附睾血管内皮生长因子基因慢病毒干扰载体的构建

目的：以血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA 为靶点,设计、构建VEGF 的RNA干扰慢病毒载体,并 对其在大鼠附睾的沉默效果进行验证。 方法：构建3 种附睾VEGF-shRNA 慢病毒表达载体VEGF-shRNA-1、 VEGF-shRNA-2、VEGF-shRNA-3, 提取3 种阳性克隆质粒测序, 转染HEK293-T 细胞后产生慢病毒质粒。大鼠随 机分为空白对照组、NC-shRNA 阴性感染组、VEGF-shRNA-1 感染组、VEGF-shRNA-2 感染组、VEGF-shRNA-3 感染组,将病毒液分别注射到各组大鼠双侧附睾;实时荧光定量 PCR及蛋白免疫印迹检测各组大鼠附睾VEGF 的mRNA 及蛋白沉默效果。结果： 测序结果证明3 种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,VEGF 感染组 mRNA 及蛋白表达量均较阴性感染组和空白对照组明显降低,其中以VEGF-shRNA-3 感染组干扰效果更为有效。 结论：成功设计了VEGF 基因的RNA干扰靶点和制备了VEGF 基因的慢病毒载体,VEGF-shRNA-3 能有效抑制 附睾VEGF 的表达。     

血管内皮生长因子基因反义核酸体外抑制K562细胞生长及机理研究

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸抑制K562细胞生长的机理;以及反义药物的量效和时效关系,揭示VEGF基因新的功能。方法:用反义核酸X7,20-mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染,细胞培养72h,用MTT法计算细胞生长抑制率,采用台盼蓝拒染法每24h观察细胞存活情况并计数,用Giemsa染色观测细胞形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果:反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖关系,并且下调VEGF蛋白的表达,反义药物对K562细胞的凋亡无影响。结论:VEGF反义药物抑制K562细胞生长的机理是抑制细胞增殖,而不是促进细胞凋亡,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。     

血管内皮生长因子基因反义核酸的设计及其对K562细胞增殖的影响

目的:试图用计算机设计并筛选出血管内皮生长因子(VEGF)的高效反义核酸;用实验方法研究VEGF反义核酸对K562细胞增殖的影响。方法:用RNAstructure(version3.7)软件,选择总自由能(overall△G₃₇)相对低的反义核酸,共计7条,长度18-20核苷酸,全硫代修饰;细胞培养72h,采用台盼蓝拒染法观察存活细胞,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白水平,分析反义核酸对K562细胞的作用。结果:筛选出6条反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,均优于阳性对照组(X2)。与随机对照组(X1)相比,最优序列X7组细胞生长抑制率达31.9%、培养液中VEGF蛋白表达抑制率达51.4%,overall△G₃₇与反义药物活性密切相关(r=0.887,P<0.01)。结论:计算机辅助设计有助于获得更好反义药物,VEGF反义药物可抑制K562细胞生长及VEGF蛋白表达,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。     

慢病毒介导的RNA干扰技术应用于抑制黑色素瘤细胞转移的特异性研究

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,对该技术能特异性的抑制黑色素瘤细胞转移进行研究.方法 以人巢蛋白(Human nestin)的信使RNA编码序列作为干扰靶点,把慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,人巢蛋白的“短发夹”RNA(shRNA)表达质粒和阴性对照shRNA表达质粒(不包含所有已知信使RNA),分别感染黑色素瘤细胞株UACC903细胞并流式分选获得高纯度的巢蛋白干扰或对照组细胞.用划痕法检测评估各组黑色素瘤细胞迁移能力.结果 巢蛋白下调的UACC903细胞侵袭能力和迁移能力均下降(P＜0.05).结论 慢病毒介导的RNA能有效地沉默巢蛋白基因的表达,从而能特异性的抑制黑色素瘤细胞迁移.     

