瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞增殖凋亡的比较

目的 比较瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞生物学活性,以进一步探讨瘢痕疙瘩形成发展机制。方法 采用体外培养成纤维细胞技术对所有标本进行细胞培养,取6－8代细胞作为实验对象。噻唑蓝（MTT）比色法比较细胞接种后不同时间瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的增殖活性和碘化丙啶（PI）染色、流式细胞仪比较它们在无血清培养条件下和在不同浓度Fas单克隆抗体（Fas mAb)作用下的细胞凋亡率。结果 瘢痕疙瘩边缘成纤维细胞增殖活性高于中央、两者均高于正常皮肤（P＜0．01）;无血清培养24h后,瘢痕疙瘩边缘及中央细胞凋亡率均有所增加,但两者之间无显著性差异（P＞0．05）;Fas mAb作用下,瘢痕疙瘩边缘及中央细胞均不能正常凋亡,两者之间无显著性差异（P＞0．05）。结论 瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞生物学活性不尽相同,瘢痕疙瘩边缘成纤维细胞增殖活性过高可导致其向周围不断增生并浸润生长。     

瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的增殖-凋亡调控及相关蛋白的表达

目的 观察Fas介导下瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞增殖与凋亡的特点,探讨瘢痕疙瘩周边和中央部生长差异的细胞生物学机制。方法 应用透射电镜及流式细胞仪技术,观察了FasMcAb诱导下瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的凋亡情况,并检测了不同来源成纤维细胞Fas受体、Bcl-2蛋白及p53蛋白的表达情况。结果 (1) 瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞在各种浓度梯度的FasMcAb作用下均未见明显的凋亡现象,Fas受体均呈高表达;(2)Bcl-2蛋白在瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞内均呈低表达,但中央部表达强度显著高于周边部(P<0.05);(3) p53蛋白在瘢痕疙瘩周边呈低表达,而在中央部呈高表达。结论 p53蛋白可能是导致瘢痕疙瘩不同部位呈现不同生长特性的最重要的增殖调控蛋白。     

瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的增殖—凋亡调控及相关蛋白的表达

目的 观察Fas介导下瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞增殖与凋亡的特点,探讨瘢痕疙瘩周边和中央部生长差异的细胞生物学机制。方法 应用透射电镜及流式细胞仪技术,观察了FasMcAb诱导下瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的凋亡情况,并检测了不同来源成纤维细胞Fas受体、Bcl-2 蛋白及p53蛋白的表达情况。结果 （1）瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞在各种浓度梯度的FasMcAb作用下均未见明显的凋亡现象,Fas受体均呈高表达;（2）Bcl-2蛋白在瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞内均呈低表达,但中央部表达强度显著高于周边部（P＜0．05）;（3）p53蛋白在瘢痕疙瘩周边呈低表达,而在中央部呈高表达。结论p53蛋白可能是导致瘢痕疙瘩不同部位呈现不同生长特性的最重要的增殖调控蛋白。     

病理性瘢痕成纤维细胞Fas介导的死亡信号传导研究Ⅰ:Ca2+在Fas介导的死亡通道中的作用

目的研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas单抗(FasMcab)诱导产生凋亡的能力,同时探讨Ca2+在其相应死亡信号通道中的作用.方法取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例,通过细胞培养6～8代后,以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h.应用透射电镜证实凋亡现象的发生,流式细胞仪检测并比较两者凋亡率.同时,应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca2+的变化.结果增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下,发生明显的凋亡现象,其凋亡率随着单抗浓度的增高不断增高.瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下,均未发生明显凋亡,且各组间差异无显著意义.在FasMcab作用下,增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2+显著增高而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2+无变化.结论 Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖-凋亡调控异常的细胞生物学机制之一,胞内Ca2+产生的障碍可能与其Fas介导凋亡的异常密切相关.     

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡,是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人Fas cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入瘢痕疙瘩成纤维细胞,Fas mAb诱导凋亡;通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas mAb作用后,在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂;琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带;流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常,是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成,与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起,其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。     

病理性瘢痕成纤维细胞Fas 受体及Bcl-2 蛋白的表达

目的 研究病理性瘢痕成纤维细胞Fas受体及凋亡相关蛋白bcl-2的表达，探讨增生性瘢痕成纤维细胞对Fas介导凋亡的抑制作用。方法 取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各6例，通过细胞培养6～10代后，应用流式细胞仪、粘附式细胞仪分别检测增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas及Bcl-2蛋白的表达。结果 增生性瘢痕成纤维细胞Fas受体呈低表达，而瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas受体强表达。凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞内均呈低表达，两者无显著差异。结论 正常情况下，Fas Mcab能诱导Fas受体表达阳性的细胞凋亡，瘢痕疙瘩成纤维细胞却表现为Fas受体高表达而不凋亡，Bcl-2低表达。实验结果表明，瘢痕疙瘩成纤维细胞不凋亡现象并非Fas受体缺陷或外源性抑制所致，提示瘢痕疙瘩成纤维细胞膜表面高表达的Fas受体可能处于无功能状态。     

