两种氨基修饰的基因芯片表面制备方法比较

目的探讨两种氨基化方法修饰玻片表面的过程及其在基因芯片制备中应用的可行性。方法玻片经清洗、硅烷化后，一种用多组分多氨化合物包被，经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化；另一种方法采用的包被剂是丙烯酸-丙烯酰胺单体，活化剂是碳二业胺／N-羟基琥珀亚胺酯官能团分子。将被修饰好的玻片用于λ噬菌体基闲组DNA芯片的制备，并进行杂交检测分析结果经两种方法修饰后玻片表面分别形成分支结构和聚合物涂层，与商业化的芯片比较发现，两种芯片杂交、扫描检测后显示所得点阵的杂交信号均匀、稳定、清晰，杂交点饱满、同一性好。结论两种方法修饰的玻片用于制备基因芯片均取得了成功，其中丙烯酸-丙烯酰胺聚合物包被法处理过程简单、成本低廉、能大规模生产，是一种较理想的芯片表面制备方法。     

Poly-L-Lysine玻片在寡核苷酸芯片制备中的改进

目的为了制得适合固定未修饰寡核苷酸的芯片,提高检测灵敏性,对Patrick Brown 实验室的多聚左旋赖氨酸包被玻片的方法进行改进。方法玻片经清洗后用缩水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷进行硅烷化,然后应用Poly-L-Lysine在玻片表面形成聚合物涂层,经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化后可使寡核苷酸共价连接在芯片表面。设计了各种实验考察方法改进前后芯片表面的性能,并将改进后的玻片初步应用于SARS冠状病毒寡核苷酸芯片检测中。结果方法改进后芯片表面性能优良:固定效率高、点的同一性好、杂交效率和热稳定性好、寡核苷酸结合牢固、芯片可以重复利用。结论利用共价连接,方法改进后的芯片表面适合固定未修饰的寡核苷酸,解决了寡核苷酸与玻片之间物理结合不稳定、易剥离的缺陷,提高了芯片检测的灵敏性。     

Poly-L-Lysine玻片在寡核苷酸芯片制备中的改进

目的 为了制得适合固定未修饰寡核苷酸的芯片，提高检测灵敏性，对Patrick Brown实验室的多聚左旋赖氨酸包被玻片的方法进行改进。方法 玻片经清洗后用缩水甘油-丙氧基三甲氧基硅烷进行硅烷化，然后应用Poly-L-Lysine在玻片表面形成聚合物涂层，经次亚苯基二异硫氰酸盐表面活化后可使寡核苷酸共价连接在芯片表面。设计了各种实验考察方法改进前后芯片表面的性能，并将改进后的玻片初步应用于SARS冠状病毒寡核苷酸芯片检测中。结果 方法改进后芯片表面性能优良：固定效率高、点的同一性好、杂交效率和热稳定性好、寡核苷酸结合牢固、芯片可以重复利用。结论 利用共价连接，方法改进后的芯片表面适合固定未修饰的寡核苷酸，解决了寡核苷酸与玻片之间物理结合不稳定、易剥离的缺陷，提高了芯片检测的灵敏性。     

60 mer长寡核苷酸微阵列构建的优化

目的　优化长寡核苷酸芯片方阵的构建。方法　采用4种不同玻片表面,4种点样液溶解经设计高度特异性探针,制备长寡核苷酸芯片。样品经RD -梯度PCR扩增标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果　点样液3×SSC与丙烯酰胺聚合物表面(国产玻片)联合使用杂交效果最佳。结论　该研究优化了长寡核苷酸芯片微阵列的构建,为芯片的下游技术发展提供支持。     

人胎盘基因表达谱芯片的初步研究

目的 制备人胎盘基因表达谱芯片,前用于基因差异表达分析。方法用基因芯片点样仪将胎盘基因文库探针打印在氨基包被的玻片上制备表达谱芯片。分别提取对照组三氧化二砷处理的K562细胞总RNA,纯化mRNA后反转录成cDNA。再以限制性显示技术进行荧光标记,将两组荧光标记的样品混合后与芯片进行杂交。杂交后清洗芯片,干燥后对芯片进行扫描,分析杂交结果。结果 建立了较可靠的制备与检测基基表达芯片的方法,并筛选出45个差异表达基因片段。结论 制备的人胎盘基因表达谱芯片可有效地应用于基因的差异表达分析。     

用于HIV诊断的Oligo基因芯片研制

目的 研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片。方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(T_m)的Oligo 探针,并制备成Oligo芯片。B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果 与结论 获得22条60mer 探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件。     

