TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

连续监测血培养系统中肺炎链球菌自溶特点分析

摘要:目的：研究连续监测血培养系统（CMBCSs）中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的自溶特点和影响因素,建立肺炎链球菌培养假阴性的检验方法和预防措施。 方法：选取肺炎链球菌标准株ATCC 6303、ATCC 49619、卫生部2012年4号质控菌（WSB-1204）和6株临床分离株,在Bactec 9120型血培养仪中培养,观察肺炎链球菌在不同时间段的菌体形态差异,比较不同来源菌株、不同血培养瓶等阳性报警时间及报警后自溶死亡时间的差异。同时,采用肺炎链球菌ATCC 6303进行实验,比较快速免疫层析法、乳胶凝集法和16S rRNA基因扩增及测序3种方法对于肺炎链球菌的检测能力。 结果：模拟实验中肺炎链球菌在CMBCSs中阳性报警后可在8~10 h内自溶死亡,自溶死亡的时间受菌株来源、血培养瓶种类、营养条件等多种因素的影响。其中Bactec需氧瓶相对于小儿瓶和厌氧瓶的报警后自溶死亡的时间更短。自溶的肺炎链球菌,直接涂片镜检可能为革兰阴性球菌或难以辨认的细胞碎片,但可采用乳胶凝集法、胶体金免疫层析法和16S rRNA基因扩增及测序的方法进行检测,其最低检测限分别为10⁶ CFU/mL、10⁵ CFU/mL和10⁵ CFU/mL。 结论: 连续监测血培养系统中肺炎链球菌自溶的影响因素较多,采用需氧+厌氧血培养、报警后及时取阳性瓶转种,有利于防止肺炎链球菌假阴性培养的发生,提高血培养的阳性检出率。     

肺炎链球菌TaqMan实时荧光定量PCR的建立及临床应用

目的：建立TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法,应用于临床儿童社区获得性肺炎（CAP）标本的快速筛查。方法根据 GenBank公布的肺炎链球菌自溶酶基因（lytA）设计引物和探针,建立实时荧光定量 PCR,并对体系进行优化;同时以痰培养法做双盲对照,应用于1504份 CAP患儿标本检测。结果 TaqMan实时荧光定量 PCR菌液的最低检出限可达18.75 cfu/PCR,无交叉反应,特异度好;对1504份儿童CAP标本检测,141份肺炎链球菌实时荧光定量PCR阳性,其中140份肺炎链球菌痰培养阳性,该方法灵敏度为100％,特异度为99.93％。从样品处理到结果报告仅需2.5 h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于儿童CAP中肺炎链球菌的初筛和指导抗生素的的合理使用。     

BOX-PCR技术在肺炎链球菌检测中应用

目的建立BOX-PCR方法 ,用于肺炎链球菌的检测和流行病学调查。方法用BOX-PCR技术扩增23株肺炎链球菌菌株,并应用50例临床标本检测,同时对方法的特异性、敏感性进行研究。结果对所测肺炎链球菌菌株均获得扩增产物,对其他非肺炎链球菌菌属无交叉反应,其检测敏感性可达101cfu/ml,50例临床标本BOX-PCR方法有9例检测出肺炎链球菌阳性(18.0%),而培养法阳性4例(8.0%)。结论 BOX-PCR方法能快速、特异、灵敏地检测肺炎链球菌和进行流行病学调查。     

环介导等温扩增技术在下呼吸道感染常见病原体检测中的应用

目的应用环介导等温扩增技术(LAMP)检测下呼吸道感染患者标本中的13种病原体,为临床快速诊断感染性疾病提供依据。方法收集疑似下呼吸道感染患者痰标本103例、肺泡灌洗液45例,常规培养分离细菌、真菌,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行细菌鉴定,同时采用LAMP技术检测13种常见病原体(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、结核分枝杆菌复合群),实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测45例肺泡灌洗液标本中肺炎支原体,LAMP法检出的结核分枝杆菌阳性标本用二代测序(NGS)技术验证。结果 148例标本中,质谱法检出率为42.6%(63/148),分离出病原菌81株;LAMP法检出率为68.2%(101/148),共检测出175种病原体。质谱法和LAMP法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的检出率差异无统计学意义(P>0.05),但LAMP法对肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌的检出率高于质谱法(P<0.05)。LAMP法从45例肺泡灌洗液中检出26例肺炎支原体,而采用RT-qPCR检出23例。148例样本中,LAMP法检出2例结核分枝杆菌复合群,并使用NGS验证为阳性。结论与传统细菌培养鉴定相比,LAMP技术具有检测快速、准确、操作简便等优势,可为临床诊疗提供可靠依据。     

