泉州地区拉米夫定抗乙肝病毒治疗YMDD变异

目的 检测泉州地区乙肝病毒YMDD变异的类型,探讨拉米夫定治疗后及未接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者中乙肝病毒(HBV)发生YMDD变异情况.方法 采用聚合酶链反应(PCR)结合Taqman荧光技术对泉州地区114例慢性乙肝患者进行HBV YMDD检测,一组66例接受拉米夫定治疗及保肝治疗,另一组48例为对照组只给予保肝治疗,治疗1年对患者HBV多聚酶基因YMDD基序定性检测,观察是否有突变.结果 拉米夫定治疗组在用药1年后有24例发生YMDD突变.其中YVDD变异有15例,YIDD变异有6例,YIDD YVDD变异有3例,其中变异株中有15例,伴有HBV DNA、ALT高于正常水平;而对照组有17例发生YMDD突变.其中YVDD变异有9例,YIDD变异有4例,YIDD YVDD变异有4例.结论 泉州地区乙肝病毒变异株主要是YVDD型,在未经抗病毒治疗的慢性乙肝患者中存在YMDD变异株,临床上在应用拉米夫定对慢性乙型肝炎惠者进行抗病毒治疗前,应对患者是否存在YMDD变异加以重视.     

海南地区拉米夫定抗乙肝病毒治疗YMDD变异

目的：探讨拉米夫定治疗后乙肝病毒发生YMDD变异情况，及未接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者中是否存在天然变异的情况。方法：采用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman荧光技术对海南地区110例慢性乙肝患者进行HBV YMDD检测，一组80例接受拉米夫定治疗及保肝治疗，另一组30例为对照组只给予保肝治疗，治疗1年对患者HBV多聚酶基因YMDD基序定性检测，观察是否有突变。结果：拉米夫定治疗组在用药1年后有31例发生YMDD突变．其中YIDD变异有15例，YVDD变异有7例，YIDD＋YVDD变异有9例，变异株中有19例伴HEV DNA、ALT水平高于正常水平；而对照组有11例发生YMDD突变．其中YIDD变异有2例．YVDD变异有1例．YIDD＋YVDD变异有8例。结论：在未经抗病毒治疗的慢性乙肝患者中存在YMDD变异株，临床上在应用拉米夫定对慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗前．应对患者是否存在YMDD变异加以重视。     

拉米夫定抗乙肝病毒治疗YMDD变异研究

目的]探讨拉米夫定治疗后乙肝病毒发生YMDD变异情况，及未接受拉米夫定治疗的乙型肝炎患者中是否存在天然变异的情况。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman荧光技术对海南地区110例慢性乙肝患者进行HBVYMDD检测，一组80例接受拉米夫定治疗及保肝治疗，另一组30例为对照组只给予保肝治疗，治疗1年对患者HBV多聚酶基因YMDD基序定性检测，观察是否有突变。[结果]拉米夫定治疗组在用药1年后有31例发生YMDD突变，其中YIDD变异有15例，YVDD变异有7例，YIDD＋YVDD变异有9例，变异株中有19例伴HBVDNA、ALT水平高于正常水平；而对照组有11例发生YMDD突变，其中YIDD变异有2例，YVDD变异有1例，YIDD＋YVDD变异有8例。[结论]在未经抗病毒治疗的慢性乙肝患者中存在YMDD变异株，l临床上在应用拉米夫定对慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗前，应对患者是否存在YMDD变异加以重视。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的探讨拉米夫定治疗1年后慢性乙型肝炎（CHB）患者发生YMDD基序变异的状况及其检测方法。方法采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA含量，荧光PCR法和变性高效液相色谱法检测HBV YMDD基序变异。结果61例CHB患者经过拉米夫定治疗1年后，40例（65．6％）HBV DNA阴转；在21例HBV DNA阳性患者中，10例为YMDD野生型，11例出现YMDD基序变异，变异率达18．0％（11／61）。在11例基序变异中，完全变异7例（63．6％），部分变异4例（36．4％）。在完全变异型中，YIDD变异型5例，YVDD变异型2例；在部分变异型中，YIDD变异型3例，YVDD变异型1例。结论CHB患者拉米夫定治疗1年后，出现较高的YMDD基序变异率。利用荧光PCR法结合变性高效液相色谱法检测基序变异，经济便捷，可作为CHB患者YMDD基序变异的常规监测。     

