不同试剂盒对乙脑病毒RNA提取效能的比较

目的比较常见的3种商售RNA提取试剂对乙脑病毒检测的相对效率、耗时和成本,为实验室应用及检测结果的评价提供依据。方法对乙脑病毒参考株悬液作10^-1～10^-4系列稀释,选用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、Sangon生物公司的RNA提取试剂盒和Invitrogen公司的Trizol试剂3种核酸提取方法提取上述样本RNA．用TaqMan实时荧光定量反转录聚合酶链反应对其提取效率进行评价,并比较3种试剂（盒）的耗费时间和价格。结果对不同稀释度乙脑病毒样本的检测,均以QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit检测的敏感度最高。以该试剂盒的提取效率为100％,则Invitrogen和Sangon生物公司RNA提取试剂（盒）的提取效率分别为77．4％～86．8％和64．2％～74．1％。3种试剂（盒）对cDNA起始模板量的估计也有明显的影响,差别达到1～3个数量级,以QIAGEN公司的试剂盒最敏感。3种试剂（盒）提取RNA耗时分别为60min、100min和70min,价格效率比分别为46元、23元和20元。结论RNA提取试剂可影响JEV荧光定量PCR检测的结果,各实验室应根据实验目的和实验室条件．合理选择病毒RNA提取试剂盒。     

从OCT包埋冰冻组织提取组织RNA和检测病毒RNA

目的探讨如何从OCT包埋冰冻组织提取组织RNA和检测病毒RNA。为临床有限标本的保存和利用提供一简便的方法。方法用汉坦病毒感染的小鼠组织标本，经质量浓度25％蔗糖磷酸缓冲液固定OCT包埋，在-20℃冰箱中保存2年后，对冰冻的OCT包埋的感染组织标本进行RNA提取，用凝胶电泳、紫外分光光度计及RT—PCR等方法检测组织总RNA和病毒RNA。结果组织经质量浓度25％蔗糖磷酸缓冲液固定OCT包埋冰冻保存后，从中提取的RNA仍保持较好的完整性，可扩增出较长片段的病毒RNA。结论OCT包埋的冰冻组织标本不影响提取组织RNA并检测病毒RNA。     

新鲜组织RNA的快速提取及逆转录保存

逆转录PCR（RT－PCR）反应被广泛地运用于检测RNA病毒、基因表达及原癌基因的激活（如HCV，HIV感染，mdr表达，PTC，PML／RARR移位融合表达）等。但在实际工作中，RNA的提取和保存一直是阻碍RT－PCR应用的原因，尤其是常规手术标本或活检组织。尽管有许多方法涉及RNA提取的简化，但长期的保存仍有困难。最近，我们尝试了一种快速地从新鲜标本获取RNA并长期保存为RT－PCR提供模板的方法。其特点是：（）扩散法提取RNA，（）随机引物逆转录合成。DNA，－ZOC保存。我们用此法检测了多个细胞基因的表达，效果良好。一、材…     

TRIzol（或TriPure）试剂结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒用于血标本中病毒RNA提取的研究

目的 建立一种安全、简便、可靠的适用于血标本中有包膜RNA病毒核酸提取的方法,保证埃博拉病毒核酸筛查的实验室安全,提高标本的核酸检测效率.方法 根据已发表可完全灭活埃博拉病毒的方法,通过实时荧光逆转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）方法,比较分析QIAamp Viral RNA Mini试剂盒、TRIzol（或TriPure）试剂裂解样本并用或不用氯仿萃取后结合QIAamp Viral RNA Mini试剂盒等3种方法提取核酸的效率,优化反应步骤,建立一种安全、简便的血标本中病毒RNA提取方法.结果 血标本经TRIzol（或TriPure）试剂处理后,不经氯仿萃取,与QIAamp Viral RNA Mini试剂盒结合,提取病毒RNA,RNA提取效率优于QIAamp Viral RNA Mini试剂盒和美国CDC推荐的方法.结论 采用TRIzol（或TriPure）试剂裂解病毒,结合QIAamp Viral RNAMini试剂盒提取病毒RNA的方法简便、可靠,可用于埃博拉出血热相关标本的核酸检测.     

