成骨细胞与骨髓间充质干细胞DNA甲基化差异的实验研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)与成骨细胞(OB)在体外传代培养过程中DNA甲基化的差异,并分析BMSCs与OB成骨表型基因甲基化状态与其mRNA表达的相关性.方法 采用甲基化特异性-聚合酶链反应(MSP)方法检测BMSCs、OB基因组DNA中骨钙素(0C),Osterix(OSX)、Runx2等成骨表型和转录基因与抑癌基因p16的甲基化状态,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测上述成骨表型基因的mRNA表达.同时以茜紊红染色法鉴定OB.结果 OC、OSX、Runx2基因在体外培养的各代BMSCs中呈高甲基化.状态,未检出这些基因的mRNA表达;在OB中,OC、OSX、Runx2基因均呈低甲基化状态,且相应基因mRNA均呈阳性表达.p16在BMSCs和OB中均呈低甲基化状态.BMSCs与OB分别在体外稳定培养5代,各代的成骨表型基因的甲基化状态和mRNA表达量的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论 DNA甲基化模式在BMSCs和OB中呈现出细胞特异性差异,且基因甲基化状态可能控制着相应基因的表型表达.在体外稳定培养、传代的条件下,BMSCs和OB均能呈现基因组稳定的特征,未发生明显的DNA甲基化模式的改变,为临床安全应用BMSCs莫定了理论基础.     

不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响

目的:比较野生型和突变型(58 bp缺失)DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响. 方法:将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),用RT-PCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβ mRNA水平的表达,MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期. 结果:转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中,都有外源基因mRNA水平的表达;转染突变型(58 bp缺失)polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞,差异有统计学意义(P<0.05). 而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响(P>0.05). 结论:高表达外源性野生型和突变型DNA polβ,对CHO细胞生长具有不同的影响.     

苯代谢物氢醌对K562细胞WRN基因转录及表达的影响

目的 探讨苯代谢物氢醌(HQ)对人白血病细胞K562中解旋酶WRN基因mRNA转录及蛋白表达的影响.方法 常规培养白血病细胞K562至生长对数期,低剂量HQ组、中剂量HQ组、高剂量HQ组分别以15、30、60μmol/L浓度HQ重复间隔柒毒48及72 h,以等体积的PBS培养的细胞组为空白对照组.采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测细胞DNA损伤;采用Taqman探针实时荧光定量PCR法检测WRN基因mRNA水平,采用免疫印迹分析WRN基因蛋白表达水平,计算mRNA及蛋白的相对表达量.结果 (1)HQ可导致细胞DNA损伤,且损伤效应随染毒浓度增加而增大,72 h比48 h的DNA损伤程度增加,呈时间-剂量依赖性;(2)HQ染毒48 h,WRN基因mRNA在各组差异均无统计学意义(P＞0.05);HQ染毒72 h,各剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),低、中剂量组与高剂量组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),低剂量组与中剂量组组间差异无统计学意义(P＞0.05);(3)HQ染毒48 h,WRN蛋白相对表达量在各组差异无统计学意义(P＞0.05);HQ染毒72 h,各剂量组与空白对照组比较,蛋白表述随着染毒剂量增大而降低,差异有统计学意义(P＜0.05),HQ各剂量组之间两两比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HQ可导致K562细胞DNA损伤,且呈时间-剂量依赖性,其机制可能与HQ下调WRN基因mRNA转录及蛋白的表达有关.     

mRNA差异显示

差异基因的分离,对细胞生命过程中调节机制的研究以及致病机制的探讨极有价值.分离差异基因的方法多种多样,但根据所分差异基因性质的不同,可粗略分成两大类:①差异基因的分离,常用方法主要有消减杂交法[1]及其改进[2,3],随机引物多态性DNA聚合酶链反应(AP-PCR)[4]等.②差异表达基因的分离,常用方法有两种:①RNA任意引物PCR指纹分析(RAP)[5],②mRNA差异显示(mRNA dd)[6].此外,用于差异表达基因分离的还有AFLP介导的RNA指纹图[7]及双相电泳cDNA指纹分析[8].本文主要对mRNA DD作一简单介绍.     

类风湿关节炎患者外周血TWEAK基因启动子区甲基化状态及其表达

目的:通过检测外周血肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)基因DNA甲基化水平、mRNA表达水平及血清蛋白浓度,探究TWEAK基因与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)发病机制的关联。方法:采用MassARRAY法检测112例RA患者和86例匹配的健康志愿者外周血TWEAK基因DNA甲基化水平,采用实时荧光定量PCR法检测外周血TWEAK基因mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附测定法检测血清TWEAK蛋白浓度。比较RA组和健康对照组TWEAK基因DNA甲基化水平、mRNA表达水平及血清蛋白浓度,并分析其与疾病活动度的关系。结果:RA组TWEAK基因总体甲基化水平和CpG_11、CpG_17.18.19.20、CpG_40.41.42位点甲基化水平高于健康对照组(P=0.002,P=0.01,P=0.006,P=0.002),高疾病活动度组CpG_55.56位点甲基化水平高于中低疾病活动度组(P=0.041)。RA组外周血TWEAK基因mRNA表达水平低于健康对照组(P=0.023),高疾病活动度组TWEAK基因mRNA表达水平低于中低疾病活动度组(P=0.035)。RA组血清TWEAK蛋白浓度与健康对照组差异无统计学意义(P=0.508), 但其与mRNA表达水平呈正相关(r=0.482,P<0.001)。结论:TWEAK基因与RA的发病和病情活动程度密切相关,其高甲基化状态可能为调控mRNA低表达的表观遗传学机制之一,可作为临床监测和评价RA病情的重要指标之一。     