Taqman MGB探针分型技术检测HBV YMDD 变异及临床应用研究

摘　要: 目的：建立一种快速准确的HBV YMDD变异检测方法，用于乙肝患者拉米夫定治疗中耐药性突变的监测。方法：采用三种特异性TaqmanMGB探针和一对共同引物，建立了检测HBV YMDD变异的荧光定量PCR方法。分别针对总HBV 、YIDD变异、YVDD变异的三管并行检测，可以确定YMDD变异的类型及其在病毒群中的比例。对YMDD野生株、YIDD变异株、YVDD变异株的病毒质粒经过梯度稀释进行检测验证。以序列直接测定法作为诊断YMDD 变异的金标准，对该方法YMDD变异检测的灵敏度、特异性和诊断符合率作评价。并对112例经拉米夫定治疗的血清HBV DNA持续阳性的乙型肝炎患者检测其YMDD变异情况。结果　该方法在105--108Copies/ml 的YMDD野生株、YIDD变异株、YVDD变异株检测中匀未出现非特异性扩增信号；相同浓度的YMDD、YIDD、YVDD在三种不同探针的反应管中的扩增效率基本一致；病毒野生株与YVDD变异株的实际混合比例与计算比例基本一致；该方法检测YIDD、YVDD的最低检测界限为1000 Copies/ml，能在106Copies/ml病毒群中检出0.1%的变异株的存在。以直接测序方法为金标准，该方法YMDD变异检测的灵敏度100%、特异性96%，诊断符合率97.5%。该方法检测112例经拉米夫定1--3年治疗血清HBV-DNA持续阳性的乙型肝炎患者37 例发生YMDD 变异,阳性率27.2%。结论：该方法能够直接检测HBV YMDD变异的类型及其在病毒群中的比例，具有快速、灵敏、准确、经济实用等优点，适合临床实验室开展拉米夫定耐药性突变的监测。     

慢性乙型肝炎患者服用拉米夫定耐药YMDD变异检测及对HBV表面抗原蛋白前S2影响的研究

目的探讨口服拉米夫定1年的慢性乙型肝炎患者产生耐药后,HBVC区发生YMDD变异的情况及对膜蛋白前S2(HBVS2)影响的研究。方法应用实时荧光定量PCR,检测150例服用拉米夫定抗乙型肝炎病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者产生耐药后,血清中HBVC区YMDD变异;同时,应用ELISA法检测实验组(产生耐药)与对照组(未产生耐药)患者的血清膜蛋白前S2。结果产生耐药后突变66例,未突变51例,野生株33例。突变66例中YIDD突变7例;YVDD突变8例;YM-DD/YIDD突变12例;YMDD/YVDD17例,YMDD/YIDD/YVDD22例。对照组HBVS2阳性32例;实验组HBVS2阳性78例。结论产生耐药后,YMDD突变率为44%,以YMDD/YIDD/YVDD突变为主,与其他文献报道有所不同。产生耐药后,HBVS2的表达增加,说明耐药后HBV病毒出现活动性复制,从而及时指导临床调整治疗方案,避免延误病情。     

引物延伸/变性高效液相色谱检测HBV拉米呋啶耐药突变

目的建立引物延伸/变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测HBV拉米夫定耐药突变的方法。方法本法只需单条引物一次延伸反应便可检测野生株YMDD型、突变株YIDD和YVDD型。其中,突变株YVDD型被延伸1个碱基(G),突变株YIDD型被延伸4个碱基(ATTG/ATCG),野生株YMDD型被延伸3个碱基(ATG),延伸产物用DHPLC检测长度;构建野生株YMDD型、突变株YIDD型和YVDD型质粒,对方法进行检验;用商品试剂和临床标本对方法进行验证。结果野生株YMDD型、突变株YIDD型和YVDD型克隆质粒验证结果完全符合;临床56例标本的检测结果与商品化试剂(熔解曲线法)结果完全符合。结论引物延伸/DHPLC检测HBV基因拉米夫定耐药突变是一个高特异性、高可靠性的方法。     