快速法提取人淋巴细胞总RNA

以快速法—硫氰酸胍-酚-氯仿/异戊醇法提取人淋巴细胞总RNA,并与经典的CsC1超速离心法作了比较。结果表明.快速法所提RNA没有降解.提取量也和CsC1超速离心法作了基本一致,但明显具有快速、简便、不需超离和可同时进行大量标本等优点。     

四种腺病毒核酸提取方法的比较

目的通过蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA／RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种腺病毒核酸提取方法的比较。为进一步研究腺病毒的分子生物学特性选择合适的方法提供参考。方法以腺病毒感染的A549细胞为样品．分别以蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA／RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸．核酸经紫外分光光度计检测A260／A280的比值后,用荧光定量PCR方法检测核酸中腺病毒拷贝数浓度。并记录四种腺病毒核酸提取方法所需的操作时间。结果蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA／RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸的A260／A280的比值依次为1．85532、1．7377、1．81474和1．43934,核酸中腺病毒拷贝数浓度依次为4．9×10^5copies／mL、3．94×10^3copies／mL、2．66×10^6copies／mL和6．15×10^6copies／mL,提取核酸所需的时间分别为1．5、15、0．5和0．5h。结论四种腺病毒核酸提取方法中,蛋白酶K法简单快捷、成本低廉,适合一般实验室使用;苯酚法适合用于提取细胞培养上清中病毒的核酸;病毒DNA／RNA试剂盒的优点是操作时间短,得到的病毒核酸纯度较高;腺病毒荧光PCR检测试剂盒对病毒的核酸损耗少．操作步骤少．适用于临床标本的腺病毒核酸检测。     

大鼠心室肌RNA提取的最适取样量研究

目的探讨1mLTrizol试剂提取大鼠心室肌高质量RNA的最适取样量。方法分别用1 mL Trizol提取80,60,40,20 mg大鼠心室肌总RNA。结果心室肌取样量小于40 mg时,提取的RNA完整性和纯度可满足后续实验要求。     

一种从子宫内膜高质量提取总RNA的方法

总RNA的提取是分子生物学研究常用技术之一,本文简要介绍了TR Izol法改良后一种用于小鼠子宫内膜总RNA提取的方法,实验证明该方法重复性好、所获得的RNA纯度高、完整性好,表明该方法切实可行。     

人核迁移蛋白shRNA慢病毒载体的构建及转导

目的:通过绿色荧光蛋白(GFP)标记,构建可示踪的人核迁移蛋白(hNUDC)慢病毒RNA干扰载体,并实现其对靶细胞的转导。方法:通过分子克隆技术将人核迁移蛋白的发夹RNA(shNUDC-F)克隆至慢病毒表达载体中,构建成靶向针对hNUDC的RNA干扰载体,通过磷酸钙转染法,将获得的慢病毒高纯度质粒转染进低次代293T细胞中进行包装,通过高速离心收获慢病毒颗粒,经滴度测定后,对Dami巨核细胞进行转导实验。用显微镜观察转导效率,用Westernblot检测RNA干扰效果。结果:慢病毒携带的shNUDC-F片段对Dami巨核细胞能高效转导,并使其内源hNUDC基因发生基因沉默,干扰效果较好。结论:成功构建出慢病毒hNDUC RNA干扰载体,并在293T细胞中实现包装并成功转入Dami细胞。     

长期冻存和新鲜胃癌组织总RNA提取方法的比较

背景：目前两种最可靠、应用最广的高通量RNA分离技术是基于异硫氰酸胍-酚︰氯仿的RNA分离技术和基于硅胶柱的RNA分离技术。在临床应用非常有限的组织材料时,有必要对RNA分离技术的可重复性和可靠性分别进行先期评价。 目的：系统比较采用硅胶柱法和Trizol法从冻存、新鲜胃癌组织中分离总RNA的效果。 方法：硅胶柱法和Trizol法分别提取长期-80 ℃冻存的(2年以上)和新鲜胃癌组织总RNA,紫外分光光度法比较RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳分析28 S和18 S吸光度比值,进一步通过实时反转录-聚合酶链反应对扩增距mRNA polyA尾端不同大小片段的Ct值进行比较,间接判断不同大小mRNA的拷贝数及完整性。 结果与结论：硅胶柱技术和Trizol方法在总RNA提取的纯度方面都表现很好。然而在RNA完整性方面,基于硅胶柱技术的提取方法要好于Trizol法,因为其核糖体RNA形式完好而且更好地保持了不仅短的及中等大小片段,对于较大的mRNA片段也保持更好。另外,与新鲜组织相比,长时间冻存对胃癌组织总RNA提取的影响很小。     