VEGF反义核酸增强HL60和K562细胞对柔红霉素敏感性

研究发现恶性血液病细胞高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并不同程度表达VEGF受体[1~2],VEGF在白血病中的作用不够明确,可能是通过自分泌作用机制,促进白血病细胞存活和生长、降低白血病细胞对化疗药物的敏感性等。以前的研究已证实:VEGF反义     

慢病毒介导的c-metRNA干扰对人乳头状甲状腺癌K1细胞生物学行为的影响

目的: 探讨c-Met在乳头状甲状腺癌(PTC)中的表达;构建针对人c-met基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察其对K1细胞c-met基因的沉默效应及对细胞生物学行为的影响。方法: 免疫组化方法检测35例乳头状甲状腺癌及25例良性甲状腺疾病手术切除标本中c-Met的表达;构建人c-met基因的RNAi慢病毒载体,应用荧光定量RT-PCR与Western blotting检测其对c-met的干扰效率,应用克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验检测其对细胞克隆形成、周期、迁移、侵袭能力的影响,应用裸鼠模型评估RNA干扰后细胞成瘤能力的影响。结果: c-Met在PTC中的表达明显高于良性甲状腺组织;成功构建了c-met RNAi慢病毒载体,RT-PCR及Western blotting实验显示其对乳头状甲状腺癌K1细胞c-met mRNA 及蛋白表达的抑制均较明显;克隆形成实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力;流式细胞术检测显示c-met RNAi慢病毒载体能够减少S细胞比列;划痕实验及Transwell实验显示c-met RNAi慢病毒载体能够抑制细胞迁移和侵袭;裸鼠成瘤实验显示RNA干扰后细胞的成瘤能力降低。结论: c-met RNAi慢病毒载体能够抑制K1细胞的克隆形成能力、细胞周期进程、迁移、侵袭及成瘤能力。     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体,PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组(DMEM完全培养液)、DMEM加入polybrene组、EN.iS(Enhance infection solution)组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率,采用Real-timePCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果病8毒滴度为1×10TU/ml,MOI为100时,PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高,转染试剂polybrene对转染效率无明显影响,沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。     

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的：研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组：空载对照组（对照组）和不同浓度（3.125、6.25和12.5 nmol/L）的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞，以实时定量PCR检测结肠癌细胞Cripto mRNA，分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞，接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠，收集裸鼠肿瘤组织，对组织VEGF进行免疫组化染色，计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示，转染组Cripto mRNA被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF 蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示，转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达，可抑制结肠癌组织血管生成。     

NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测

目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体。 方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定。用pGCSIL-GFP-NSBP1 、pHelper1.0和 pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达, MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果。结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×108TU/ml。转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用。结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用。     

酪氨酸激酶抑制剂STI571对K562细胞周期及相关基因表达的研究

为了探讨不同浓度STI571对K562细胞ATM(ataxia telangiectasia mutated)/ATR(ATM-Rad3-Related)基因表达的影响及相应的细胞周期变化和细胞凋亡机制。以不同剂量的STI571作用于K562细胞株,通过联苯胺、吉姆萨2瑞氏染色和流式细胞术证实其分化方向,RT-PCR半定量检测ATM/ATR基因表达,流式细胞术检测BCL-2?Annexin-V和细胞周期。结果随药物浓度升高,K562细胞向红系分化明显,ATM基因表达量增强而ATR基因表达量降低,Bcl-2水平下降,细胞凋亡显著,亚二倍体和G1期细胞数增多,S期和G2/M期细胞减少。不加入药物的K562细胞ATM和ATR几乎不表达。ATM和ATR基因表达水平的变化呈现STI571浓度依赖形式,并与细胞周期改变、细胞凋亡和红系分化相关。     

RNA interference targeting ORC1 gene suppresses the proliferation of vascular smooth muscle cells in rats

Background

The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases such as atherosclerosis and postangioplasty restenosis. The largest subunit of the origin recognition complex (ORC), ORC1, plays a critical role during the initiation of DNA replication in eukaryotes. However, the involvement of ORC1 in the initiation of DNA replication in VSMCs has not been studied yet.

Objective

The aim of this study was to silence ORC1 gene selectively by using RNA interference and analyze the effects of ORC1 gene on the proliferation and apoptosis of rat VSMCs.