用套式基因扩增技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD变异

目的了解套式基因扩增(nested PCR)技术在检测HBV P基因区酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)变异中的敏感性和特异性.方法用套式基因扩增技术对3组共85例慢性乙型肝炎患者血清进行YMDD变异检测,检测结果经琼脂糖凝胶电泳判断.第1组40例未经拉米夫定治疗,HBV DNA>5×105拷贝/ml;第2组24例经拉米夫定治疗6～18个月,HBV DNA≤5×105拷贝/ml;第3组21例经拉米夫定治疗6～18个月,HBV DNA>5×105拷贝/ml.结果第1组检出YVDD 2例、YVDD+YIDD 1例,检出率为7.5%;第2组检出YVDD、YIDD各1例,检出率为8.3%;第3组检出YVDD 4例、YIDD 2例、YVDD+YIDD 3例,检出率为42.9%.结论套式基因扩增技术检测YMDD变异具有较高的敏感性和特异性,适合变异株快速检测,尤其适合检测处于弱势的YMDD变异株.     

慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定治疗发生HBV YMDD变异的研究

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者应用拉米夫定治疗发生HBV YMDD变异后与患者血清HBVDNA载量关系的临床意义.方法 选择46例应用拉米夫定治疗并发生HBV YMDD变异的CHB患者,另选择未发生HBV YMDD变异的CHB患者作对照组.探讨血清HBVDNA载量与HBV YMDD变异类型、变异发生时间的关系.结果 CHB患者接受拉米夫定治疗前,HBV YMDD变异组HBVDNA载量明显高于HBV YMDD未变异组（P〈0.01）.HBV YMDD变异类型（YVDD、YIDD、YVDD/YIDD）的分布与血清HBVDNA载量无相关性.HBVDNA载量与发生HBV YMDD变异的时间有相关性.随着HBVDNA载量的升高,发生HBV YMDD变异的时间越来越早.结论 应用荧光定量PCR方法检测血清HBVDNA载量和HBV YMDD变异,可动态观察CHB患者拉米夫定治疗后发生HBV YMDD变异的情况,对临床治疗和观察预后具有重要的临床意义.     

实时荧光PCR监测HBV感染患者拉米夫定治疗病毒YMDD变异

目的 建立一种快速准确的实时荧光PCR方法检测HBV感染患者经拉米夫定治疗后YMDD变异情况.方法 首先用PCR法筛选HBV DNA阳性血清157例,HBV DNA含量为2.0×103～8.0×108拷贝/ml,HBV DNA阴性血清30例,然后采用TaqMan探针技术和选择性引物的实时荧光PCR对其进行YMDD变异检测.通过变异株和对照管的循环阈值(cycle threshold,Ct值)差来计算血清中总HBV中的YMDD变异株含量,并用PCR产物直接测序方法随机对69例HBV DNA阳性标本RT区进行基因序列分析,验证所建立方法的准确性.结果 187例接受拉米夫定治疗患者血清标本中,发生YMDD变异88例,其中YIDD变异39例,YVDD变异38例,YIDD与YVDD混合变异11例.突变株的含量为10%～100%.30例HBV DNA阴性血清的C管循环40次,69例测序结果显示68例两种方法检测结果完全相同,符合率为98.55%.结论 采用选择性引物和TaqMan探针技术建立实时荧光PCR方法能快速准确地检测YMDD变异情况,并能检测患者变异株在HBV总量中的比例,为临床使用拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染监测耐药性提供一种有效方法.     

乙型肝炎病毒YMDD自然变异与抗病毒治疗后变异特点

目的了解未经拉米夫定抗病毒治疗的慢性乙型肝炎（CHB）患者和经拉米夫定治疗后的CHB患者乙型肝炎病毒基因组P区多聚酶YMDD变异情况,观察其特点。方法选择未接受过抗病毒治疗的CHB患者119例和经拉米夫定治疗后无明显效果的CHB患者30例,采用荧光标记杂交双探针聚合酶链反应熔解曲线法（FH—PCR—MC）对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测。结果119例未接受过抗病毒治疗的患者,变异检出率为19．3％（23／119）,23例出现自然变异毒株的患者,其体内病毒均为变异株与野生株共生,且变异株为非优势株,变异株在总病毒量中所占的比例均在50％以下,变异类型以YVDD为主（20例）。30例经拉米夫定治疗的患者变异检出率为56．7％（17／30）,17例阳性患者有11例患者体内病毒完全为变异毒株,仅6例患者为变异株与野生株共生,且变异株为优势株者占83．3％（5／6）;在变异类型上YVDD占8例,居多;YVDD与YIDD同时阳性占3例。结论未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株,且变异株皆与野生株共生,变异株为非优势株。经拉米夫定治疗后的变异多数为完全变异,少数为变异株与野生株共生,且变异株大多为优势株。     

