人脐血间充质干细胞抗缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用

背景:抗细胞凋亡成为心力衰竭生物治疗的一个新方向.近年研究发现成体间充质干细胞在一定条件下可转化成心肌样细胞,亦可通过分泌多种细胞因子,促进心脏血管形成和减少细胞凋亡.目的:观察人脐血间充质干细胞对缺氧诱人心肌细胞凋亡的保护作用.方法:将人心肌细胞细胞复苏后,接种在6孔细胞培养板(对照组)和Transwell 3412培养板中;将人脐血间充质干细胞接种在Transwell插件的可渗透性滤膜上;将上述2组细胞置于体积分数95%N2+体积分数5%CO2缺氧环境下缺氧培2,4,12,24 h;检测各组心肌细胞的凋亡率.ELLES法检测细胞条件培养基内胰岛素样生长因子1的浓度.结果与结论:第3代后人脐血间充质干细胞及原代心肌细胞均有胰岛素样生长因子分泌,但人脐血间充质干细胞条件培养基内胰岛素样生长因子1的浓度明显高于人心肌细胞.缺氧可以诱导心肌细胞凋亡,在短期和持续性缺氧的条件下,人脐血间充质干细胞对缺氧诱导的心肌细胞凋亡有保护作用,且人脐血间充质干细胞组心肌细胞凋亡率低于对照组( P < 0.05).提示人脐血间充质干细胞对缺氧诱导的人心肌细胞凋亡有保护作用,这种保护作用可能与通过细胞间直接接触和旁分泌细胞因子有关.     

人胎盘间充质干细胞生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌

背景:由于骨髓源性间充质干细胞的提取造成患者的二次损伤,也存在病毒、细菌污染的可能,扩增、分化能力不高,为此,实验从胎盘中提取间充质干细胞进行研究,了解其分泌抗凋亡细胞因子的情况,探讨其代替骨髓间充质干细胞的可能性。目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞,研究其基本生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌水平。方法:提取人胎盘间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期、凋亡情况及表面标记的表达,研究其增殖和生长特性。ELISA检测血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子的分泌水平。结果与结论:在体外培养条件下,人胎盘间充质干细胞为贴壁生长,为成纤维细胞样,核浆比大,细胞增殖活跃,凋亡率低,可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子。     

人胎盘间充质干细胞生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌

背景：由于骨髓源性间充质干细胞的提取造成患者的二次损伤,也存在病毒、细菌污染的可能,扩增、分化能力不高,为此,实验从胎盘中提取间充质干细胞进行研究,了解其分泌抗凋亡细胞因子的情况,探讨其代替骨髓间充质干细胞的可能性。目的：体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞,研究其基本生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌水平。方法：提取人胎盘间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期、凋亡情况及表面标记的表达,研究其增殖和生长特性。ELISA检测血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子的分泌水平。结果与结论：在体外培养条件下,人胎盘间充质干细胞为贴壁生长,为成纤维细胞样,核浆比大,细胞增殖活跃,凋亡率低,可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子。     

骨髓间充质干细胞旁分泌途径与阿霉素损伤心肌细胞凋亡:怎样证明其抑制效应?

背景:近来研究发现骨髓间充质干细胞移植后短期心功能受益主要是因为其可分泌多种细胞因子,促进了内生性修复过程,而不是心肌细胞的再生.目的:观察骨髓间充质干细胞旁分泌途径对阿霉素损伤心肌细胞凋亡的影响.方法:体外培养的乳鼠心肌细胞按3×10~8~(-1)浓度加入6孔培养板,3 mL/孔,培养72 h后分为3组:阿霉素损伤组、共培养组加入1 mg/L阿霉素作用4 h建立心肌细胞损伤模型,正常对照组不进行任何干预.共培养组取培养至第3代大鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度为3×10~8~(-1),以3 mL/孔加入共培养插件Millicell装置中,预培养24 h,在造模后将Millicell装置插入到预先培养心肌细胞的6孔培养板中,建立共培养体系.检测条件培养基内细胞因子的质昼浓度变化,骨髓间充质干细胞对阿霉素损伤心肌细胞Caspase-9和Caspase-3活性、细胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.结果与结论:与正常对照组比较,阿霉素损伤组胰岛素样生长因子1及肝细胞生长因子的质量浓度、心肌细胞Caspase-3及Caspase-9活性、心肌细胞凋亡率,心肌细胞Bax蛋白表达均明显升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白表达明显降低(P＜0.05).与阿霉素损伤组比较,共培养组胰岛素样生长因子1及肝细胞生长因子的质量浓度、心肌细胞Bcl-2蛋自表达均明显升高(P＜0.05),心肌细胞Caspase-3及Caspase-9活性、心肌细胞凋亡率、心肌细胞Bax蛋白表达均明显降低(P＜0.05).结果证实骨髓间充质干细胞在损伤环境下细胞因子分泌增加,并可通过旁分泌途径抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡.     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景:羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢?目的:检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性.方法:分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50 μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定.结果与结论:羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性.诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性.提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力.     

羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞向血管内皮细胞的体外诱导分化

背景:已证实将血管内皮细胞与具有良好组织相容性的生物材料复合,并移入体内后可增殖分化形成血管.但由于获取内皮细胞时创伤较大,所以细胞来源是一个急需解决的问题.目的:探讨羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成.材料:羊水标本来自孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得60 mL羊水.方法:采用免疫磁珠细胞分选法去除人羊水细胞中CD44和SSEA-4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿间充质干细胞间接得到分离,并在体外进行培养扩增.取第3代羊水来源OCT-阳性胎儿间充质干细胞,诱导组换用含体积分数为15%胎牛血清的内皮细胞生长培养液,对照组持续用原培养液培养细胞.主要观察指标:倒置相差显微镜观察诱导过程中细胞形态变化,采用间接细胞免疫荧光法、内皮细胞吞噬Dil-acLDL法检测诱导效果.结果:诱导30 d后,镜下观察细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观,经诱导的羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞可在体外保持良好的增殖活力.诱导后的贴壁细胞eNOS和、vWF呈阳性表达,细胞胞浆内可见发出红色荧光的Dil阳性细胞;对照组细胞免疫荧光染色eNOS和vWF均呈阴性,且无红色荧光细胞出现.结论:羊水来源的OCT-4阳性的胎儿间充质干细胞在适当的体外微环境下,可诱导分化为血管内皮细胞.     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力

背景:基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少.目的:观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响.方法:贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞.用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率.骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组.在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果与结论:重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%.缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05).缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05).提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关.     

三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景:已证实血管内皮细胞种植于组织工程材料上在体内可增殖分化形成血管,但获取内皮细胞时创伤较大,且来源极其有限.目的:观察在血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1体外联合诱导下,兔骨髓间充质干细胞能否向血管内皮细胞分化.设计、时间及地点:2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成的细胞对照观察.材料:清洁级8周龄日本大耳白兔1只用于骨髓间充质干细胞的分离培养.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均为Peprotech公司产品.方法:兔麻醉后抽取骨髓液,贴壁法 胰酶消化分离培养获得足够数量的骨髓间充质干细胞,分为两组,诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10μg/L血管内皮细胞生长因子、1μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L胰岛素样生长因子1,诱导2周.对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:对诱导后细胞进行形态观察、NO含量测定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色以及电镜观察Weibel-Palade小体形成情况.结果:诱导5d后细胞呈集落样分布,形态趋于圆形;未诱导细胞均匀散在分布,呈长梭形和三角形.诱导14d后,诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组(t=3.75, P<0.05).诱导组表达血管内皮细胞特有表面标志Ⅷ因子,超微结构可见Weibel-Palade小体;对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达.结论:兔骨髓间充质干细胞经上述3种细胞因子体外联合诱导后,可向血管内皮细胞方向分化.     

