Hsp701A的RNA干涉诱导K562细胞凋亡

目的：研究RNA干涉（RNAi）Hsp701A基因的表达及其诱导慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞株K562的凋亡。方法：构建Hsp701A基因小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，转染K562细胞并证实RNAi的有效性。用MTF比色法、AnnexinV-FITC／PI染色和流式细胞术，分别检测K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了Hsp701A siRNA的真核表达载体。将其稳定转染K562细胞后，RNAi组细胞中Hsp701 ARNA和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA能抑制K562细胞增殖并诱导其细胞凋亡，将其阻滞于G1期。结论：RNAi Hsp701A基因诱导的表达有望成为一种新的慢粒的治疗策略。     

犬转铁蛋白受体基因的沉默及稳定感染细胞系的建立

目的通过构建沉默犬转铁蛋白受体(TfR)基因慢病毒载体并感染Walter Reed犬(WRD)细胞,建立稳定感染沉默犬TfR基因的细胞系。方法构建2条针对犬TfR基因的特异性短发夹RNA(shRNA),用慢病毒载体转染HEK293T细胞,包装、收集病毒并测定其滴度。用包装好的慢病毒感染WRD细胞,用实时荧光定量PCR和Western blot法检测TfR的mRNA和蛋白的表达水平以评价干扰效率,筛选沉默效果较好的靶点,并建立稳定沉默TfR基因的WRD/TfR-细胞系。结果成功构建出TfR小干涉RNA慢病毒载体,成功包装2种不同靶点的沉默TfR基因的RNA干扰慢病毒,测定其病毒滴度均达到1×108转导单位(TU)/m L。选用沉默效果较好的p GMLV-TfR A2载体,建立TfR小干涉RNA慢病毒载体稳定感染的WRD/TfR-细胞系。结论成功构建TfR小干涉RNA慢病毒载体并建立了稳定感染WRD/TfR-细胞系。     

小RNA干扰骨桥蛋白抑制人U251细胞的体外生长与侵袭

目的:研究慢病毒载体介导的骨桥蛋白(OPN) RNA干扰对人U251神经胶质瘤细胞体外生长和侵袭的影响,并探讨其对神经胶质瘤生长、侵袭的可能机制.方法:应用本实验室已构建并鉴定的OPN特异性短发卡RNA慢病毒表达载体(LV-OPN shRNA)感染U251神经胶质瘤细胞.RT-PCR检测干扰前、后U251细胞OPN mRNA的表达;免疫印迹法检测干扰前、后U251细胞OPN、MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力的变化;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化;细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果:与未感染组、空载体感染组相比,LV-OPN shRNA感染组OPN mRNA、OPN蛋白及MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达均明显下降;LV-OPN shRNA感染组细胞增殖、侵袭能力及迁移能力也明显下降.结论:慢病毒载体介导的骨桥蛋白RNA干扰在体外能抑制U251细胞OPN mRNA和蛋白表达, 进而抑制U251细胞在体外的生长及侵袭,因此可以推测OPN是促进胶质瘤增殖和侵袭的基因之一,为胶质瘤的治疗提供新的靶点.     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