Quantitative subtyping of hepatitis B virus reveals complex dynamics of YMDD motif mutants development during long-term lamivudine therapy

BACKGROUND/AIMS: Treatment of chronic hepatitis B (CHB) with lamivudine (3TC) is limited by development of drug-resistant mutants at the YMDD motif. We aimed to validate the use of mass spectrometry to detect YMDD mutants and quantify viral subpopulations. METHODS: A total of 21 Chinese patients with severe acute exacerbation of CHB treated with 3TC were studied. Serial serum samples were tested for wild-type and YMDD mutants using matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. INNO-LiPA assay was performed for comparison. RESULTS: At a median follow-up of 192 weeks, 11 patients developed YMDD mutants (six had YIDD, four had YVDD and one had YV/IDD). Mass spectrometry was concordant with INNO-LiPA in all but one patient, in which INNO-LiPA detected coexistence of YIDD and YVDD but mass spectrometry and direct sequencing detected YVDD only. Mass spectrometry was able to reliably detect a minor hepatitis B virus (HBV) subtype at 5% or above. By serial quantitative measurement, several patterns of viral dynamics were observed. In some cases, YMDD mutants dominated the whole viral population. In other cases, the proportion of YMDD mutants fluctuated with time. When more than one mutant was present (that is, YIDD and YVDD), the different mutants might dominate during different time periods. CONCLUSIONS: Mass spectrometry is an accurate and cheap method for the detection of YMDD mutants, even in the presence of overwhelming wild-type HBV. We observed some intriguing mutant viral dynamics during 3TC treatment. Further studies are needed to clarify whether they have any clinical significance.     

90例HBV基因型与拉米夫定疗效的研究

目的 :探讨乙肝病毒 (HBV)基因型与拉米夫定疗效的关系。方法 :选用 90例慢性乙肝病人 ,采用口服拉米夫定 10 0mg/d治疗 2 4个月。根据HBV前C区保守序列作为通用包被探针 ,HBV不同基因型的序列作为基因分型显色探针 ;另外拉米夫定YMDD及耐药突变的两种形式 (YIDD/YVDD)分别作为显色探针。采用PCR微板双探针杂交ELISA技术进行HBVDNA定量、HBV基因分型、YMDD及突变耐药株 (YIDD/YVDD)的检测。结果 :90例乙肝病人C基因型占 4 3% ,B基因型 30 % ,D基因型 16 % ,混合基因型为 10 %。其中有 1例出现YIDD耐药株(称为先天性耐药 )。口服拉米夫定 12个月后 ,5 14 6 /90 )的病人HBVDNA转阴 (<0 .1pg/ml血清 ) ;YMDD耐药株发生率为 16 % (14 /90 ) ,其中C基因型 6例 ,D基因型 6例 ,混合基因型 2例 ,先天性耐药株对拉米夫定无反应。口服拉米夫定 2 4个月后 ,HBVDNA转阴率为 5 2 % (47/90 ) ,YMDD耐药株的发生率为 2 7% (2 4 /90 ) ,其中D基因型 10例 ,C基因型 9例 ,B基因型 1例 ,混合基因型 4例。结论 :本研究中乙肝病人HBV基因型主要为C型 ,其次为B型及D型。口服拉米夫定后大多数病人可以明显降低DNA水平 ;其YMDD突变耐药株的发生与HBV基因型有关 ,以D型及C型YMDD突变耐药株发生率较高。PCR微板双探针杂交技术不但     

3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法的比较

目的通过多种方法比较分析找到一种高灵敏的检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的方法。方法收集抗病毒治疗1年的慢性乙肝患者样本166例(116例采用拉米夫定治疗、50例采用替比夫定治疗),比较高温连接酶检测反应(LDR)、实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)和测序3种方法检测HBV YMDD变异灵敏性。结果 LDR、Real-time PCR、测序的阳性率分别为23.49%、21.68%、19.27%。3种方法的特异性均为100%。采用拉米夫定治疗的患者中有38例变异,其中YIDD12例、YVDD26例;替比夫定只有1例YIDD变异。结论 LDR方法检测YMDD变异是非常适合临床应用的方案。YVDD变异较YIDD变异更为普遍。     

