3种流式细胞术计数脐血CD34+细胞方法的比较

目的　比较 3种流式细胞术 (FCM )计数CD34 + 细胞的方法。方法　对CD34 + cellquantitation (CCQ)和ISHAGE两种方法进行了改良 ,并与ProCOUNT方法比较。结果　改良CCQ(iCCQ)和改良ISHAGE(iISHAGE)避免了CD45 dim/SSClow细胞的损失 (11.0± 9.6 %) ;iCCQ计数值高于iISHAGE和ProCOUNT(均 0 .0 0 1

相似文献   

人类脐血CD34^＋细胞的研究进展

本文综述了近年来对脐血ＣＤ３４＾＋细胞（即造血干／祖细胞）的研究进展，表明虽脐血ＣＤ３４＾＋细胞水平低于正常成人骨髓，但其干细胞比例较高且造血功能较强，有利于移植后长期造血的重建。     

脐血CD34+细胞体外扩增过程中Fas、Caspase-3表达及染色体核型分析

随着造血细胞工程这一新兴学科的兴起 ,利用造血干 祖细胞体外定向诱导分化为我们所需的细胞以供临床所需已越来越受重视 ,利用不同的细胞因子组合已可以扩增出近百倍的细胞产品 ,从而为其临床应用奠定了坚实的基础。然而我们不得不考虑体外短时间内扩增出大量的细胞是否具有无限增殖的特性、是否具有致瘤性而对患者存在潜在的威胁 ,因此研究造血干 祖细胞在体外定向诱导分化过程中的相应的安全指标就显得尤为重要。我们研究了ＣＤ3 4+细胞在体外定向诱导分化过程中ＣＤ95(Ｆａｓ抗原 )的表达情况 ,以及细胞扩增过程中Ｃａｓｐａｓｅ 3的动…     

脐血及白血病缓解期骨髓中CD34+细胞筛选及体外扩增

脐血及白血病缓解期骨髓中ＣＤ３４＋细胞筛选及体外扩增姜容韩明哲赵英新韩俊领冯四洲李成文严文伟造血干细胞体外扩增对于造血干细胞移植、基因治疗等研究有着重要的意义。脐血干细胞的有效扩增可望将脐血用于成人移植［１］，可使骨髓移植患者在移植后快速渡过造血危相...     

脐血CD34+细胞的分离与纯化

脐血造血干细胞的分离是进行干细胞移植、体外扩增培养的关键.研究采用明胶自然沉降法、Fi-coll分层法分离脐血MNC后,用MACS分离纯化CD34+细胞,计数并用流式细胞仪进行纯度分析.结果显示每份脐血的采集量平均为95±52 ml,3 g/dl明胶自然沉降法所获MNC密度平均为(5.76±0.67)×107/ml;CD34+细胞密度平均为(5.53±1.16)×105/ml,较Ficoll分层法高(P＜0.01).因此,3 g/dl明胶自然沉降法是一种较理想的分离MNC的方法,用明胶沉降法和MACS相结合是分离脐血CD34+细胞的理想方法.     

脐血细胞成分及CD34CD38细胞含量分析

自20世纪80年代末起,采用脐血输注治疗再生障碍性贫血、恶性肿瘤等疾病取得疗效［1,2］。国内外学者近年来开始对脐血造血干/祖细胞等有效成分进行分析,由于研究方法、条件不同,所得结果差异较大。笔者采用全自动血细胞分析仪系统检测脐血细胞成分,并与相同条件下的成人外周血作比较;同时以流式细胞术为基础,建立了CD34CD38细胞的检测方法,分析脐血的细胞学组成和CD34CD38细胞的含量特点。     

脐血CD34+CD38-早期造血祖细胞的体外增殖和凋亡

为了从适龄产妇脐血中分离出CD34^ CD38^-细胞，在体外较长时间培养后观察分析CD34^ CD38^-细胞分裂增殖、凋亡以及干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞增殖的影响，用流式细胞仪从10例健康产妇脐血中分选出CD34^ 和CD38^-标记的脐血原始细胞．在添加IL-3、IL-6、GM—CSF、EPO、IGF—1和SCF6种混合因子的干细胞培养基中培养6个月，观察细胞并绘制生长曲线，用单细胞凝胶电泳检测干细胞因子对CD34^ CD38^-细胞生长的影响和用流式细胞仪检测CD34’CD38细胞凋亡情况。结果表明：脐血CD34^ CD38^-细胞可在体外较长时间培养增殖，无异常或过度的细胞凋亡发生。结论：通过控制培养条件，脐血CD34^ CD38^-早期造血祖细胞可在体外较长时间培养增殖，以作为大量脐血原始细胞移植的细胞来源.     