银杏内酯和神经生长因子影响原代人胚肝细胞的增殖及分泌

目的:如何培养足够的肝细胞以及应用一些物质、因子从而使其增加分裂、减少凋亡?观察银杏内酯和神经生长因子对体外原代培养的人胚肝细胞增殖、凋亡及相关分泌功能的影响具有临床实用性意义。方法:实验于2005-07/2006-10在南通大学神经生物学研究所完成。①细胞来源:孕14～16周流产胎儿,由南通市妇幼保健院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准。银杏内酯由中国药科大学提供,神经生长因子为Roche公司产品。②实验方法:用非灌流法从人胚肝中分离肝细胞,以DMEM作为培养基,接种于4块24孔培养板中,每两块培养板各接种36孔,12孔/组,细胞3×105/孔。银杏内酯组各孔加入含37.5g/L银杏内酯和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2mL,神经生长因子组各孔加入含100mg/L神经生长因子和体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2mL,空白对照组各孔加入仅含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养液2mL。③实验评估:人胚肝细胞原代培养至9d,倒置显微镜下计数每视野的肝细胞数,同时行MTT试验,并用流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况。分别于培养3,6,9d时收集肝细胞培养液进行白蛋白含量检测。结果:①原代肝细胞生长情况及肝细胞计数:接种12h后各组肝细胞均已贴壁,3d后可见由3～5个细胞组成的细胞集落,至9d时银杏内酯组和神经生长因子组肝细胞已基本铺满孔底,且呈立体生长倾向,空白对照组肝细胞较少,胞间有空隙存在。至培养9d,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组每视野内肝细胞计数差异有显著性意义(F=12.97,P=0.00)。②MTT试验结果:原代肝细胞培养至9d时,银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组吸光度值差异有显著性意义(F=71.90,P=0.00)。③肝细胞培养液白蛋白含量:培养3d时各组细胞培养液的白蛋白含量方差分析无明显差异(F=0.23,P=0.79)。培养6,9d同一时间点组间比较差异有显著性意义(F=11.69,P=0.00;F=9.35,P=0.00)。④细胞凋亡情况:银杏内酯组、神经生长因子组、空白对照组凋亡肝细胞百分率分别为11.53%,9.29%,15.27%。结论:银杏内酯和神经生长因子对原代人胚肝细胞的增殖和分泌白蛋白功能均具有促进作用,并抑制细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞旁分泌作用与脑缺血后的细胞凋亡

背景:骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的机制之一是骨髓间充质干细胞的旁分泌作用,而目前对于这一机制的研究报道较少.目的:观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对脑缺血后细胞凋亡的抑制作用并探索相关机制.方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,建立大鼠大脑中动脉缺血模型.24只SD大鼠随机数字表法分为4组,每组6只.细胞移植给药组:大鼠纹状体内移植骨髓间充质干细胞后给予ERK1/2抑制剂U0126;非移植给药组:注射等量的PBS后给予U0126;细胞移植对照组:移植骨髓间充质干细胞后给予溶剂对照;非移植对照组:注射等量的PBS后给予溶剂对照.7 d后通过Western blot检测血管内皮细胞生长因子、磷酸化ERK1/2蛋白的表达;TUNEL染色检测梗死区周围及皮质区细胞凋亡情况.结果与结论:细胞移植组较非移植组大鼠纹状体内血管内皮细胞生长因子蛋白的表达明显增高,磷酸化ERK1/2表达增强,细胞凋亡数明显减少;经U0126处理后,血管内皮细胞生长因子的表达没有变化,而随着磷酸化ERK1/2的表达受到抑制,细胞凋亡数明显增高.提示骨髓间充质干细胞在大脑纹状体内可以旁分泌血管内皮细胞生长因子,并通过激活ERK1/2抑制了脑梗死区细胞的凋亡.     

参麦注射液对内皮细胞增殖和迁移的影响

背景:有报道参麦注射液具有治疗冠心病与抗肿瘤作用,但其作用机制如何?目的:从对血管生成影响角度探讨参麦抗肿瘤的作用机制。设计:设立对照的实验研究。地点和材料:浙江中医学院分子医学研究所。人癌细胞株购自中国科学院细胞生物学研究所。参麦注射液(10mL/2g):正大青春宝公司。干预:采用MTT法检测参麦注射液对牛血清和肿瘤细胞(SMMC-7721)条件培养液促进的牛主动脉内皮细胞增殖的影响;采用琼脂糖刮除法检测参麦对牛血清和肿瘤细胞(SMMC-7721)条件培养液促进的牛内皮细胞迁移的影响。培养细胞分为对照组、条件培养液组、不同浓度参麦注射液组。主要观察指标:参麦注射液对牛内皮细胞增殖和迁移的影响,参麦对条件培养液促牛内皮细胞迁移的影响。结果:无论是在含100mL/L新生小牛血清培养液中还是在肿瘤细胞条件培养液中,参麦均能明显抑制牛主动脉内皮细胞增殖,且随着剂量增加,抑制作用增强。当参麦的浓度为40mL/L时即可显著抑制牛血清促进的内皮细胞增殖,与对照组相比,差异有显著性意义(t=4.83,P<0.01),20mL/L的参麦即可明显地抑制由条件培养液促进的内皮细胞增殖,与对照组相比,差异有显著性意义(t=5.32,P<0.01)。经20mL/L参麦处理48h后,对内皮细胞迁移的抑制率为58%,与对照组相比差异有显著性意义(t=8.3     

