较有显著差异(P<0.01),与正常组比较无显著差异;正常组与哮喘组比较,M₂R和M₃R均有显著差异(P<0.01)。结论 哮喘豚鼠M₂R表达增加,M₃R表达减少;地塞米松治疗可以通过抑制Eos浸润等炎症反应,调节M₂R及M₃R表达,从而恢复M₂R功能,达到治疗哮喘的目的。     

巴豆对大鼠膀胱逼尿肌肌条运动的影响

目的观察巴豆水煎剂对豚鼠离体膀胱通尿肌肌条运动的作用,并探讨其作用机理。方法将通尿肌肌条悬挂于离体平滑肌灌流肌槽内,采用累积加入巴豆水煎剂的方法,观察其影响。结果①巴豆增高豚鼠离体膀胱逼呆肌肌条的张力,并呈剂量依赖性关系（r＝0．80,P＜0．01）。②异搏定部分阻断巴豆增高肌条张力的效应（P＜0．001）。六烃季胺、阿托品、酚妥拉明和消炎痛均不阻断巴豆增高肌余张力的效应（P＞0．05）。结论巴豆剂量依赖性增高豚鼠离体膀胱通尿肌张力,其作用部分经由平滑肌细胞膜的Ca~(2+)通道。