男性不育症睾丸肥大细胞的分布与形态学观察

目的 观察男性不育症睾丸肥大细胞的分布及形态学结构。方法 对50例不育症睾丸活检标本进行连续切片，一张用甲苯肤蓝染色，油镜观察肥大细胞形态结构及分布。另一张用ABC法在高倍镜下检测IgG与抗原反应的阳性率。结果 不育症睾丸肥大细胞可分为两种：一种肥大细胞体积较大，圆形、椭圆形，胞质含较大的圆形椭圆形浅红色颗粒，这种细胞脱颗粒现象明显多见。另一种肥大细胞体积较小，形态多样，有梭形、不规则形等，胞质内颗粒细小，呈深红色，脱颗粒现象少见。50例不育症中有4例生精小管上皮之间有肥大细胞，5例生精小管腔内有肥大细胞，8例界膜内有肥大细胞，并有完整颗粒脱出。免疫反应阳性主要发生在生精小管界膜、生精细胞及间质小血管壁上，其阳性率为63％。生精小管腔内及生精上皮细胞间有肥大细胞存在的9例，免疫反应均为阳性。结论 不育症睾丸肥大细胞具有趋化性移动的特性，这可能是肥大细胞朝向炎症或免疫应答的部位移动，肥大细胞脱颗粒释放的组胺、肝素、类胰酶等可刺激胶原合成、纤维增生，使界膜增厚，小血管管壁增厚，抗原抗体复合物的沉积也使界膜增厚，小血管壁增厚，从而破坏了血睾屏障，并使生精上皮缺乏营养而变性、脱落，同时也影响间质细胞发育及其功能，最终导致不育。     

小鼠生后睾丸生精细胞的凋亡及P53的表达变化

目的:观察小鼠生后生精细胞的凋亡变化规律以及凋亡相关基因P53的表达变化.方法:用生后0、1、4、7、10、13、2o、30、50天的昆明小鼠,取其睾丸,Bouin液固定后,用TUNEL法检测其生精细胞凋亡率;用免疫组织化学的方法检测凋亡相关基因P53的表达变化.结果:生后4天的小鼠生精细胞开始出现凋亡,10～20天达高峰,以后渐减少.P53的表达从生后7天的小鼠睾丸生精细胞出现阳性,20天时达高峰,以后渐减少.结论:小鼠睾丸在发育过程中有大量细胞凋亡,在其生后10～20天为高峰期.P53的表达较凋亡出现稍晚,但变化规律与凋亡近似.     

淋巴管阻断对大鼠睾丸间质的影响

用手术方法将健康ＳＤ大鼠睾丸淋巴管阻断，观察阻断后不同时间睾丸间质的变化，阻断后２天，间质呈现炎症反应，炎细胞浸润，血管扩张，阻断后６天，间质出现灶太增生，间质细胞梭化，数量增多，阻断后１２天，炎症反应减轻，部分间质细胞核固缩，深染。阻断后２４天，炎症反应消失，间质细胞数量减少，阻断后４８天，间质改变仍未见恢复。     

Fas/FasL系统在邻苯二甲酸二丁酯睾丸毒性机制中的作用

目的 探讨细胞凋亡Fas／FasL系统在邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的雄性生殖毒性机制中的作用。方法 在大鼠多代繁殖实验的基础上，运用免疫组织化学染色的方法，通过对睾丸组织损伤的观察和细胞凋亡相关蛋白（Fas／FasL）的检测和分析，探讨不同剂量DBP对成年F;代大鼠（PND70天）睾丸损害的情况及可能的作用机制。结果 与对照组相比较，随着DBP染毒剂量的增高，PND70天F1代雄性大鼠睾丸曲细精管生精上皮退化变性，生精细胞脱落至曲细精管管腔面，甚至有部分曲细精管内的生精细胞耗竭；免疫组织化学染色结果表明，与对照组相比，中、高剂量组（每天250和500mg／kg）大鼠睾丸组织Fas／FasL染色范围扩大，着色细胞数量增多，且存在剂量-反应关系。结论 DBP对大鼠睾丸生精细胞损伤可能是由于DBP启动了睾丸支持细胞Fas／FasL系统，阻抑生精过程造成的，Fas／FasL系统在DBP的雄性生殖毒性中起一定作用。     

小鼠睾丸Ⅳ型胶原的合成与分布

目的研究小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布。方法应用生物素－抗生物素蛋白ＤＣＳ体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测幼年、成年及老年小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布的变化。结果小鼠睾丸支持细胞具有合成Ⅳ型胶原的功能,小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的含量及支持细胞内Ⅳ型胶原ｍＲＮＡ水平随小鼠年龄的增加而变化。１５天幼鼠睾丸内含量最高,成年及老年小鼠睾丸内含量依次减少。结论睾丸内的细胞外基质可能在生精过程中起重要作用。     