体外血管内皮生长因子单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响

目的:在体外观察血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移力的影响。方法:采用氯化钴(Co Cl2)模拟缺氧环境,予以0、0.1、1、10μg/m L的VEGF抗体,对常氧或缺氧条件下对C6胶质瘤细胞进行处理。通过MTT实验检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力,Western blotting检测HIF-1α蛋白、FAK/Pyk2总蛋白及磷酸化FAK-Tyr397/Pyk2-Tyr402表达水平变化。结果:200μmol/L Co Cl2明显抑制C6细胞增殖(P<0.05),10μg/m L VEGF抗体可明显抑制C6细胞增殖(P<0.05)。与常氧相比,缺氧可使C6细胞的迁移、侵袭能力增强(P<0.05)。常氧和缺氧下,VEGF抗体的干预均增强C6细胞的迁移、侵袭能力(P<0.05),且相对于常氧,缺氧可进一步增强VEGF抗体促C6细胞迁移、侵袭的作用(P<0.05)。Co Cl2干预可增加C6细胞中HIF-1α的含量;在常氧和缺氧情况下,只有1μg/m L VEGF抗体可降低FAK的总蛋白量(P<0.05);在缺氧情况下,VEGF抗体可明显增高Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平。结论:在缺氧情况下,VEGF抗体的干预可使Pyk2-Tyr402位点的磷酸化水平增高,引起C6细胞的侵袭迁移能力进一步增强。     

血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸抑制脑动静脉畸形血管内皮细胞的增殖

背景:采取反义基因治疗技术控制血管内皮细胞生长因子基因表达,遏止血管生成,是脑血管外科中治疗人脑动静脉畸形的崭新课题。目的:观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸对人脑动静脉畸形血管内皮细胞增殖的抑制作用。设计:观察对比实验。单位:解放军沈阳军区总医院神经外科。材料:实验于2006-08/2006-12在解放军沈阳军区总医院的全军神经医学研究所完成。收集2006年解放军沈阳军区总医院神经外科18例脑动静脉畸形患者手术切除的完整人脑动静脉畸形新鲜标本。男12例,女6例;平均40岁。脑动静脉畸形按Spetzler分级:Ⅱ级10例,Ⅲ级8例。全部病例术前均经全脑血管造影证实。人脑动静脉畸形标本获取术前经患者或其家属知情并签同意书。内皮细胞生长添加剂(ECGS;美国Sigma),391型DNA自动合成仪(上海生工利用美国PE公司),厌氧培养箱(浙江产DY-1型),人血管内皮细胞生长因子酶联检测试剂盒购于北京TBD公司,进口分装,96E酶标仪(ERMA,INC)。细胞周期分析试剂盒(BD公司),流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司)。方法:①实验过程:采用组织块贴壁法培养人脑动静脉畸形血管内皮细胞,实验用传至3代细胞,随机分成反义组、正义组和对照组,每组4瓶细胞。反义组、正义组分别采用人工合成血管内皮细胞生长因子正义、反义硫代脱氧寡核苷酸,经阳性脂质体包裹后转染体外培养的人脑动静脉畸形血管内皮细胞,对照组不予处理,将各组细胞置于37℃、体积分数0.95N2、0.05CO2厌氧培养箱分别孵育2,4和8h。②实验评估:测定细胞周期。测定细胞血管内皮细胞生长因子蛋白含量。检测细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达。主要观察指标:各组细胞缺氧不同时间点血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达及细胞增殖指数。结果:①血管内皮细胞生长因子mRNA表达:对照组细胞缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子mRNA水平高于缺氧前(P<0.05),反义组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子mRNA水平低于对照组(P<0.05)。②血管内皮细胞生长因子蛋白含量:对照组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子蛋白含量高于缺氧前(P<0.05),反义组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子蛋白低于对照组(P<0.05)。③细胞增殖指数:对照组人脑动静脉畸形内皮细胞缺氧4,8h后细胞增殖指数(P<0.05)。反义组缺氧4,8h后低于对照组(P<0.05)。结论:缺氧可能在基因转录水平诱导血管内皮细胞生长因子表达,反义血管内皮细胞生长因子能够显著抑制缺氧诱导的人脑动静脉畸形内皮细胞血管内皮细胞生长因子基因表达和细胞增殖。     