慢病毒介导B7-2 基因RNA 干扰对小鼠树突状细胞诱导T 细胞增殖的影响

目的:制备沉默小鼠B7-2基因的RNAi慢病毒,研究其对体外诱导培养的小鼠树突状细胞B7-2基因表达的干扰效应及对其刺激T细胞增殖的影响。方法:从Gen Bank获取小鼠B7-2基因序列,在其编码区选择3段RNAi靶序列,构建介导B7-2基因RNAi的双发夹RNA慢病毒表达载体,采用DNA测序进行重组载体鉴定。重组慢病毒表达质粒及包装辅助质粒,在脂质体介导下共转染293T细胞制备重组慢病毒并经超高速离心进行浓缩;浓缩慢病毒颗粒感染293T细胞,根据其介导GFP表达的情况测定病毒滴度。分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,采用GM-CSF及IL-4诱导DC的分化,LPS刺激48 h促进其成熟,并进行形态以及表型鉴定。采用制备的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒感染小鼠骨髓源DC,流式分析其感染效率及对DC表面B7-2分子表达的干扰效率;通过慢病毒感染的DC与小鼠脾脏T细胞混合培养测定慢病毒介导B7-2沉默对DC刺激T细胞增殖能力的影响。结果:小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表达载体构建正确;获得了针对3靶点序列RNAi和阴性对照的浓缩小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒,滴度达(2～4)×10~8TU/ml,重组慢病毒能够有效感染DC及抑制其表面的B7-2分子表达,经小鼠B7-2基因RNAi慢病毒感染及介导B7-2沉默后,DC刺激T细胞增殖的能力显著下降(P0. 05)。结论:慢病毒介导小鼠B7-2基因RNA干扰可沉默DC表面B7-2分子的表达及抑制DC诱导的T细胞增殖效应。     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

CKS2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其抑制卵巢癌A2780细胞增殖

目的构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并探讨CKS2敲除对卵巢癌细胞A2780增殖的影响。方法根据siRNA原理设计两对靶向CKS2的shRNA序列(shRNA1、shRNA2)及阴性对照NC shRNA,并克隆到慢病毒表达载体PLKO.1/puro中;将上述质粒转染到293T细胞并包装出慢病毒,用慢病毒感染卵巢癌细胞A2780,实时定量PCR及Western blot检测CKS2表达;MTT法检测A2780细胞增殖;Western blot检测PARP-1的剪切;流式细胞术检测凋亡。结果成功构建CKS2 shRNA慢病毒表达载体能明显降低A2780细胞中CKS2 mRNA及蛋白表达(P0.05);能显著抑制A2780靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并包装出慢病毒;感染A2780细胞后,细胞增殖受抑(P0.05);能诱导PARP-1蛋白的剪切及凋亡(P0.05)。结论成功构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,能显著抑制A2780细胞增殖。     

环氧合酶抑制剂塞来昔布促进酪氨酸激酶抑制剂STI571抗白血病效应的研究

目的：探讨环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)促进酪氨酸激酶抑制剂STI571的抗白血病效应及其机制。方法：以不同浓度的celecoxib与STI571组合孵育K562细胞，光镜、荧光显微镜观察细胞形态，MTT比色法观察两者对细胞的生长抑制情况，流式细胞术作DNA倍体分析及细胞凋亡线粒体流式检测，半定量RT-PCR法分析相关基因的表达。结果：(1) Celecoxib可促进STI571抑制白血病细胞增殖的能力，0.25 μmol/L STI571与40.0、60.0 μmol/L的celecoxib联用抑制率分别为76.1%±1.6％、91.5%±0.4％，明显高于单药组60.0%±2.0％(0.25 μmol/L STI571)、34.7%±0.5％(40.0 μmol/L celecoxib)、49.8%±1.8％(60.0 μmol/L celecoxib) (P<0.05)。(2)单用celecoxib时未检测到细胞凋亡发生，但与STI571联用时可显著增强STI571诱导凋亡的能力，表现为明显凋亡形态学改变，亚G1期细胞及线粒体凋亡百分率显著增高，其中0.25 μmol/L STI571与40 μmol/L celecoxib联用时分别为20.6%±3.6％、31.3%±4.3％，高于STI571单药组(分别为3.0%±0.6％、3.2%±0.4％)(P<0.05)。(3)单用celecoxib、STI571对COX-2表达没有影响，而联用则COX-2显著下调(P<0.05)，但联用及单用对VEGF表达均没有影响(P>0.05)。结论：单用celecoxib仅抑制K562细胞增殖，而联用STI571可明显降低K562细胞对STI571的效应阈值，促进STI571诱导的增殖抑制和凋亡。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