限制性显示技术作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法的初步研究

目的 初步研究限制性显示技术(RD-PCR)作为一种高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法对芯片杂交信号的影响。方法 收集3个健康人外周血单核细胞,提取RNA后分为两组,采用RD-PCR进行样本双色(Cy3/Cy5)荧光标记,与3张Agilent60mer高密度(22K)人1B寡核苷酸芯片进行杂交。排除阴性和阳性对照信号值、Cy3和(或)Cy5的前景与背景间无统计显著性差异点的信号值,进一步排除两种荧光标记间存在统计显著性差异点的信号值,将3张芯片的共同信号值用于分析。SPSS软件进行常规统计分析和作图,R语言环境下的VSN统计包排除芯片间和两种不同荧光标记间的系统误差。结果 3张芯片的8744个共同点用于本研究。芯片间及两种荧光标记间存在明显的可校正的系统误差。芯片间杂交信号值相关显著。RD-PCR样本标记方法对较低表达基因信号值较为敏感。结论 初步的统计分析结果表明,RD-PCR是一种潜在的有用的高密度长链寡核苷酸芯片样本标记方法。     

人胎盘基因表达谱芯片的初步研究

目的：制备人胎盘基因表达谱芯片，并用于基因差异表达分析。方法：用基因芯片点样仪将胎盘基因文库探讨打印在氨基包被的玻片上制备表达谱芯片。分别提取对照组与三氧化二砷处理的K562细胞总RNA，纯化mRNA后反转录成cDNA，再以限制性显示技术进行荧光标记，将两组荧光标记的样品混合后与芯片进行杂交，杂交后清洗芯片，干燥后对芯片进行扫描，分析杂交结果。结果：建立了较可靠的制备与检测基因表达谱芯片的方法，并筛选出45个差异表达基因片段，结论：制备的人胎盘基因表达谱芯片可有效地应用于基因的差异表达分析。     

蛋白质芯片制作条件的优化

目的 探讨以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片的条件。方法 蛋白质用含40%甘油的PBS稀释后点加在醛基化玻片上,室温干燥1 h,4℃冰箱保存,经封闭剂封闭,PBS漂洗后,依次加入抗体,反应结果用扫描仪进行扫读。结果 以醛基化玻片为固相载体时预点10~15个点后点样均一性较好;点样后4℃冰箱保存24~48 h再进行漂洗和封闭处理,所得结果的荧光测量值较高;3% BSA为封闭剂时所得图像的荧光背景值最低;点样量影响荧光信号的强度。结论 以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片时要预点15~20个点后再正式点样,点样后应4℃保存24~48 h再进行漂洗和3% BSA封闭处理。     

结核杆菌检测基因芯片的制备研究

目的　建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术。方法　制备和标记靶基因 ,用点样仪将靶基因点于玻片介质上 ,并经点样后处理制成基因芯片 ,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化 ,计算 DNA固定率 ,同时测定和比较两种不同玻片、不同点样液和三种不同点样后处理方法的 DNA固定率。结果　制备结核杆菌检测基因芯片 ,用醛基修饰玻片作为介质 ,用 DMSO溶液作为点样液 ,点样后芯片处理以水合 1小时再干燥 30分钟为佳。结论　本研究所建立的结核杆菌检测基因芯片制备技术具有较高的效率和可靠的实用性能     

卡托普利对糖尿病性心肌病大鼠心肌组织能量代谢和炎症反应的影响

目的 探讨卡托普利保护心肌组织的作用机制。方法 (1)将糖尿病性心肌病大鼠分为对照组和治疗组,治疗组每天给予卡托普利1.5 mg/kg·b.w.,口服15 w;(2)从动物心肌组织中抽提mRNA,经逆转录分别用Cy3、Cy5荧光标记,获得两组动物来源的cDNA探针;(3)cDNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果 (1)脂肪酸b氧化相关基因、线粒体电子质子偶联和氧化磷酸化相关基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)依赖的白三烯B4羟基脱氢酶基因在治疗组中表达明显上调。(2)二甲基精氨酸水解酶基因在干预治疗组中表达明显下调。结论 卡托普利可能通过改善病变心肌的能量供应、抑制炎症反应对糖尿病性心肌病心肌组织起保护作用。     

基因芯片的制备研究

目的：建立基因芯片的制备技术。方法：基因样本准备,将带荧光标记的ＰＣＲ产物用点样仪点于玻片介质上,并经过点样后处理制备成基因芯片,用扫描仪测定前后芯片上荧光强度的变化,计算ＤＮＡ固定率,分别设计了５种玻片３种固定条件和６种点样后处理方法的固定率测定。结果：对芯片制备的各种条件和方法优化实验表明,ｃＤＮＡ的氨基修复,点样后的ＵＶ交联和芯片室温干燥处理能有效提高ＤＮＡ的固定率。结论：本研究建立的基因芯     