拉米夫定耐药感染者HBV基因与YMDD变异的相关性探讨

目的探讨拉米夫定耐药感染者HBV基因型与YMDD变异的相关性。方法采用PCR扩增后测序的方法,对162例拉米夫定耐药感染者进HBV基因型的分析。实时荧光定量PCR法检测HBVYMDD变异及HBVDNA载量。率的比较采用Y2检验法,两组均数间的比较采用t检验法。结果162例拉米夫定耐药感染者中,B基因型102例（63．0％）,C基因型60例（37．0％）。YMDD变异111例（68．5％）,其中YIDD变异30例（18．5％）,YVDD变异32例（19．7％）,YIDD／YVDD混合型变异49例（30．3％）。统计结果显示,不同性别之间HBV基因型分布没有显著性差别（P〉0．05）。B型患者的年龄（29．7岁±10．2岁）显著低于C型患者的年龄（35．3岁±11．3岁）,差异有统计学意义（P〈0．05）。YMDD变异的发生率在B、C基因型之间差异无统计学意义（P〉0．05）。C基因型患者血清的HBVDNA含量（6．08±0．71）显著高于B基因型组（5．73±0．90）（P〈0．05）,而血清ALT水平没有显著性差别（P〉O．05）。结论拉米夫定耐药感染者YMDD变异与基因型无关。但C基因型患者平均年龄、病毒载量显著高于B基因型,可能是导致CHB患者对拉米夫定耐药的重要因素。     

建立一种PCR产物直接测序检测HBVYMDD突变的方法

目的 建立检测HBV YMDD变异的PCR产物直接测序法,并与传统实时荧光PCR检测YMDD突变的结果进行比较分析.方法 选取103份慢性乙型肝炎患者血清标本,提取血清HBVDNA.用实时荧光PCR检测YMDD突变;用巢式pcR扩增HBV逆转录酶基因,对PCR产物进行DNA双向测序,NTI软件比对结果.采用Kappa一致性检验对DNA测序法检测的rt204位点突变与实时荧光PCR检测的YMDD突变结果进行比较.结果 PCR产物直接测序法可有效检测低病毒载量标本(500拷贝/ml)和高病毒载量(1010拷贝/ml)标本,同时可以避免高病毒载量标本的抑制效应.与实时荧光PCR相比较,YIDD突变检测符合率为100%,YVDD突变检测符合率97.1%,YIDD与YVDD共生突变符合率76.2%(Kappa=0.853,P<0.01).结论 本研究建立的PCR产物直接测序法检测HBV耐药相关基因突变,灵敏度高,检测范围宽,与实时荧光PCR检测结果有较高的符合率,并可同时检出YMDD、YIDD和YVDD.     

Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo™ probes

BackgroundThe early detection of hepatitis B virus (HBV) mutants in clinical samples is important when monitoring chronic HBV patients with lamivudine-resistant mutations during lamivudine therapy.MethodsThe AllGlo? probes were designed to distinguish between wild-type (YMDD) and mutant (YVDD and YIDD) strains of HBV. The sensitivity and specificity of the assay were evaluated using a series of diluted mixtures of wild-type and mutant plasmids. This assay was compared with direct sequencing and the mutation-specific primer assay.ResultsEach YMDD, YVDD, and YIDD probe only detected its corresponding plasmid. Moreover, the assay correctly identified negative samples from 40 non-HBV infected patients and 100 healthy controls. The detection limit of this assay was 50 copies/ml for YVDD and YIDD. The assay could detect the mutant strains when they were present at ≥ 10% within a mixed virus population. The assay was fully concordant with direct sequencing in 34 samples (56.7%) and partially concordant in 26 samples (43.3%), and detected more types of the HBV motif than direct sequencing.ConclusionsAllGlo? probe assay is a novel, sensitive and specific assay to detect lamivudine-related HBV mutants, therefore, may be useful for monitoring chronic HBV patients treated with lamivudine.