血管内皮生长因子基因反义核酸体外抑制K562细胞生长及机理研究

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸抑制K562细胞生长的机理;以及反义药物的量效和时效关系,揭示VEGF基因新的功能。方法:用反义核酸X7,20-mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染,细胞培养72h,用MTT法计算细胞生长抑制率,采用台盼蓝拒染法每24h观察细胞存活情况并计数,用Giemsa染色观测细胞形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果:反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖关系,并且下调VEGF蛋白的表达,反义药物对K562细胞的凋亡无影响。结论:VEGF反义药物抑制K562细胞生长的机理是抑制细胞增殖,而不是促进细胞凋亡,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。     

TCAB1基因RNAi慢病毒载体的构建及在人子宫内膜间质细胞中沉默TCAB1基因的效应

目的构建TCAB1基因RNAi慢病毒载体,为子宫内膜异位症(EMs)的基因靶向治疗提供理论依据。方法化学合成3条靶向TCAB1基因的siRNA,转染HEK-293T细胞,24h后采用荧光素酶报告系统筛选有效siRNA,其对TCAB1mRNA有明显抑制作用。针对已经筛选确定的TCAB1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoI和HpaI酶切后的LV1载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV1-shRNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV1-shRNA、pRev、pVsvg、pcgv四质粒共转染包装细胞HEK-293T细胞,包装产生慢病毒,分别于转染后48h、72h收取病毒上清,感染人子宫内膜间质细胞(ESC),进行RT-qPCR检测TCAB1基因相对表达量,检测LV1-shRNA干扰效率。结果 PCR和测序证实,成功构建TCAB1 shRNA的慢病毒载体LV1-shRNA。结论成功构建TCAB1基因的RNAi慢病毒载体,其转染ESC细胞后显著抑制了TCAB1的表达,为子宫内膜异位症的基因靶向治疗提供了实验基础。     

VEGF_(165)真核表达载体的构建及其对白血病细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子的真核表达载体,探讨其对白血病细胞的增殖以及化疗药物敏感性的影响。方法:应用常规基因克隆方法构建pEGFP-C1-hVEGF165真核表达载体,转染白血病细胞K562,采用CCK8法检测重组质粒对细胞增殖的影响,RT-PCR方法检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达水平,ELISA方法定量检测细胞培养液和细胞内VEGF蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞周期。结果:经酶切鉴定和基因测序证实成功构建了VEGF165真核表达载体。稳定转染pEGFP-C1-hVEGF165的K562细胞较转染pEGFP-C1空质粒的K562细胞增殖加快,VEGF165 mRNA表达明显增加,细胞分泌VEGF蛋白水平上调。转染pEGFP-C1-hVEGF165还可以提高白血病细胞在化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶作用时的细胞存活率。结论:VEGF165真核表达载体可以上调白血病细胞K562的VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达水平,从而促进白血病细胞的增殖,同时可以降低白血病细胞对化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶的敏感性。     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。     

ANX A2在抗磷脂抗体诱导THP-1细胞组织因子表达中的作用

目的： 构建针对人膜联蛋白A2（ANX A2）的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体,转染THP-1细胞,探讨ANX A2在抗磷脂抗体（APL）诱导单核细胞组织因子（TF）表达中的作用。方法：设计4条ANX A2特异性RNAi的寡核苷酸序列,与慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,PCR及测序鉴定正确后,Western蛋白印迹法筛选出有效干扰序列。包装293T细胞获得重组慢病毒LV-RNAi-ANX A2,感染单核细胞株THP-1,观察细胞ANX A2 mRNA和蛋白表达下降程度。再用APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,观察TF mRNA表达及TF活性变化。结果：成功构建RNAi慢病毒载体并筛选出有效干扰片段;包装293T细胞后病毒滴度为3×1012TU/L;感染THP-1后细胞ANX A2 mRNA和蛋白均被沉默。APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,其TF表达下降至基础水平。结论：构建的慢病毒表达载体能显著抑制THP-1细胞ANX A2的表达,进而影响APL诱导的TF表达,证明ANX A2在APL诱导的单核细胞表达TF过程中具有重要作用。     

EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定

目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.