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的 探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡，是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人FaseDNA插入真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点之间，以脂质体介导法将目的基因导人瘢痕疙瘩成纤维细胞，FasmAb诱导凋亡；通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果 转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经FasmAb作用后，在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂；琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带；流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常，是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成，与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起．其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。     

成纤维细胞接触性和密度抑制特性对异常瘢痕形成的意义

目的 研究异常瘢痕(瘢痕疙瘩和增生性瘢痕)和正常皮肤成纤维细胞体外完全接触后细胞的增殖和凋亡特性。方法 对6例瘢痕疙瘩、6例增生性瘢痕及6例皮肤标本采用细胞培养、免疫组织化学及凝胶电泳方法通过检测PCNA、P16、Bax、Bcl-2蛋白及特异性DNA梯状条带,对不同成纤维细胞在细胞完全接触后的细胞增殖和凋亡特性进行了研究。结果 ①瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞间完全接触后仍有较强的增殖活性且细胞交叉重叠,细胞未见凋亡;②正常皮肤成纤维细胞完全接触后,细胞增殖活性被抑制,同时有凋亡发生;③增生性瘢痕不同个体细胞的特性不同;④Bax／Bcl-2在三者细胞中的比值未明显改变。结论 不同成纤维细胞接触性抑制和密度抑制特性的改变可能是异常瘢痕发生发展的原因之一。     

黄芪总苷液对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨黄芪总苷液对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响.方法 不同浓度黄芪总苷液(10、20、40ng/mL)干预瘢痕疙瘩成纤维细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;实时(real-time) PCR测定成纤维细胞凋亡抑制基因survivin及细胞凋亡因子p53及Bcl-2的表达;Western blot检测成纤维细胞survivin、p53及Bcl-2蛋白水平表达.结果 MTT法检测发现,与对照组(不加黄芪总苷液)比较,各黄芪总苷液各浓度组细胞490 nm处吸光度(A)值明显降低,瘢痕疙瘩细胞增殖均明显受抑制且呈剂量依赖性(P＜0.05).real-time PCR及Western blot检测结果显示,黄芪总苷液对瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡相关因子survivin、Bcl-2有不同程度的抑制作用,对P53有不同程度的促进作用,且呈浓度依赖性.结论 黄芪总苷液能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,调控其凋亡,从而达到有效治疗瘢痕疙瘩的效果.     

五倍子瘢痕膏水溶液对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

目的探讨五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩的作用机制。方法采取瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养,用四甲基偶氮唑盐比色法测定不同浓度药物对原代培养的第4~8代瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。结果各不同浓度的药物组对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖都有一定的抑制作用(P<0.01),并且有时间和剂量依赖。对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞周期研究表明,各药物组S期的细胞百分比显著高于对照组,其间有显著性差异(P<0.01);而各药物组G2 M期细胞百分比却明显低于对照组,其间有显著性差异(P<0.01),并且这种对S期的阻滞作用和对G2 M期细胞的抑制作用随药物浓度的增加而增强(P<0.05)。结论不同浓度的五倍子瘢痕膏水溶液对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖都有一定的抑制作用,其重要的作用途径是使瘢痕疙瘩成纤维细胞S期的细胞数上升,出现S期阻滞,分裂期的细胞数下降,从而抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,并且这种抑制作用有一定的时间和剂量依赖。     

病理性瘢痕成纤维细胞的增殖调控及Fas基因突变的筛选

目的 从细胞生物学及基因水平探讨正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩周边部和中央部不同生长特性及瘢痕疙瘩发生的可能机制。方法 （１）取手术切除的正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各６例为标本,通过细胞培养６～１０代后,应用流式细胞仪、粘附式细胞仪检测不同来源的成纤维细胞ｐ５３蛋白的表达和细胞周期的分布。（２）取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本,聚合酶链式反应（ＰＣＲ）特异性扩增Ｆａｓ分子外显子     

细菌内重组法高效制备含人Fas基因的重组体腺病毒

目的 制备含人Fas基因的重组腺病毒,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法 应用高效细菌内同源重组系统Ad-Easy,自PMD-T-Fas质粒中切取Fas基因,将Fas基因克隆到穿梭质粒,在BJ5183细菌内重组,最后在293细胞中构建携带Fas基因的重组腺病毒．将腺病毒感染瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测转染前后Fas蛋白的表达的变化及蛋白的功能。结果 通过Ad-Easy系统成功构建高滴度的携带Fas基因的重组腺病毒Ad-Fas,Ad-Fas感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后能稳定提高Fas蛋白的表达,并且在Fas单克隆抗体的诱导下可以发现明显的细胞凋亡。结论 (1)构建的重组腺病毒Ad-Fas在体外实验中能有效地提高瘢痕疙瘩成纤维细胞蛋白的表达,并且可以重建原来阻断的死亡信号传导通道。(2)再次证实了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系,为瘢痕疙瘩基因治疗开辟了一条新途径。     