脐血CD34+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究

脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞。本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34 细胞扩增的影响。将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO SCF FL EPO IGF1组,C组为TPO SCF FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF1。于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例。结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34 细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFUE和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34 CD71 细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71 GPA 细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍。结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL SCF TPO实现了CD34 细胞及集落形成细胞的扩增。脐血MNC在无血清培养液中加入FL SCF TPO EPO IGF1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P<0.05)。由于TPO SCF FL EPO IGF1组的集落形成细胞数、CFUE和BFUE数于第10天最多,故培养后收获时     

脐血中CD34+CD38+细胞含量对急性白血病患者移植后造血重建的影响

为了探讨非亲缘脐血移植中CD34+ CD38+ 细胞回输量对造血重建的影响 ,采用流式细胞术分析复苏后的CD34+ CD38+ 细胞数 ,并对 2 0例急性白血病患者的体重、中性粒细胞 (ANC)和血小板 (Plt)恢复时间进行测定。结果表明 :2 0例接受的CD34+ CD38+ 细胞输入量为 (9.85 - 32 5 .71)× 10 4/kg ,其ANC恢复 >5× 10 8/L的中位时间为 18 5 (11- 32 )天。在 19例患者中Plt恢复 >2× 10 10 /L的中位时间为 4 5 (12 - 118)天。CD34+ CD38+ 细胞输入量与ANC和Plt恢复时间存在相关 ,r值分别为 - 0 .5 77(P <0 .0 1)和 - 0 .5 0 3(P <0 0 5 )。结论 :CD34+ CD38+细胞含量与造血恢复时间相关 ,足量输入CD34+ CD38+ 细胞可能使植入提前     

Flt3和c-kit在脐血CD34+干/祖细胞中功能性表达及意义

为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kit在脐血CD34~+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究。采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34~+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨。研究结果显示,新鲜脐血CD34~+细胞中(68.8±15.4)％为Flt3~+,(50.6±12.7)％为c-kit~+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降。结论:脐血CD34~+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果最显著。     

microRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达

为进一步探讨microRNA（miRNA）在造血调控中的作用奠定基础,比较了miRNA在人脐血CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞中的差异性表达。从人脐血中分离单个核细胞（MNC）,应用FACSVantage分选流式细胞仪分选CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋细胞;抽提miRNA后与miRNA芯片杂交,应用生物信息学技术分析miRNA芯片的表达结果。结果发现,miRNA在人脐血CD34^＋CD38^＋细胞的表达水平比在CD34^＋CD38^-细胞的表达水平降低至1／2以下者共11个,表达水平升高至2倍以上者共73个,以上84个miRNA被称为“干细胞性”miRNA。经比较Georgantas等和芯片表达结果,发现有12个（14、29％,12／84）相同的miRNA。部分miRNA经历了类似于CD34在造血细胞表面的发展历程。应用生物信息学技术可寻找到新的与造血调控相关的miRNA簇及miRNA的下游靶基因。结论：“干细胞性”miRNA在正常造血中发挥着重要作用,即miRNA的系统表达模式一造血干／祖细胞基因表达谱一造血干／祖细胞的自我更新和系列定向分化。     

脐带血CD34+细胞免疫磁珠分选及其意义

【目的】探讨免疫磁珠分选CD34 细胞及脐血中CD34 细胞含量的意义。【方法】脐血中分离单核细胞后,采用EasySep正选人CD34 免疫磁珠分选CD34 细胞,流式细胞仪检测分选前后CD34细胞的纯度。【结果】分选前MNC中CD34 细胞纯度为(1.14±0.71)%,分选后CD34 细胞纯度达到(91.55±4.11)%。【结论】脐血作为CD34 造血干/祖细胞的来源以及免疫磁珠方法在获得高纯度CD34 细胞中有重要的意义。     

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为41时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为32(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.     