Methods

Freshly isolated rat VSMCs were transfected with siRNA targeting ORC1 gene capsulated in liposome. ORC1 protein expression was determined by Western blotting and ORC1 mRNA level by RT-PCR. DNA synthesis was analyzed by ³H thymidine (³H-TdR) incorporation and cell proliferative activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Two apoptosis-related proteins, Bax and Bcl-2, were examined immunohistochemically.

Results

Down-regulation of ORC1 mRNA and protein expression was observed in rat VSMCs at 24 h after transfection with the three pairs of siRNA targeting ORC1 gene and this reduction persisted at least 7 days post-transfection. Down-regulation of ORC1 mRNA (60%) and protein (80%) expression was observed at 72 h post-transfection in the cells transfected with B-ORC1 siRNA. A significant decrease in ³H thymidine incorporation was observed in rat VSMCs with ORC1 gene silencing after serum challenge, but not in the non-silenced control. A significant increase in the proliferation index and a significant decrease in the percentage of cells at G₀/G₁ phase after serum challenge were observed in the non-silenced control, but not in ORC1 gene silenced cells. A significant increase in the ratio of Bcl-2/Bax was observed after serum challenge in the non-silenced control, but only a slight increase was found in the ORC1 gene silenced cells. ORC1 gene silencing disappeared 7 days after transfection. Continuous serum challenge stimulated VSMCs to synchronously reenter the cell cycle as evidenced by increases in [³H] thymidine incorporation, the proliferation index, and the ratio of Bcl-2/Bax, as non-silenced cells were induced to resume cell cycle progression by the addition of 15% fetal bovine serum to the culture medium.

Conclusion

ORC1 gene silencing causes rat VSMCs to enter a reversible G₀ quiescent, growth arrested state; thus, ORC1 gene may be an important new target for suppressing VSMCs proliferation.     

脂质体介导的VEGF基因对培养血管细胞增殖的影响

目的：观察脂质体介导转移的VEGF基因在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达，比较VEG对血管内皮细胞（VEC）及VSMC增殖的影响。方法：将含血管内皮生长因子（VECF）CDNA的真核表达载体pSV121用脂质体介导的基因转移法导入血管平滑肌细胞（VSMC）中，取此VSMC条件培养液，再行血管内皮细胞（VEC）培养，用Northmblot杂交，Westem印迹法及[~3H]胸腺嘧啶核苷掺入法，观察了VEGF在VSMC及其条件培养液中的表达，比较了VEGF对VEC及VSMC增殖的影响。结果：转基因组VSMC中VEGFmRNA呈稳定高表达，转基因组VSMC条件培养液中，VEGF抗原表达显著高于对照组（P均＜0．01），加入此条件培养液的各组VEC的[~3H]胸腺嘧啶核苷掺入量均显著高于对照组（p均＜0．01），而在VSMC组无显著差异。结论：VEGF的转录和表达表明脂质体介导的血管细胞VEGF基因转移是成功的。VEGF具有促VEC增殖作用，但对VSMC无促增殖作用，有利于缺血性疾病及血管再狭窄的防治。     

Tumor necrosis factor enhances susceptibility of vascular endothelial cells to neutrophil-mediated killing

Tumor necrosis factor has a variety of effects on different types of cells in vitro, including endothelial cells. The current studies show that pretreatment of rat pulmonary artery endothelial cells with tumor necrosis factor increases in a time- and dose-dependent manner their sensitivity to killing by neutrophils stimulated with phorbol myristate acetate or C5a. Similar effects are seen with interleukin-1. These data suggest that tumor necrosis factor and interleukin-1 may have important pro-inflammatory effects on endothelial cells.     

