靶向人血管紧张素原小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：RNA干扰技术通过将具有一定结构特点、长19~25 bp的双链小干扰RNA导入哺乳动物细胞,特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致目的基因表达抑制。 目的：拟构建针对人血管紧张素原mRNA的小干扰RNA表达载体,从而抑制肾素基因在脂肪细胞的表达。 方法：从NCBI中查找人血管紧张素原基因全长mRNA序列(NM000029),利用GeneScript公司提供的在线小干扰RNA模板序列设计软件,自行设计靶向血管紧张素原的两条shRNA的DNA模板单链,合成靶向血管紧张素原基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的psiRNAT-U6.1/Neo质粒连接,在TOP10菌株中扩增,并测序鉴定。 结果与结论：将含有血管紧张素原-mRNA目标序列19 bp的双链DNA插入片段,连接到pRNAT-U6.1/Neo质粒形成重组质粒。EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,空载体得到351 bp小片段,而人重组质粒得到397 bp小片段,与预期相符。EcoRⅠ和Kpn Ⅰ双酶切后,空载体得到1条345 bp小片段,而人重组载体没有得到小片段条带,与预期相符。测序结果表明psiRNAT-U6.1/Neo质粒已经插入人脂肪细胞的干扰合成片段,无碱基突变,成功构建了靶向血管紧张素原-小干扰RNA表达载体。     

特异性小干扰RNA沉默Polo样激酶1基因表达对恶性胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨Polo样激酶1(PLK1)基因对胶质瘤细胞增殖的影响和可能机制. 方法 根据PLK1基因特点,设计并用化学方法合成了5个小干扰核糖核酸分子(siRNA)(P1、P2、P3、P4和P5).以这5个siRNA转染人胶质瘤TJ905细胞后.分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测PLK1 mRNA和蛋白表达水平.分别采用MTT法和Western blot方法检测癌细胞增殖和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白水平,用TRA-.ELISA方法检测胶质瘤细胞端粒酶活性. 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制胶质瘤TJ905细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好.以P4转染处理胶质瘤细胞后与脂质体对照组比较,PLK1基因mRNA水平和蛋白水平明显下调,差异有统计学意义(P均=0.000).MTT结果显示.与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制,且呈浓度依赖性(r=0.868,P=0.000).Western blot结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组PCNA蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(F=181.36,P=0.000).TRAP-ELISA结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组胶质瘤细胞端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P=0.000). 结论 PLK1基因对胶质瘤细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 siRNA转染处理胶质瘤细胞,可明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关.     

Nurr1基因shRNA表达载体的构建及其鉴定

目的构建针对小鼠核受体相关因子1(Nurr1)的短发夹RNA(shRNA)表达载体,为进一步体内外研究Nurr1基因的功能奠定基础.方法选择两段RNA干扰靶序列,在体外分别合成两段互补的寡核苷酸,退火后与线性化的pSilenCircle质粒连接、转化感受态细胞DH5α,扩增、纯化得到所需质粒,通过酶切后琼脂糖电泳以及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列.结果纯化质粒的大小为4.6kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符.结论成功构建了针对Nurr1基因的shRNA的表达载体.     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

Nurrl基因shRNA表达载体的构建及其鉴定

目的构建针对小鼠核受体相关因子1(Nurr1)的短发夹RNA(shRNA)表达载体,为进一步体内外研究Nurr1基因的功能奠定基础。方法选择两段RNA干扰靶序列,在体外分别合成两段互补的寡核苷酸,退火后与线性化的pSilenCirele质粒连接、转化感受态细胞DH5α,扩增、纯化得到所需质粒,通过酶切后琼脂糖电泳以及基因测序鉴定其分子量及插人片段的序列。结果纯化质粒的大小为4．6kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。结论成功构建了针对:Nurr1基因的shRNA的表达载体。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建☆

背景：DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制。 目的：构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒。 方法：设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态E.coli DH5α,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定。 结果与结论：经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6片段大小为473 bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6重组质粒构建成功。     

LRIG3特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建LRIG3（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3,LRIG3）基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制LRIG3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的LRIG3基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发卡RNA（shRNA）的DNA序列,命名为LRIG3-shRNA1、LRIG3-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶SalⅠ酶切电泳,DNA测序鉴定。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株。逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG3的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经SalⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG3-shRNA组细胞LRIG3 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组。结论成功构建针对LRIG3基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制LRIG3基因表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