人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34+细胞体外扩增

从胎盘中分离培养人胎盘源贴壁细胞 (humanplacentaderivedadherentcells,hPDAC) ,研究其对脐血CD34+细胞体外扩增作用。以酶消化法自人胎盘组织中分离培养hPDAC ,并以流式细胞术对其进行鉴定。进一步 ,采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞 ,建立以hPDAC为滋养层的CD34+细胞体外扩增培养体系 ,并与无滋养层的液体培养体系相比 ,观察不同培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞百分率的影响。结果表明 ,人胎盘组织中可分离培养出hPDAC ,并证实其为混合性细胞群体 ,主要含有间充质细胞。以hPDAC为滋养层的共培养体系较无滋养层液体培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞均具有明显的扩增效应 ,其中以SCF +IL 3+IL 6 +FL +hPDAC组扩增效果最强 ,分别扩增了 ( 12 6 .0± 6 .7)倍 ,( 4 9.8± 1.7)倍和 ( 8.3± 1.6 5 )倍。上述结果提示 ,hPDAC具有体外支持造血作用 ,并提供了一与脐血CD34+细胞体外扩增相适应的新滋养层。     

非整合型质粒重编程脐带血CD34~＋细胞形成诱导性多潜能干细胞的研究

本研究探索和优化非整合质粒的方法,将人脐带血来源的CD34＋（CB CD34＋）细胞进行重编程,建立无病毒的iPS技术体系。利用细胞核转染仪将质粒pEB-C5和pEB-Tg转入短暂培养后的CB CD34＋细胞中,使其进行重编程形成iPSC,14 d后观察到2×106CB CD34＋细胞中约有200个类似ES细胞特征的克隆出现,并对产生的iPSC进行体内外多能性鉴定及细胞核型检测。结果表明,重编程后的CB CD34＋细胞的多能性基因表达与ESC类似,细胞核型正常,外源基因无插入,且具有体内分化成三胚层的全能性。结论：利用非整合型质粒的方法重编程CB CD34＋细胞形成iPSC,该方法无外源基因插入、重复性好、操作简单、且效率较高,为建立相对安全的iPSC提供了一个行之有效的途径,为深入探索iPSC应用于临床药物的筛选、组织工程和再生医学研究等提供了很好的研究材料。     

脐血造血干/祖细胞表面CD95/Fas抗原和Bcl-2的表达和功能研究

对人脐血干 /祖细胞表面CD95 /Fas抗原及Bcl 2的表达和功能特征进行了研究。新鲜分离的脐血CD34+细胞表达低水平CD95 ,体外培养中联合应用细胞因子如SCF和FL可上调CD95表达 ,负调控因子例如肿瘤坏死因子 α(TNF α)和干扰素 γ(IFN γ)可进一步增加其表达量。将CD34+ 细胞与抗 CD95单克隆抗体共同孵育 ,通过活细胞记数、流式细胞术、集落形成细胞 (CFU C)及长期培养启动细胞 (LTC IC)的分析 ,研究了CD95介导的功能特性。抗 CD95单抗与TNF α或IFN γ组合条件下 ,活细胞记数和CFU C计数分别为 31.9± 11.2和 4 3± 2 .0 ,LTC IC生成受到抑制 ,细胞凋亡率为 4 2 .9± 12 .4。而抗 CD95单抗在无细胞因子存在条件下或抗 CD95单抗与早期效应细胞因子SCF和FL组合条件下诱导的凋亡率很低。细胞浆内增加的Bcl 2水平和脐血CD34+ 细胞表面CD95的关系表明Bcl 2可能对CD95介导的CD34+ 细胞的凋亡起保护作用。     

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34＋细胞和正常人外周血单个核细胞（PBMNC）中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT—PCR检测脐血CD34＋细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34＋细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNc不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论：HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXIM在CD34＋细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。     

人骨髓间充质干细胞与脐血CD34+细胞体外扩增

为了研究骨髓间充质干细胞(MSC)及细胞因子对脐血CD34 造血祖细胞体外扩增的作用,及其扩增作用 对细胞黏附分子的影响,用免疫磁珠富集脐血CD34 细胞,然后接种到含有或不含有MSC和细胞因子的24孔培 养板,体外培养1周,观察不同指标并进行组间比较。结果表明:①SDF-1α SCF TPO FL因子组合与SCF TPO FL因子组合对脐血CD34 细胞的扩增作用无显著性差异(无论有无MSC细胞层存在)(P>0.05);②MSC 与上述细胞因子共存的培养体系优于相应的单纯细胞因子培养体系(P<0.05);③扩增前与扩增后脐血造血祖 细胞黏附分子CD44的表达没有明显变化。结论:趋化因子SDF-1α对SCF TPO FL因子组合的扩增作用无显 著影响;MSC增加细胞因子的脐血细胞体外扩增的作用;体外扩增不影响跻血细胞黏附分子CD44的表达。