小白鼠脊髓发育分化的组织学及组织化学观察

本文采用组织学和组织化学的方法观察小白鼠脊髓胚胎至生后的发育,结果表明胚胎第12天,神经管已闭合,前角运动神经元已出现。第16天,前正中裂形成。至生后4周脊髓的形态和结构已基本接近成年。胚胎第12天,室管膜层细胞胞质内RNA丰富,AlP呈弱阳性反应。胚胎第16、18天脊髓灰质神经细胞内依次出现5~n—Nase和ATPase弱阳性反应。生后第1天,ACP反应出现阳性,以胶状质反应最强,以后随发育,上述酶或物质反应逐渐增强。     

实验性隐睾对大鼠睾丸波形蛋白表达的影响及其意义

①目的 探讨实验性隐睾对大鼠睾丸支持细胞波形蛋白表达的影响及其意义.②方法 将30只健康雄性SD大鼠随机分为隐睾组和假手术组,建立单侧隐睾模型.术后7天采用TUNEL法检测生精细胞凋亡,免疫组化检测波形蛋白表达的变化.③结果 与正常侧睾丸相比,隐睾侧睾丸重量明显减轻,生精小管内生精细胞排列紊乱,生精细胞与精子的数量减少,可见较多多核巨细胞;免疫组化显示波形蛋白在支持细胞、间质细胞胞质中均有表达,假手术组波形蛋白沿基膜形成棕色的环,并随支持细胞胞质呈辐射状伸向管腔,而隐睾组可见波形蛋白表达明显增加且波形蛋白丝排列紊乱.④结论 隐睾能导致睾丸内波形蛋白表达增高,影响支持细胞的功能,从而促进生精细胞凋亡.     

人发角蛋白人工肌腱(HHKAT)组织相容性的实验研究

目的：研究人发角蛋白人工肌腱(HHKAT)植入大白兔体内的组织相容性。方法：取18只新西兰大白兔在兔的右侧臀大肌埋入人发角蛋白人工肌腱(HHKAT)，左侧埋入正常人发(NHH)。术后2w，8w，12w比较兔两侧的局部反应及组织学变化。结果：植入人发角蛋白人工肌腱侧的局部反应、组织反应较正常人发侧弱：取10个高倍镜下炎症细胞(淋巴细胞、异物巨细胞、巨噬细胞)的平均数比较，有统计学意义。结论：人发角蛋白对机体制激性较小，是一种组织相容性良好的人工材料。     

染锰鼠28天与56天生精功能相关指标比较研究

目的研究染锰28d与56d小鼠生精功能相关指标的变化,探讨锰生殖毒性的时间-效应关系。方法将雄性小鼠随机分为2个染锰组（MnCl215、30mg/kg）和1个对照组。分别于染锰28、56d随机处死各组小鼠5只。测定睾丸脏器系数,计数精子,精子活动度,精子畸形率,采用免疫组化和图像分析法检测小鼠睾丸组织增殖细胞核抗原（proliferation cell nucleus antigen,PCNA）和热休克蛋白70（heat-shock protein70,HSP70）的表达。结果①染锰28d和56d,各染锰组精子数量和精子活动度均降低,但28d与56d比较无明显差异（P〉0.05）。②染锰28d和56d,各染锰组睾丸脏器系数均降低,精子畸形率均升高,且28d与56d比较有明显差异（P〈0.01,P〈0.05）。③染锰28天与56天比较,15mg/kg染锰组睾丸组织PCNA平均吸光度值有明显差异（P〈0.01）,15mg/kg组和30mg/kg组睾丸组织HSP70表达均有明显差异（P〈0.01）,28d达高峰,56d明显回落。结论①染锰15mg/kg 28d可造成小鼠睾丸生精功能损伤,但可能是可逆性损伤。②染锰15mg/kg 28d,小鼠睾丸PCNA表达增高,表明染锰15mg/kg 28d小鼠睾丸增殖能力强于56d,提示PCNA表达可作为评价雄性生殖功能的指标之一。③各染锰组睾丸组织HSP70表达于28d达高峰,提示可能是生精细胞的一种自我保护机制,56d明显下降,可能为生精细胞过应激反应后的抑制状态和生精细胞减少的双重结果。     

昆明胚鼠生殖腺发育的形态学观察

目的 研究及观察发育不同时期胚鼠生殖腺发育的形态变化。方法 取发育不同时期的胚鼠进行石蜡切片及H、E染色。结果 从胚胎切片标本中可观察到，交配后第11天出现生殖嵴，第12天出现未分化生殖腺，第13天可在胚胎标本切片上区分雌雄性，第14天雄性的生殖腺演变为睾丸，出现生精小管，为实心的小管。第16天出现睾丸间质细胞，支持细胞的细胞核明显可见。第16天雌性的生殖腺演变为卵巢．皮质及髓质两者分化明显。第20天睾丸内可见生精小管横断面数目明显增多。管腔内出现空腔，管内有一层精原细胞和一层精母细胞。卵巢内可见一团团粗大的生卵泡性索沿着卵巢周边分布，内含许多原始的卵原细胞，此时有原始的卵泡出现。结论 11～12d为分离原始生殖干细胞(PGCs)最佳时期。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