DNA修复因子MGMT甲基化与子宫颈癌的相关性研究

目的 探讨O6-甲基鸟嘌呤- DNA甲基转移酶(O6 - methylguanine - DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子区甲基化状态与子宫颈癌的相关关系.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation - specific PCR,MSP)分析子宫颈癌组织中MGMT基因启动子区甲基化状态,结合定量PCR( RT - PCR)检测MGMT mRNA表达情况行综合分析.结果 宫颈癌组织中MGMT基因启动子甲基化率达71.15％ (37/52),而非癌对照组织中均无甲基化.不同临床分期的宫颈癌组织MGMT甲基化率也各不相同(P＜0.01),组织分化程度越低,MGMT甲基化率越高(P＜0.05).37例甲基化的癌组织中有MGMTmRNA表达,不同临床分期和不同组织分化程度的MGMT mRNA表达量差异均有统计学显著性(P＜0.01).结论 DNA修复因子MGMT甲基化影响其mRNA的表达,可能与子宫颈癌的发生存在联系.     

结肠腺癌与正常黏膜组织RP基因mRNA表达差异分析

目的:探讨结肠腺癌与正常黏膜组织中核糖体蛋白(Ribosomal protein,RP)基因mRNA的表达差异.方法:用基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)方法对结肠腺癌组织及正常黏膜组织中核糖体蛋白基因mRNA的表达进行分析.结果:在结肠腺癌和正常黏膜组织中共出现了101种RP基因或RP类似基因的表达,其中有6种仅在正常黏膜中表达,有17种仅在腺癌中表达,41种RP基因在癌组织中表达明显升高.结论:在结肠腺癌和正常黏膜中均有多种RP基因表达,但两者之间存在明显差别.     

前列腺癌及良性增生组织中DNA聚合酶β、PTEN及Ha-ras基因mRNA检测

目的:探讨前列腺癌(Pca)及良性前列腺增生(BPH)组织中DNA聚合酶β(polβ)、PTEN及Ha-ras基因mRNA的表达.方法:应用RT-PCR法检测12例Pca组织及20例BPH组织中polβ、PTEN及Ha-ras基因mRNA的表达状况.结果:与BPH组织比较,Pca组织中polβ、Ha-ras基因mRNA表达增高,PTEN基因mRNA表达降低(P均＜0.01).Pca组织中polβ与Ha-ras基因mRNA的表达呈正相关(r=0.67,P＜0.05),PTEN与polβ、Ha-ras基因mRNA的表达呈负相关,r分别为-0.58、-0.71,P均＜0.05,结果:polβ及Ha-ras的表达上调及PTEN的表达下调是Pca发生中的重要分子事件.     

人肺腺癌吉西他滨耐药细胞系的耐药机制

目的 研究人肺腺癌吉西他滨耐药细胞系A549-Gem的耐药机制。方法 免疫组织化学法检测人肺腺癌吉西他滨耐药细胞系的P-糖蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)法检测多药耐药基因(mdr1)以及脱氧胞苷激酶(dCK)mRNA的转录,并采用基因芯片检测了A549和A549-Gem的基因表达谱。结果 A549-Gem中P一糖蛋白(P—gp)呈弱阳性表达,A549未见表达。。A549-Gem细胞中出现mdr1的mRNA转录增加,却未检测到dCK mRNA的产物。基因芯片检测A549和A549-Gem基因表达谱,结果表明,18．8％的基因出现差异表达,包括癌基因和抑癌基因、细胞周期相关基因、热休克蛋白基因、细胞凋亡相关基因、DNA转录因子(如锌指蛋白等)、DNA修复和重组基因、信号传导基因、蛋白翻译基因以及大量的代谢相关基因。结论 肺腺癌细胞对吉西他滨的耐药既与dCK缺乏相关,也有mdr1／P—gp高表达的参与。在肺腺癌细胞对吉西他滨产生耐药的过程中,发生了多种基因表达的变化,提示耐药的产生是多因素参与的复杂生化过程。     

APC基因在宫颈癌及其癌前病变中的表达及相关性

目的:探讨APC基因在HPV16感染的宫颈癌及其癌前病变中的表达情况及相关性.方法:将接受手术的33例宫颈癌患者和28例宫颈上皮内瘤变(CINⅢ)患者分为宫颈癌组和CINⅢ组,同期手术的31例子宫肌瘤或子宫腺肌症患者作为对照组;3组患者术前均行宫颈细胞凯普导流杂交人乳头瘤病毒DNA(HPV DNA)检测HPV16,计算HPV16 DNA阳性表达率;RT-PCR及免疫组化方法检测APC mRNA及APC蛋白的表达,分析宫颈癌及CINⅢ组中HPV16 DNA阳性率与APC mRNA及蛋白表达的相关性.结果:宫颈癌组与CIN Ⅲ组的HPV16 DNA阳性率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);宫颈癌组APC mRNA及蛋白的阳性表达率低于照组,差异有统计学意义(P ＜0.05);CINⅢ组APC mRNA表达率与对照组差异无统计学意义(P＞0.05);宫颈癌及CINⅢ组中HPV16 DNA阳性率与APC mRNA及蛋白的表达呈负相关性(r=-0.573,-0.616;r=-0.573,-0.654;P＜0.05).结论:APC基因与HPV16可能共同参与了宫颈由正常至CIN进而发展为宫鳞癌的恶性转变过程.