PYGO2基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建PYGO2基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法以PYGO2为靶基因,以pSUPER．puro质粒为载体,设计构建重组体,根据基因库（GenBank）提供的PYGO2基因核苷酸序列,在http：／／www．ambion．com网站上使用siRNA Target Finder软件进行目的基因的siRNA序列对应DNA的设计与筛选,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pSUPER．puro中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pSUPER．puro-PYGO2质粒转染胶质瘤C6细胞48h,检测其对该细胞PYGO2蛋白的影响。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低胶质瘤细胞PYGO2的蛋白表达,重组载体构建成功。结论利用RNAi技术可成功构建抑制PYGO2表达的siRNA真核表达载体。     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒的构建

背景：研究者们早已发现蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase，PTP1B）可负性调节胰岛素信号转导，但目前制约PTP1B功能研究的重要环节是缺乏有效的工具。 目的：拟构建PTP1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒。 设计、时间及地点：体外细胞学基因转染实验，于2007-05/12在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成。 材料：293细胞由中科院上海细胞研究所提供，真核表达质粒psiRNA-PTP1B由上海吉凯生物公司合成，AdEasy-1菌、穿梭载体pAdTrack、大肠杆菌DH5α由本室保存，重组腺病毒PCR鉴定引物由上海生工生物公司设计合成。 方法：由生物公司合成针对大鼠PTP1B mRNA的特异性siRNA真核表达质粒psiRNA-PTP1B，双酶切得到siRNA-PTP1B表达片段，插入pAdTrack载体上，获得转移质粒pAdTrack-siRNA-PTP1B。后者经线性化后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组，PacⅠ酶切鉴定，筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-PTP1B，酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒颗粒。通过反复感染扩增病毒，采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒。 主要观察指标：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，鉴定重组腺病毒穿梭载体及重组腺病毒是否构建成功。 结果：PacⅠ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAd-siRNA-PTP1B构建成功，转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达。PCR鉴定表明重组腺病毒中含有siRNA-PTP1B片断，成功构建了携带PTP1B干扰RNA的重组腺病毒Ad-siRNA-PTP1B，293细胞扩增纯化后，获得约3.6×109 efu/mL滴度的重组腺病毒。 结论：应用AdEasy-1系统可以高效快速制备表达PTP1B干扰RNA的重组腺病毒。     

抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中。该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响。因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素。 目的：为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成。 材料：293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA。 方法：构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子。通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件。Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列。 主要观察指标：被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率。 结果：pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1：1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率。靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高。能够抑制40%正常基因表达。 结论：实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素。为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础。     

siRNA对人脑胶质瘤细胞Survivin基因表达的影响

目的 探讨siRNA敲除Survivin基因的可行性,并观察其对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响.方法 采用人工合成的小干扰RNA(siRNA)体外阻抑人脑胶质瘤细胞T98和SF767 Survivin基因的表达,即时定量PCR方法检测Survivin mRNA表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 Survivin siRNA转染后24 h,T98、SF767细胞中Survivin mRNA表达水平同阴性对照相比下调分别达92.6%、89.5%,48 h后表达量则下降了 80.1%、67.6%.T98细胞在干扰后24、48 h平均凋亡率分别达50.2%、38.4%,SF767分别达40.1%、25.6%,同阴性对照相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 针对Survivin的siRNA Oligo能有效抑制Survivin基因的表达,并诱导细胞凋亡,为RNA干扰技术用于胶质瘤的临床治疗打下了基础.

Abstract：

Objective This study was to investigate the feasibility ofknockdown of Survivin gene with small interfering RNA and to observe the apoptosis in gliomas which was influenced by siRNA.Methods Survivin specific siRNA oligonucleotides were designed and synthesized artificially.This siRNA were transfected into human glioma cells T98 and SF767 to inhibit the expression of Survivin RNA in vitro.The mRNA level of Survivin was detected by real- time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and the apoptosis of cells was assayed by flow cytometry (FCM).Methods The expression of Survivin mRNA in siRNA- transfected samples decreased by 92.6% and 89.5% in T98,SF767 cells respectively in 24 hours after transfected with siRNA oligos.The expression amount was declined by 80.1% and 67.6% in 48 hours after RNAi.The apoptosis rate of T98 cells was 50.2% in 24 hours after interfere,and was 38.4% in 48 hours.The apoptosis rate of SF757 cells were 40.1% and 25.6% respectively.There was a significant difference between the RNAi cells and negative controls(P ＜0.01 ).ConclusionThe specific siRNA oligo which was aim to Survivin could knockdown the expression of Survivin mRNA,and induce apoptosis in human glioma cells.The experiment had made the foundation of the clinical RNA interfering technique.     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景：长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。 目的：设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。 方法：根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。 结果与结论：酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。