T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定

目的 建立T7RNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统.方法 利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的 基因,构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原.结果 酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原.结论 此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究.     

siRNA给药途径的研究进展

RNA干扰（RNAi）通过在生物体细胞内导入外源性或内源性的双链RNA,使同源性mRNA降解、抑制特定基因表达而治疗某些基因异常所致的疾病,近年来已成为研究热点之一。文章就小分子干扰RNA（siRNA）的病毒载体给药、非病毒载体给药途径及优缺点做一综述。     

T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定

目的 建立T7RNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统.方法 利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的 基因,构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原.结果 酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原.结论 此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究.     

中药心康口服液抗柯萨奇B3病毒RNA复制作用的研究

目的研究探讨中药心康口服液对感染心肌中柯萨奇B3病毒RNA复制的影响。方法小鼠感染柯萨奇病毒B3(CVB3)诱发急性病毒性心肌炎,于急性期治疗后提取鼠心肌总RNA,用逆转录-聚合酶链反应技术检测心肌CVB3RNA含量,经琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下观察。结果中药心康口服液能明显降低心肌CVB3-RNA的含量,与病毒对照组比较差异有统计学意义,P<0.01;感染期不同阶段心肌病毒RNA含量的检测显示,心康口服液2个治疗组的病毒含量的检出,并没有随着用药时间的延长而显著降低。结论中药心康口服液能有效地影响心肌CVB3RNA的复制,其对病毒的作用是抑制复制而非杀灭。     

RNA沉寂及其抗病毒效应研究进展

RNA沉寂 (RNAsilencing)是一种新发现的、在RNA水平发挥作用的基因调控机制 ,以序列特异性方式降解病毒、转基因的RNA或内源性mRNA ,发生于真核生物 ,包括在植物细胞中描述的转录后基因沉寂、真菌中的压制现象和动物细胞中的RNA干扰。RNA沉寂发挥作用的一般机制是由dsRNA启动 ,经Dicer酶处理成2 1～ 2 5nt的小片段siRNA ,作为向导序列与核糖核酸酶构成RNA诱导的沉寂复合体 ,降解与dsRNA同源的RNA序列 ,防御外来核酸序列的入侵和调节细胞内基因的表达。作为一种古老的病毒防御机制 ,可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主细胞基因 ,在病毒感染的不同时期抑制病毒的复制。RNA沉寂的应用非常广泛 ,在某种意义上 ,RNA沉寂将会产生一场新的生物学革命。     

我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性研究

目的 研究我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性，为构建登革病毒的感染性克隆、深入阐明病毒的致病机理奠定基础。方法 以我国登革2、3、4型病毒基因组全长cDNA为模板，用SP6 RNA聚合酶系统制备体外RNA转录体，经电穿孔转染细胞，观察其致细胞病变效应。从病变细胞培养上清中提取总RNA，用病毒特异引物进行RT-PCR扩增，以证实细胞病变为转录体RNA的恢复病毒所致。结果 我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体均可使细胞产生病变，从细胞培养上清中可扩增出登革病毒特异的片段。结论 构建的我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体具有感染性．可在蚊传代细胞内恢复为登革病毒颗粒。     

病毒RNA干扰抑制因子研究进展

RNA干扰是真核生物体内普遍存在的一种高度保守的基因转录后水平的调控方式,它通过核酸序列特异性作用来抑制靶基因的表达.生物细胞利用RNA干扰机制来防御病毒的侵染,而许多病毒也能够产生RNA干扰抑制因子来对抗这种防御反应,这些抑制因子对宿主细胞有多种效应,往往同时是病毒重要的致病因子.迄今已从动植物病毒中鉴定出了多种RNA干扰抑制因子,抑制因子的鉴定和作用机理研究已成为病毒与宿主相互关系研究中的一个热点.本文对RNA干扰在动植物抗病毒中的作用、病毒RNA干扰抑制因子的发现、作用机理、鉴定方法以及研究意义等方面的最新进展进行了综述.     