抗血小板药物对人骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能的影响

背景：有研究指出氯吡格雷、噻氯匹定可引起粒细胞减少，阿司匹林可抑制内皮祖细胞增殖。目前缺乏这些抗血小板药物会对移植入心肌的骨髓间充质干细胞产生何种作用的报道。目的：探讨氯毗格雷、噻氯匹定和阿司匹林对人骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能的影响。设计、时间和地点：细胞学体外观察，于2006—03／12在上海市疾病预防控制中心毒理学实验室完成。材料：第2代人骨髓间充质干细胞由上海第九人民医院组织工程研究中心提供。氯吡格雷、噻氯匹定为杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司产品，批号分别为国药准字J20040006和国药准字H19980186。阿司匹林由拜耳医药有限公司生产，批号为国药准字20050059。方法：骨髓间充质干细胞解冻后，加入含100U／mL青霉素、100mg/L链霉素、10％胎牛血清的低糖DMEM体外扩增培养，传至第6代，分别用不同浓度的氯吡格雷、噻氯匹定、阿司匹林进行干预处理，并设立空白对照。主要观察指标：MTT比色法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，EHSA法测定细胞培养液中血管内皮生长因子浓度。结果：反映骨髓间充质干细胞增殖变化的A570值在0．02，0．1，0．4，2，10，40μmol／L氯吡格雷或噻氯匹定作用后均明显高于空白对照（P〈0．01）；经60，600，2000μmol/L阿司匹林处理后则低于空白对照（P〈0．05）。细胞表面抗原CD34、CD105、CD106阳性细胞百分率经3种抗血小板药物作用后与空白对照基本相似。与空白对照比较，经0．02μmol／L氯毗格雷及5，2000μmol/L阿司匹林处理后血管内皮生长因子含量无明显变化（P〉0．05）；40μmol／L氯吡格雷或噻氯匹定作用后血管内皮生长因子含量均显著降低：0．02μmol／L噻氯匹定作用后血管内皮生长因子含量显著升高（P〈0．01）。结论：氯吡格雷和噻氯匹定对人骨髓间充质干细胞具有明显的促增殖作用，阿司匹林可抑制其增殖。高浓度氯吡格雷和噻氯匹定能够抑制人骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子，低浓度噻氯匹定可促进其分泌。此3种抗血小板药物对人骨髓间充质干细胞的进一步分化无明显影响。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨分化对血管内皮细胞形成的可能影响

背景种子细胞的成骨功能及局部血管形成是骨组织工程修复重要影响因素.目的体外研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导培养分化为成骨细胞的功能表现及血管内皮生长因子(vascular endothelia growthfactor,VEGF)的表达.探讨MSCs向成骨分化及对血管内皮细胞形成的可能影响.设计以细胞为研究对象,单一样本研究,重复观察测量.单位一所大学组织胚胎学教研室.材料本实验于2002-03/12在广东医学院组织胚胎学教研室完成.对象为兔骨髓间充质干细胞.方法分离、培养新生兔骨髓间充质干细胞,用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液诱导MSCs向成骨细胞分化,观察诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节形成以及VEGF的表达.主要观察指标①细胞形态学观察.②培养细胞的成骨分化鉴定.③诱导培养的成骨细胞VEGF表达.结果MSCs诱导培养后,细胞ALP呈强阳性染色,形成矿化结节,且VEGF表达增强,其灰度值为132.3±4.6,与MSCs的VEGF表达灰度值(148.5±5.3)比较,差异有显著性意义(P＜0.05).结论兔MSCs经诱导可分化为成骨细胞,且VEGF表达增强,可能参与内皮细胞的形成.     