LA MP结合示差脉冲伏安法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立及临床应用

目的：利用环介导恒温扩增（LAMP）技术结合示差脉冲伏安（DPV）法,建立快速检测肺炎克雷伯菌的方法,并将其应用于小儿腹泻病原菌分析。方法通过基因比对与引物设计,建立针对肺炎克雷伯菌的LAMP 检测方法。采用LAMP 技术对肺炎克雷伯菌和其他8种干扰菌以及对不同浓度肺炎克雷伯菌进行扩增,结合DPV法评价其特异性及灵敏度。将200份腹泻患儿的粪便标本同时采用LAMP方法与培养法进行检验,对比2种方法检测肺炎克雷伯菌的阳性率。统计近2年该院门诊及住院小儿腹泻病例,初步分析其常见腹泻致病菌种类及比例。结果设计出针对肺炎克雷伯菌的LAMP 检测方法,该法只针对肺炎克雷伯菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性,LAMP法最低检测限为10 CFU/mL,显示出较高的灵敏度。200份腹泻患儿粪便标本,采用LAMP法与培养鉴定法检测的肺炎克雷伯菌阳性率差异无统计学意义（P＞0．05）。近2年内该院小儿腹泻粪便标本中共检出致病菌709株,主要病原菌分别为志贺菌（34．23％）、大肠杆菌（15．40％）、铜绿假单胞菌（12．96％）、弗劳地枸橼酸杆菌（7．82％）、沙门菌（6．36％）、白色念珠菌（6．11％）、肺炎克雷伯菌（4．40％）、产气荚膜梭菌（3．67％）、变形杆菌（3．42％）、其他菌（5．63％）。结论设计出了针对肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该法具有良好的特异性和较高的灵敏度,能够用于肺炎克雷伯菌的快速检验。     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

肺炎链球菌多重巢式荧光PCR分型方法的建立和应用

目的建立一种敏感且节省标本的多重巢式荧光PCR方法，用于临床标本中肺炎链球菌的分型。方法以检测肺炎链球菌种属（lytA基因）和20组常见血清型的引物和探针为基础，分别采用92株不同血清型的肺炎链球菌菌株和系列稀释的参考DNA模板，建立多重巢式荧光PCR方法。 评价该方法的特异性和敏感性，同时与荧光PCR方法进行比较。 将该方法用于14份肺炎链球菌培养阳性和30份肺炎链球菌培养阴性的临床标本的检测，评价实际应用效果。结果多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法能准确鉴定/区分大部分菌株（90/92）的血清型。 前者的检测灵敏度为1～100 fg/μl，9种血清型的灵敏度高于荧光PCR方法（10～100 fg/μl）。 44份临床标本中，多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法分别检测出34和31份阳性（P＝0.778），2种方法的DNA模板使用量分别为15 μl和66 μl。结论多重巢式荧光PCR比荧光PCR方法节省标本且更加灵敏。     

志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌LAMP检测方法的建立及应用

目的 建立针对侵袭性质粒抗原H(ipaH)编码基因的环介导等温扩增(LAMP)方法.方法 利用LAMP方法对4株志贺菌、1株肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和20株其他肠道菌DNA在65℃恒温扩增30 min或60 min后观察结果.结果 4株志贺菌和EIEC可通过肉眼和电泳观察到阳性结果,而其他肠道菌为阴性.LAMP检测特异性与聚合酶链反应(PCR)相似,但敏感性比PCR高10倍.LAMP、PCR检出下限分别为1.2×10 2、1.2×103 CFU/mL.LAMP和分离培养法对70例食物中毒患者和健康者肛拭子标本检测结果符合率为100％.结论 LAMP由于具有快速和无需特殊仪器的优点,可广泛用于肛拭子标本志贺菌和EIEC的检测.     

建立实时荧光LAMP法检测肺炎支原体

目的建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为10~3 copies/μL,当基因拷贝数大于10~4 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为10~4 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P0.05)。结论实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

Detection of Klebsiella pneumonia in respiratory tract samples by the loop-mediated isothermal amplification method

目的:建立环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测呼吸道感染患者痰液中肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)的方法并进行初步应用。方法:基于Kpn phoE基因设计4条特异性引物,对反应条件中的Mg^2+和甜菜碱浓度进行优化,建立检测Kpn LAMP方法并进行特异性和灵敏度试验;收集308例呼吸道感染患者痰液样本,进行细菌培养法、LAMP法、DNA测序技术检测,评估LAMP检测体系。结果:8 mmol/L、0.4 mmol/L确定为Mg^2+和甜菜碱的最佳扩增浓度;该体系特异性强,与其他菌株无交叉反应,灵敏度为104 CFU/mL;临床样本中Kpn的LAMP检出率(53.89%)高于培养法(42.20%),差异有统计学意义(χ^2=161.65,P<0.05);LAMP法与细菌培养法在Kpn阳性样本、无细菌生长样本、非Kpn其他细菌阳性样本中的一致率分别为96.15%、100%、65.25%,46例不一致样本经DNA测序验证,LAMP法与测序符合率为86.95%(40/46);LAMP法和DNA测序法对131例样本同时进行检测,经Kappa检验两者具有极好的一致性(Kappa系数=0.817)。结论:与细菌培养法相比,LAMP法具有准确性高、灵敏度高、特异性强、反应省时等优势,可以作为肺炎克雷伯菌的快速检测方法。     