Research on preparation of mycobacterium tuberculosis DNA microarray]

OBJECTIVE: To optimize and develop the technique for mycobacterium tuberculosis DNA microarray. METHODS: The process included preparation of DNA samples, spotting and past-spotting treatment of arrays. DNA microarrays were prepared by spotting fluorescence labeled PCR products of target genes onto specially treated glass slides with robotics. The fluorescent signals before and after treatment were scanned with a scanner, and the DNA attachment rate was calculated from the obtained data by software. RESULTS: A foundation for optimizing the conditions of Mycobacterium tuberculosis DNA microarrays has been laid. The support aldehyde-modified glass slide is useful for anchoring DNA at Some distance. DMSO as spotting solution is of benefit to preparation of Mycobacterium tuberculosis DNA microarray. Drying the chip at 37 degrees C temperature after spotting can enhance the DNA combination rate. CONCLUSION: Several key steps of this technique have been optimized. This study has provided a foundation for optimizing the DNA attachment conditions in creating mycobacterium tuberculosis DNA microarray.     

戊型肝炎病毒诊断基因芯片制备的初步研究

目的制备戊型肝炎病毒诊断基因芯片并进行杂交验证。方法利用Oligo6.0软件针对戊型肝炎病毒诊断基因保守区域设计多对寡核苷酸探针,用芯片点样仪将其按照阵列设计打印在玻片上制备成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术,样品标记后进行杂交,进而在芯片扫描仪中对得到的探针数据进行分析并实验验证。结果芯片杂交后得到的探针荧光强度好,信噪比高,符合临床样品的基因亚型,RT-PCR验证后得到的电泳结果与芯片实验一致。结论实验设计并制备的寡核苷酸戊型肝炎病毒诊断芯片能用于戊肝的检测,为这项疾病的实验室诊断提供了一种快速平行的检测方法。     

利用荧光标记的通用引物检测基因芯片的制备质量

【目的】报告一种新的基因芯片质量控制方法。【方法】采用限制性显示技术制备一种两端具有1段特异通用引物互补序列的探针,分别以不同浓度梯度的荧光标记通用引物（Cy3-UP）和随机引物（Cy3-RP）与芯片杂交,比较两者杂交效率。【结果】Cy3-UP的杂交结果显著优于Cy3-RP的杂交结果,在较低浓度就可显示较强的荧光信号。【结论】这种新的基因芯片质量控制方法具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片的质量控制。     

湖北省2020—2021年疟疾诊断参比实验室血片镜检质量分析

目的 了解湖北省发热病人疟原虫血涂片制作质量和实验室人员疟原虫镜检能力水平,为消除疟疾后的有效监测提供技术保障。方法 对2020—2021年湖北省网络报告和疑似疟疾病例血片和随机抽取的各市州发热病人阴性血片进行镜检复核,对血片制作、染色、清洁度、镜检结果及虫种判定情况进行分析评价。结果 2020—2021年共复核疟原虫血片1 661张,制片、染色、清洁度总合格率分别为88.50%（1 470/1 661）、80.01%（1 329/1 661）、84.71%（1 407/1 661）。复核阳性病例63例,血片156张,阳性血片制片、染色、清洁度合格率分别是78.21%、76.92%、82.69%,阳性符合率为77.78%,虫种符合率为87.76%。恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的虫种符合率分别为94.74%、90.00%、80.00%和80.00%。复核阴性血片1 505张,阴性血片制作、染色、清洁度合格率分别为89.57%、80.33%、84.92%,复核一致率为100%,未发现漏检。阴阳性血片制作合格率差异有统计学意义（χ²=17.933,P<0.05）,染色和清洁度合格率差异无统计学意义。血涂片质量主要存在的问题有沉渣较多、溶血不全、血膜制作不规范、染色深浅和厚血膜脱落。不同地区阴性血片质量差异有统计学意义（χ²_制作=73.109、χ²_染色=130.637、χ²_清洁度=68.806,P均<0.05）,且城市医院血片制作、染色和清洁度均优于乡镇卫生院（χ²_制作= 21.551、χ²_染色=13.561、χ²_清洁度=12.523,P均<0.05）。结论 湖北省各市州血涂片质量整体较好,阳性血片质量及疟原虫定性诊断能力有待进一步提高。