外源性褪黑激素对小鼠生精细胞凋亡的影响

目的 观察褪黑激素对生精细胞凋亡的影响。方法 HE染色、TUNEL测定(核快红复染)。结果 HE染色下睾丸间质细胞的面积随褪黑激素的增多而减小，与睾酮的浓度变化相一致。TUNEL阳性细胞随褪黑激素的增加有增多的趋势，但超过一定量后(100ug)，不再增多。20～30d的处理组呈现与30～40d的处理组不同的结果。结论 外源性褪黑激素具有促进生精细胞凋亡的作用。这种作用与其对睾酮的抑制作用不相一致。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

体外诱导细胞转化为胰岛细胞的研究进展

巢素蛋白（nestin）阳性细胞、成体干细胞（包括间充质干细胞和胰腺导管上皮细胞）和胚胎干细胞是常用的体外诱导转化为胰岛细胞的种子细胞,本文就这三类细胞的来源、实验方法及实验结果的研究进展进行综述。     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

人BMSCs移植小鼠睾丸后向Leydig细胞或产类固醇激素细胞诱导分化的实验研究

目的 研究人体骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）在体内条件下能否向Leydig细胞或产类固醇激素细胞定向诱导分化,及是否发生免疫排斥反应。方法 将分离培养获得的第3代BMSCs经核荧光标记物标记后,制备成细胞悬液,注射至经二甲磺基乙烷(EDS)处理后的20只BALB/c小鼠睾丸内。从移植BMSCs前1 d开始,每隔2 d处死1只小鼠,测尾静脉游离睾酮浓度,对照组为同期未作任何处理BALB/c小鼠20只。同时睾丸组织经荧光显微镜摄片,追踪观察BMSCs,行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)单克隆抗体和鼠抗人细胞核单克隆抗体双重免疫荧光检测,寻找3β-HSD和鼠抗人细胞核单克隆抗体荧光染色均阳性的细胞。结果 EDS对小鼠Leydig细胞有一定杀伤作用;采用睾丸网注射法行人BMSCs移植小鼠睾丸获得了成功,未见免疫排斥反应;移植BMSCs后的睾丸组织未检测到3β-HSD和鼠抗人细胞核单克隆抗体免疫荧光染色均阳性的细胞。结论 采用人BMSCs移植小鼠睾丸的方法获得成功,未见免疫排斥反应,移植后的BMSCs未向Leydig细胞或产类固醇细胞定向分化。     

体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其一般的生物学特性.方法通过密度梯度离心法分离MSCs、体外培养传代细胞计数、流式细胞仪检测细胞增殖周期、表面分子测定以及细胞化学染色了解人MSCs一般的特点.结果人MSCs经过体外培养均一地表达CD29、CD44、CD166,而CD34、CD45阴性.细胞化学结果显示,细胞糖原(PAS)强阳性,脂肪(SB)为阴性,5%～10%细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性.细胞周期分析表明:G0/G1、S和G2/M所占比例分别为83.11%、5.17%和11.72%.分离细胞在成骨诱导体系下进一步向成骨细胞分化.结论密度梯度离心法能够分离纯化MSCs有其特殊的生物学特点,能够向成骨细胞分化.     

人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能影响的实验研究

目的探讨人骨髓间质干细胞对树突状细胞成熟和功能的影响以及人骨髓间质干细胞发挥免疫抑制作用的可能机制。方法以Friedenstein法分离培养骨髓间质干细胞,以密度梯度离心法分离培养外周血单个核细胞,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素-4的培养条件下制备树突状细胞。在LPS(1ng/mL)诱导下获得成熟树突状细胞。将骨髓间质干细胞与成熟树突状细胞共培养48h后,混合淋巴细胞反应检测经骨髓间质干细胞处理前后树突状细胞对同种异体T细胞的增殖能力,流式细胞仪检测处理前后其表面共刺激分子CD86和成熟标记物抗原CD83的表达,ELISA法测定混合淋巴细胞反应上清中细胞因子的表达。结果与未成熟DCs组比较,成熟DCs组表面抗原CD86,CD83的表达均增加,对T淋巴细胞刺激能力增强,致炎细胞因子分泌(IL-12,IFN-γ)增多,而抑炎因子(IL-10)分泌减少,成熟DCs组经hMSCs处理后,表面抗原表达水平明显下降,致炎细胞因子分泌减少,而抑炎因子分泌增加,对T淋巴细胞刺激能力减弱,与未处理成熟组比较差异具有显著性,而与未成熟组比较差异无显著性。结论hMSCs能逆转成熟DCs为未成熟DCs状态,从能间接抑制DCs启动的T淋巴细胞增殖,抑制炎症因子的分泌,发挥免疫抑制作用。