快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的建立可用于粪便中艰难梭菌快速检测的环介导恒温扩增(LAMP)方法。方法针对艰难梭菌毒素A基因,设计引物。采用LAMP对艰难梭菌和其他腹泻干扰菌及不同浓度艰难梭菌的扩增检测,对其特异性和灵敏度进行评价。同时采用LAMP和荧光定量PCR对100例疑似艰难梭菌感染的临床腹泻患者粪便进行检测,对两种方法进行比较。结果 LAMP对艰难梭菌及6种腹泻干扰菌的检测,只针对艰难梭菌有扩增,显示了较好的特异性。LAMP最低检测限为10CFU/mL,灵敏度较高。对100例临床粪便标本LAMP检测结果与荧光定量PCR比较差异无统计学意义(P>0.05,χ2=0.1429)。结论本研究建立的粪便中艰难梭菌的LAMP快速检测方法特异性好、灵敏度较高、操作简便,适用于艰难梭菌的临床快速检测及现场检测。     

Real-time quantitative PCR for the detection of Streptococcus pneumoniae in the middle ear fluid of children with acute otitis media

PCR based on the amplification of pneumolysin gene fragments has previously been applied to demonstrate Streptococcus pneumoniae in clinical specimens. Here, a real-time PCR method for the detection and quantification of pneumococci by amplifying a 206-bp fragment of the pneumolysin-encoding gene is described. The amplified fragments were detected simultaneously using fluorescent-labeled sequence-specific hybridization probes. The applicability of the assay to clinical samples was evaluated by studying 50 middle ear fluid (MEF) specimens from children with acute otitis media. Twenty-six of the MEF samples were positive by real-time PCR and the numbers of genome equivalents detected varied from 90 to 88,000/microl in 17 culture-positive samples and from 1 to 1,200/microl in 9 culture-negative samples. The results were compared to culture findings and to results obtained by using agarose gel electrophoresis or Europium-labeled hybridization probes for the detection of amplification products of conventional PCR. The sensitivity and specificity of the real-time PCR assay developed in the present study compared to culture were 100 and 73%, and to conventional PCR with agarose gel and/or TRF detection 93 and 96%, respectively. The real-time PCR assay was found to be rapid, easy to use, and sensitive in detecting and quantifying pneumococci.     

高灵敏度等温扩增法可视化检测血液中的病毒核酸

目的探讨便携式、可灵敏、快速检测血液标本中病毒核酸的方法。方法以HBV病毒为例,针对其基因组保守序列设计特异性引物,采用环介导等温扩增法(LAMP)对待测HBV标本做核酸目标序列扩增,以高灵敏双链DNA嵌合荧光染料为指示剂,根据荧光信号指示扩增反应产物的有无;将本法与实时荧光PCR法对临床标本做HBV检测的对照分析。结果建立了血液病毒核酸的可视化检测方法,研制出扩增检测一体化仪器;灵敏度达到可在<1 h完成10 cp/管的HBV核酸扩增反应和产物检测。62例实时荧光PCR检测为HBV阳性的临床标本,本法亦都检测为阳性;而从42例实时荧光PCR检测为HBV阴性的临床标本中,本法检出了6例HBV阳性。结论所建立的方法和装置可实现高灵敏度单管快速检测血液病毒核酸,为特殊现场环境中的血液安全性筛查提供了新的手段。     

恙虫病东方体环介导等温扩增可视化快速检测方法的建立

目的 利用环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术,建立一种灵敏、特异和简便的恙虫病检测方法。方法 利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4,以恙虫病东方体热休克蛋白groEL基因作为靶序列,设计扩增引物,优化反应条件。利用恙虫病东方体标准株评估灵敏度和特异度;收集42份恙虫病血样,分别采用LAMP、普通PCR和实时荧光定量PCR方法进行验证。结果 建立的LAMP方法可在61～65℃80 min内完成恙虫病东方体的快速检测,最低检测限为10拷贝/μL,高于普通PCR方法 2个数量级,高于荧光定量PCR方法 1个数量级;对8种常见的自然疫源性疾病病原体检测均为阴性,特异度为100%;对42份恙虫病血样采用3种方法检测,阳性率一致,均为21.4%(9/42)。结论 本研究建立的恙虫病东方体LAMP可视化检测反应快速,操作简便,灵敏特异,可在基层医疗卫生机构运用推广。     

LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血靶点表皮生长因子受体(EGFR)基因L858R位点突变的快速筛查方法。方法在Genebank上查找EGFR 21号外显子(L858R)的DNA序列,利用Primer Explorer V4软件设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并对其特异性和敏感性进行评价。采集11例临床病理诊断为NSCLC患者外周血血浆,以聚合酶链反应(PCR)扩增结果为标准,对建立的LAMP方法的准确性进行验证。结果采用自行设计的LAMP引物及构建的反应体系可特异性扩增EGFR L858R位点突变阳性DNA,检测敏感性为0.1%,特异性达到100%。LAMP法在11例EGFR L858R位点突变阳性的NSCLC患者血浆标本中检测到9例阳性。结论成功建立了LAMP检测人外周血浆EGFR基因突变方法,诊断敏感性、特异性和准确性均较高,可荧光目测判读检测结果,是一种简单、快速的EGFR基因突变筛查方法。