Hsp701A的RNA干涉诱导K562细胞凋亡

目的：研究RNA干涉（RNAi）Hsp701A基因的表达及其诱导慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞株K562的凋亡。方法：构建Hsp701A基因小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，转染K562细胞并证实RNAi的有效性。用MTF比色法、AnnexinV-FITC／PI染色和流式细胞术，分别检测K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了Hsp701A siRNA的真核表达载体。将其稳定转染K562细胞后，RNAi组细胞中Hsp701 ARNA和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA能抑制K562细胞增殖并诱导其细胞凋亡，将其阻滞于G1期。结论：RNAi Hsp701A基因诱导的表达有望成为一种新的慢粒的治疗策略。     

Release from alginate enhances the biological activity of vascular endothelial growth factor

A primary factor which limits engineering tissues of substantial size is the lack of nutrients readily available to transplanted cells. One potential solution to this nutrient limitation is to encourage the rapid development of a vascular network within three-dimensional tissue engineering matrices. Vascular endothelial growth factor (VEGF) has been identified as a potent stimulator of angiogenesis in vivo. Though effective at stimulating endothelial cells to form blood vessels VEGF degrades rapidly. Spherical alginate beads (3.3±0.1 mm diameter) were examined as a means of delivering biologically functional VEGF at a controlled rate over extended times. The alginate beads demonstrated the ability to incorporate VEGF with an efficiency between 30 and 67%, depending on the processing conditions, and release it at a constant rate (5%/day) for up to 14 days in vitro. The released VEGF, when assayed for its ability to stimulate endothelial cells in culture, was found not only to be functional but more potent (three to five times) than the same mass of VEGF added directly to the culture medium. The release kinetics of freeze dried VEGF containing alginate beads were also examined and found to be comparable to non-freeze dried samples.     

野生型PTEN基因增强青蒿琥酯抑制K562细胞的作用

 目的: 探讨野生型PTEN转染人白血病K562细胞系对青蒿琥酯敏感性的影响及其分子作用机制。方法: 将野生型PTEN以腺病毒为载体转染(感染复数为200)人白血病K562细胞(Ad-WT-PTEN),同时以转染空载体腺病毒(Ad)及未转染细胞为对照组,与青蒿琥酯(ART)联合作用,观察野生型PTEN增强青蒿琥酯抑制K562细胞的作用。根据IC₅₀计算PTEN对青蒿琥酯的增敏倍数。以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,real-time PCR检测PTEN 的mRNA水平,Western blot检测PTEN、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平;caspase活性检测试剂盒检测caspase-3/7的活性。结果: Ad-WT-PTEN转染K562细胞后,对青蒿琥酯敏感性明显增加,依据IC₅₀计算增敏倍数为2.25倍。至第3天,Ad-WT-PTEN +ART组较Ad+ART组细胞活力下降、凋亡率升高。Ad-WT-PTEN转染K562细胞后PTEN 的mRNA及蛋白表达明显增加,p-Akt水平及caspase-3/7活性下调,以PTEN及青蒿琥酯联合作用组下调尤为明显。结论: 野生型PTEN可能通过降低K562细胞Akt磷酸化的水平,并增加caspase-3/7活性,增强细胞对青蒿琥酯的敏感性。     

靶向血管内皮生长因子基因的微小RNA真核表达载体的构建***

背景：有研究表明微小RNA及潜在靶基因在肝癌中起重要作用,但具体机制仍不清楚。 目的：构建靶向血管内皮生长因子基因微小RNA真核表达载体,评估其转染人肝癌细胞株HepG2后血管内皮生长因子基因的干扰效果。 方法：根据血管内皮生长因子序列设计合成4对微小RNA不同干扰片段,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-微小RNA真核表达载体上,测序分析鉴定插入序列的完整性;并将其转染至HepG-2细胞株中。采用实时荧光定量聚合酶链式反应分析血管内皮生长因子微小RNA干扰效果,蛋白印迹技术测定重组体对血管内皮生长因子基因蛋白表达情况。 结果与结论：构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确,重组体能干扰肝癌细胞HepG2细胞血管内皮因子基因的表达,4组重组体基因的mRNA的表达水平和蛋白表达水平与阴性对照组相比明显降低(P < 0.05),其中血管内皮生长因子微小RNA-3表达水平最低,抑制率87%。结果证实,实验成功构建血管内皮生长因子微小RNA表达载体,在体外能有效抑制HepG2细胞血管内皮生长因子基因表达。关键词：血管内皮生长因子;微小RNA;肝癌;肝细胞;抑制;基因表达;组织工程 缩略语注释：VEGF: vascular endothelialcell growth factor,血管内皮生长因子 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.15.017