定量竞争核糖核酸（RNA）多聚酶反应法检测丙型肝炎病毒RNA水平：高滴度病毒血症与疾病进展期相关

目前认为丙型肝炎病毒(HC)感染是慢性肝炎肝硬化及终末期肝病的主要原因.此外,新近认为HCV至少与两种肝外综合征有关,包括原发性混合性冷沉淀球蛋白血症和膜增生性肾小球肾炎.有症状或无症状的HCV感染者的血浆或血清中,用RNA多聚酶链反应法(RNA—PCR)检测HCV—RNA基因组是HCV感染的最敏感标志物.在用干扰素治疗慢性丙型肝炎时,病毒RNA阴转与临床反应有很好的相关.而病毒RNA再阳预示复发.精确检测病毒血症患者的HCV—RNA水平能增进我们对HCV感染、传播和发病机理的了解,亦有助于对慢性丙型肝炎患者进行临床分期和治疗.因此,建立了一种定量竟争(QC)RNA—PCR检测法来检测临床样本中的HCV—RNA实际水平.该方法在RNA提取,cDNA合成和PCR扩增过程中的一个合成的HCV—RNA分子作为内对照物.由于HCV分溶物的HCV—RNA 5’端核苷酸高度保守,故选该区做为靶序列.PCR对该编码区要比HCV基因组的其他区更加灵敏,而且与5’端编码区相对稳定,易于处理和贮存,可能与该区有丰富的二级结构有关.应用定量竞争PCR检测法.检测了121例病毒血症患者的HCV—RNA水平,包括无症状的供血员,慢性肝炎病人及将行肝移植的晚期肝病病人.     

靶向UL5小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒的抑制

背景：解旋酶-引发酶复合体是Ⅱ型单纯疱疹病毒进行复制的必需基因,UL5基因为Ⅱ型单纯疱疹病毒解旋酶-引发酶复合体的组成单位之一。 目的：应用RNA干扰技术分析特异性小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因的干扰作用。 方法：以Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因为靶目标,设计、合成5对特异性小干扰RNA。通过LipofeCtamine 2000脂质体将特异性小干扰RNA转染HEK293细胞。48 h后行荧光定量RT-PCR检测UL5基因转录水平,终点滴定法测定干扰后病毒滴度,观察其干扰效果。 结果与结论：小干扰RNA成功转染入细胞内。荧光定量RT-PCR结果显示,siRNA 722、siRNA 2 394、siRNA 2 513和siRNA 2 627均可不同程度降低靶mRNA表达,病毒滴度检测结果显示siRNA 722、siRNA 2 394、siRNA 2 513和siRNA 2 627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度,阴性对照组和siRNA 374对病毒感染滴度无影响。针对UL5基因的有效小干扰RNA可以特异性降低Ⅱ型单纯疱疹病毒的复制水平。     

沉默附睾P34H基因对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶活性的影响

目的:通过慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)敲低P34H表达,分析其对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶(HYD)活性的影响。方法:构建3种附睾精子P34H shRNA慢病毒表达载体GV-P34H-sh RNA-1、GVP34H-sh RNA-2和GV-P34H-sh RNA-3,提取阳性克隆质粒测序,转染HEK293T细胞,生产慢病毒颗粒。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别注入小鼠附睾中,用real-time PCR和Western blot法分别检测其对P34H m RNA和蛋白的沉默效果。采用免疫荧光法观察P34H蛋白在小鼠精子上的定位,改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测小鼠精子HYD活性(HYD阳性反应率和HYD活性强度)。结果:测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功。感染小鼠附睾后,P34H的mRNA及蛋白表达量均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P0.05);其中以GV-P34H-sh RNA-1作用最为显著,精子P34H阳性表达率和HYD活性均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P0.05),而阴性感染组和正常对照组相比差异无统计学显著性。结论:附睾P34H基因沉默可抑制小鼠附睾中精子P34H阳性表达率和HYD活性。