缺氧心肌细胞线粒体膜电位及细胞凋亡与纳洛酮的保护效应

背景:研究证明缺血/再灌注损伤可诱导心肌细胞凋亡,再灌注后线粒体膜电位的丧失是细胞凋亡发生的必然途径。如果能保护线粒体膜电位则可能减少细胞凋亡。目的:观察纳洛酮对乳鼠心室肌细胞缺氧/复氧后线粒体膜电位及细胞凋亡的影响,研究其对缺氧心肌细胞的保护效应。设计:观察对比实验。单位:解放军总医院心内科。材料:心肌细胞凋亡检测实验于2004-12在解放军总医院病理生理实验室完成。选用新生乳鼠10只;心肌细胞腺粒体膜电位检测实验于2006-03在同一实验室完成,选用新生乳鼠20只。实验动物均由解放军总医院动物中心提供。盐酸纳洛酮注射液(0.4g/L),北京四环药厂产品,批号0206272;最低必需培养液(Dulbecco,DEME),Gibco公司;平衡盐溶液(PBS)、小牛血清,SIGMA公司。方法:将当日生乳鼠,局部碘酒酒精消毒后胸骨正中开胸,取心尖前1/3心室肌进行细胞培养。培养4d后选择细胞生长情况良好的培养瓶(细胞数>106/瓶)分为3组:对照组(正常培养)、缺氧组(缺氧/复氧)、纳洛酮组(缺氧/复氧加纳洛酮干预)。其中,对照组3瓶细胞,缺氧组和纳洛酮组各15瓶细胞。缺氧组和纳洛酮组又根据缺氧、复氧时间不同分为3个时间点:缺氧2h/复氧0h;缺氧2h/复氧2h;缺氧2h/复氧4h,每个时间点5瓶细胞。缺氧组:换预先充过体积分数0.95N2 体积分数0.05的CO2气体的体积分数0.01小牛血清DEME培养液,培养瓶内也用体积分数0.95N2 体积分数0.05的CO2气体充入置换其中的空气,密封后37℃孵育;达规定时间后换正常条件下(体积分数0.95空气 体积分数0.05的CO2)孵育。纳洛酮组:缺氧/复氧处理同上,同时加入盐酸纳洛酮,使培养液中药物终浓度达5μmol/L(加药容积≤总培养液的0.5%)。对照组不进行缺氧/复氧及用药处理,滴等量生理盐水,作为各组的缺氧0h/复氧0h时间点。干预后,以荧光染色-流式细胞仪检测缺氧/复氧后不同时间心肌细胞的线粒体膜电位变化及凋亡情况。主要观察指标:①缺氧组与纳洛酮组各时间点线粒体膜电位变化情况;②各组在缺氧2h/复氧4h细胞存活、凋亡、坏死水平比较。结果:①缺氧后,缺氧组、纳络酮组细胞的线粒体膜电位均下降。各时间点纳络酮组细胞线粒体膜电位均高于缺氧组(P<0.01)。线粒体膜电位的大幅度下降不是发生在细胞缺氧期,而是复氧期。②缺氧2h/复氧4h,缺氧组细胞的凋亡、坏死比率分别为(9.88±0.98)%和(5.10±0.29)%,明显高于纳络酮组[(2.41±0.52)%和(3.56±0.56)%,P<0.01]。缺氧组内细胞凋亡发生率明显高于坏死发生率(P<0.05)。结论:早期应用纳洛酮可明显减轻和延缓心室肌细胞缺氧/复氧后线粒体膜电位的下降并减少细胞凋亡和坏死的发生。     

VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究

背景:血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段.但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短.很难在体内保持有效的作用浓度.故本实验将其转入组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的.目的:探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础.设计:观察对比实验.单位:吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所.材料:实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室(生物安全实验室二级)完成.健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供.4.0～5.0月龄,体质量215～315 kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态,无菌条件下完成,符合动物伦理学标准.实验药品及试剂:Ham F12培养基(GIBCO公司),噻唑蓝(MTT)(Sigma公司),pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物公司),感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、HandⅢ、EcoR Ⅰ和标准DNA分子(Promega公司).方法:分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞.构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞.采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②ABC.ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达.③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响.结果:①构建的质粒用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PcR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒.②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72 h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著(P＜0.05).③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组(P＜0.05).结论:人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达.     