Apoptosis of keloid-derived fibroblasts induced by Fas gene transfection]

OBJECTIVE: To observe the effect of Fas gene transfection on the apoptosis of keloid-derived fibroblasts. METHODS: The full-length cDNA of Fas was inserted into the multicloning site of the expression vector pcDNA-3.1 by molecular cloning technique, and the recombinant plasmid was transfected into the keloid-derived fibroblasts via lipofectin. Fas monoclonal antibody (mAb) was used to induce the apoptosis of the cells, which was evaluated with HE staining, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry. RESULTS: The expression plasmid pcDNA-3.1-Fas was constructed successfully. Fas mAb induced apoptosis of these fibroblasts transfected with Fas gene, with the typical features of fibroblast apoptosis observed in the treated cells (e.g. typical apoptotic cell nuclei, DNA ladder and high apoptosis rate as determined by flow cytometer), but not in the control cells. CONCLUSION: Blockage of upstream apoptosis pathway in keloid-derived fibroblasts is due to nonfunction of Fas protein, and mutation of Fas gene may be the pathogenesis of keloids.     

瘢痕疙瘩Fas基因外显子1—6基因突变的检测

目的 检测Fas基因外显子1-6，探讨Fas凋亡基因在瘢痕疙瘩组织中的结构异常与临床病理的关系。方法 采用PCR银染技术，检测15例瘢痕疙瘩标本Fas外显子1-6的基因结构。结果 所检测的15例瘢痕疙瘩，2例Fas基因外显子6出现电泳条带增多，测序证实存在基因突变，为插入突变与点突变的混合型突变，且经同源性分析为一新突变位点。结论 少数瘢痕疙瘩病例Fas凋亡基因编码的蛋白无功能可能与其编码跨膜区的基因结构异常有关。     

不同部位瘢痕疙瘩组织中IGF—I、IGF—IR的表达及其意义

目的通过分析瘢痕疙瘩周围部和中央部组织中IGF—I、IGF—IR表达的差异,探讨瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机制。方法收集手术切除的瘢痕疙瘩组织8例及周围正常皮肤组织4例,对不同部位的瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织进行免疫组织化学染色,观察各组中IGF—I、IGF—IR的表达,比较瘢痕疙瘩不同部位和正常皮肤组织中IGF—I．IGF—IR表达的差异。结果正常皮肤组织中成纤维细胞中IGF—I,IGF—IR的表达均呈阴性。瘢痕疙瘩周围组织成纤维细胞中IGF—I的表达明显高于中央部,差异有统计学意义（P〈0．05）;瘢痕疙瘩周围部组织纤维细胞中IGF—IR明显高于中央部,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论瘢痕疙瘩不同部位IGF—I、IGF—IR的表达差异可能是导致瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机制之一。     

瘢痕疙瘩不同部位Bcl-2的表达及其意义

目的分析瘢痕疙瘩浸润部、增生部和老化部凋亡蛋白Bcl-2表达差异以探讨瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机制。方法取手术切除的瘢痕疙瘩组织反正常皮肤各12例为标本，对12例瘢痕疙瘩组织和正常皮肤行白细胞介素2免疫组织化学染色，比较瘢痕疙瘩不同病理部位和正常皮肤Bcl-2差异。结果瘢痕疙瘩浸润部Bcl-2明显高于增生部、老化部和正常皮肤，差异有显著性（q=4．29，P〈0．05），瘢痕疙瘩增生部Bcl-2明显高于老化部和正常皮肤，差异有显著性（q=4．20，P〈0．05），而后两者间差异无显著性（P〉0．05）。结论瘢痕疙瘩不同部位Bcl-2的表达差异可能是导致瘢痕疙瘩呈浸润性生长的机制之一。     

病理性瘢痕中c-myc原癌基因的表达

目的探讨原癌基因ｃ－ｍｙｃ的表达与病理性瘢痕形成的相关性。方法应用免疫组化ＳＰ法检测ｃ－ｍｙｃ蛋白在增生 性瘢痕、瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达和分布,并用图像定量分析比较其差异。结果在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的 成纤维细胞中ｃ－ｍｙｃ蛋白呈强阳性表达,与正常皮肤对照组均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中 ｃ－ｍｙｃ蛋白表达升高提示存在ｃ－ｍｙｃ原癌基因的激活,ｃ－ｍｙｃ原癌基因可能参与了成纤维细胞的分化增殖、胶原合成与 降解以及对细胞因子的调控,并导致瘢痕增生。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中细胞凋亡与增殖的研究

应用末端脱氧核苷酰转移酶 (TdT)介导的d UTP生物素缺口末端标记技术 (TUNEL)和免疫组化技术原位检测增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的凋亡细胞和增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达。结果表明 :在上述瘢痕组织中 ,表皮基底层下细胞PCNA阳性评分明显升高 (P <0 .0 5 ) ,而凋亡指数与正常皮肤相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。提示增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成可能与其表皮基底层下细胞过度增殖、凋亡不足有关。