降血压肽对人脐静脉内皮细胞增殖及内皮素表达的影响

背景:降血压肽是一类能够降低人体血压的多肽,可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的作用。目的:在细胞分子水平探讨降血压肽对人脐静脉内皮细胞生长及内皮素表达的影响,为进一步将降血压肽开发为降压保健食品提供实验依据。设计:重复测量设计。单位:华南理工大学生命科学与工程学院,深圳职业技术学院应用生物技术系。材料:实验于2004-09/2005-03在深圳职业技术学院应用生物技术研究所完成。降血压肽由深圳职业技术学院应用生物技术研究所制备,在一定条件下抑制血管紧张素转移酶活性一半时所需要的抑制剂浓度为15μmol/L。传至4代的人脐静脉内皮细胞用于实验,随机分为7组:空白对照组、降血压肽150mg/L组、降血压肽300mg/L组、降血压肽600mg/L组、卡托普利阳性对照组、去甲肾上腺素阴性对照组、降血压肽 去甲肾上腺素组。方法:①脐静脉内皮细胞按一般细胞培养方法进行,培养液为M199 体积分数为0.15的小牛血清 青霉素10000U/mL 链霉素100mg/L。细胞长满致融合状态后,按1∶2比例传代,传至第4代的细胞用于实验。②空白对照组含体积分数为0.15小牛血清的M199;降血压肽150,300,600mg/L组在此基础上加入降血压肽至终浓度分别为150,300,600mg/L;卡托普利阳性对照组在此基础上加入卡托普利至终浓度为10-5mol/L;去甲肾上腺素阴性对照组在此基础上加入去甲肾上腺素终浓度为100μg/L;降血压肽 去甲肾上腺素组在此基础上加入降血压肽至终浓度300mg/L,去甲肾上腺素至终浓度100μg/L。③采用细胞计数法测定各组细胞生长状况,放免法测定不同培养时间各组细胞培养液中内皮素含量,反转录聚合酶链式反应法测定内皮素mRNA的表达,免疫组化测定细胞内皮素蛋白的表达。主要观察指标:①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素的影响。②降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响。结果:①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素影响:随着培养时间的延长,与空白对照组比较,卡托普利阳性对照组及降血压肽各剂量组均有抑制内皮细胞生长、降低培养液中内皮素含量的作用(P<0.01或0.05);去甲肾上腺素可促进内皮细胞的生长和分泌内皮素,但加入降血压肽后细胞密度和内皮素含量均接近空白对照组(P>0.05)。②降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响:与空白对照组比较,阳性对照卡托普利组及降血压肽各剂量组均可下调内皮素mRNA和内皮素蛋白的表达(P<0.01或0.05);去甲肾上腺素可上调内皮素mRNA和内皮素蛋白的表达,加入降血压肽后各基因表达接近空白对照组(P>0.05)。结论:不同剂量的降血压肽对内皮细胞均有抑制生长作用,可降低细胞释放内皮素的含量,下调内皮素基因的表达,且能够有效对抗去甲肾上腺素的促脐静脉内皮细胞生长及分泌作用。     

烟酰胺对体外培养兔椎间盘细胞凋亡及能量代谢相关基因的影响

背景：前期研究已证实，烟酰胺能够促进椎间盘细胞的增殖并对白细胞介素1B致椎间盘退变起到保护作用，而烟酰胺对椎间盘退变的保护机制还不很清楚。目的：观察烟酰胺对白细胞介素1β诱导体外培养的兔椎间盘细胞凋亡及能量代谢相关基因表达的影响。设计、时间及地点：实验于2007-11／2008—05在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室完成。材料：3～4月龄日本大白兔10只，体质量1．5～2．Okg，取LM脊柱节段56个椎间盘组织，用于构建兔椎间盘组织凝胶培养模型。方法：将56枚椎间盘随机分为4组，每组14枚。正常对照组：不加入药物：烟酰胺组：加入0．5g／L烟酰胺；退变组：加入10μg/L白细胞介素1β;治疗组加入10μg／L白细胞介素1β及0．5g／L烟酰胺。培养2周后对各组标本行TUNEL染色及Fas，Caspase-3，Bcl-2，低氧诱导因子1d、葡萄糖转运体1、血管内皮细胞生长因子免疫组织化学染色。主要观察指标：各组标本TUNEL染色及免疫组织化学染色阳性细胞率。结果：TUNEL染色示加入烟酰胺后退变组阳性细胞率较正常对照组上升（P=0．001）。Fas染色退变组阳性细胞率较正常对照组明显上升（P〈0．01）。Bcl-2染色示烟酰胺组较正常对照组阳性细胞率升高（P=0．004）。Caspase-3染色示治疗组阳性细胞率较退变组下降（P=0．024），但仍高于正常对照组（P=0.006）。低氧诱导因子1d染色示烟酰胺组阳性细胞率低于正常对照组（P〈0．01）；退变组阳性细胞率较正常对照组上升（P〈0．01）。葡萄糖转运体1染色示治疗组阳性细胞率高于正常对照组（P〈0．01）。结论：烟酰胺可以抑制白细胞介素1β诱导的椎间盘细胞凋亡，改善白细胞介素10导致的椎间盘能量代谢障碍。     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。